人大隐静脉培养过程中血管紧张素转换酶mRNA的变化
王玉琦 代望德 符伟国
摘 要 目的 研究人大隐静脉器官培养过程中血管紧张素转换酶(ACE)mRNA表达的变化。方法 用内参照逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)研究大隐静脉器官培养14 d后ACE mRNA的表达。结果 对照组静脉内膜厚度为(3.5±2.0) μm，ACE mRNA水平为0.347±0.158；培养14 d后内膜厚度为(47.0±9.3) μm，ACE mRNA水平0.777±0.143，两组差异有显著性。结论 人大隐静脉器官培养过程中ACE mRNA显著增高。
关键词：人大隐静脉 器官培养 内膜增生 血管紧张素转换酶
1988年Dzau[1]描述血管局部存在肾素-血管紧张素系统(RAS)以来，RAS与血管内膜增生的关系受到关注。本研究旨在探讨大隐静脉器官培养过程中血管紧张素转换酶(ACE)mRNA表达量的变化，从而了解内膜增生与血管局部RAS是否存在关系。
, 百拇医药
材料和方法
1.实验取材：取静脉曲张手术病人的大隐静脉进入股静脉处外观正常的一段静脉，长3 cm，立即放入组织转送液(RPMI 1640+20 mmol/L HEPES+4.1×104 IU/L肝素+5 mg/L二性霉素B)中待测，共30例。
2.实验培养及分组：按本室改良的Soyombo等[2]模型培养：40目不锈钢剪成15 mm×20 mm长方形，长边两端各弯4 mm成直角，置直径30 mm培养皿中，用擦镜纸覆盖。取下的静脉在冷的组织清洗液中切除外膜后分成长5 mm节段并纵向剪开。一段在常温下用0.2%台盼蓝染30 s，快速评估内皮细胞的覆盖情况和活力，染色面积超过50%的不用。另一段做快速切片检查，有内膜增生的亦不用。合格的静脉片立即放入上述汽-液相界面培养系统。在器官培养界面系统中加入培养液，液量以浸过擦镜纸为准。静脉内膜面朝下置擦镜纸上，在体积分数为5%CO2培养箱中37 ℃条件下培养14 d，2～3 d更换1次培养液。所有标本液氮保存备用。每个标本切成长5 mm的2段，一段作培养前对照，另一段在组织培养液中培养14 d，作为实验组。两组各30例。
, 百拇医药
3.组织学检查：2组标本均做冰冻切片检查，即HE染色和米氏弹力纤维染色后，用图像分析比较2组的内膜厚度以及平滑肌α-肌动蛋白(α-actin)单抗免疫组织化学染色鉴定内膜层细胞成分。
4.ACE表达的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测：(1)静脉组织总RNA抽提：液氮保存的静脉低温下匀浆，用异硫氰酸胍(promega)一步法提取。(2)逆转录聚合酶链反应参照分子克隆实验指南中的程序进行(冷泉港实验出版，1989)。(3)根据文献[3]设计人ACE的PCR特异性引物，扩增人ACE cDNA序列第2 960～3 175处共216 pb片段；用人β-肌动蛋白(β-actin)作内参照，用其引物扩增β-actin cDNA片段长690 bp。引物由上海生工生物工程公司提供。(4)PCR产物电泳分析：反应结束后，直接取PCR反应产物在含0.5 mg/L的溴化乙锭(EB)及2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外线灯下观察结果并拍照记录。凝胺成像分析系统扫描电泳条带照片，做定量分析。ACE mRNA量=ACE吸光度/β-actin吸光度。
, http://www.100md.com
5.统计学处理：SAS软件包，PC微机。
结 果
培养前内膜厚度为(3.5±2.0) μm，培养后膜厚度为(47.0±9.3) μm，t检验差异有非常显著性(P<0.001)。平滑肌α-actin的单抗免疫组织化学染色显示培养后静脉片内膜细胞成分标记为棕褐色，是平滑肌细胞。培养前ACE mRNA量为0.347±0.158，培养14 d后量为0.777±0.143，基因表达水平上升224%，t检验差异有非常显著性(P<0.001)。
讨 论
自体大隐静脉是心脏和外周血管重建术的首选材料。内膜增生是影响静脉移植物远期通畅率的主要因素。内膜增生的病理学基础是血管壁中层平滑肌细胞向内膜层的移行和增生，这一病变过程的发生机理还有待进一步探讨。本研究中的人大隐静脉器官培养内膜增生模型病理切片显示平滑肌细胞由中层向内膜层的移行和增生，与来源于人体移植材料的病理检查结果相同，因此可用作研究血管内膜增生的发生机理和防治方法的实验模型，所得实验资料较动物模型更接近人体的情况。
, 百拇医药
随着分子生物学技术的发展，已经证明血管局部可以产生RAS的各种物质，在血管局部独立发挥作用。这一系统中ACE主要来源于血管内皮细胞。肾素将血管紧张素原水解为10肽 AngI,ACE将AngI脱去羟基端的组氨酸和亮氨酸生成AngⅡ，AngⅡ通过与血管壁上相应受体结合起生物活性作用。ACE是AngⅡ生成的限速酶，ACE浓度和活性高低决定AngⅡ的产率。RAS主要通过AngⅡ作用于局部组织产生效应。血管内的AngⅡ来自内皮损伤后进入血管壁循环的AngⅡ和局部合成的AngⅡ。局部合成的AngⅡ作用可能较强，因为血管局部循环中AngⅡ浓度远低于其受体的kd值。AngⅡ的受体有主要存在于平滑肌细胞的AT1和主要存在于内皮细胞的AT2。AngⅡ主要通过AT1受体促进内膜增生。AngⅡ与受体结合后，能快速诱导c-myc、c-fos、c-jun等的表达。c-fos和c-jun的产物形成异二聚体，与靶基因的特殊DNA序列相结合并刺激其转录，而且c-fos和c-jun也参与DNA的复制。这些基因功能的变化与DNA复制的启动以及血管平滑肌细胞的增生有关。AngⅡ除通过与受体直接结合起作用外，还促使一些自分泌生长因子的合成和分泌，例如血小板生长因子(PDFG)、碱性纤维细胞生长因子(bFGF)等导致血管平滑肌细胞的增生和迁移。
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本实验结果显示，人大隐静脉器官培养14 d后内膜明显增厚。ACE mRNA水平表达也明显升高。静脉ACE水平变化与血管内膜增生的变化一致，提示两者之间存在联系。至于ACE mRNA水平的升高是不是引起内膜增生的因素之一，还需要通过ACE抑制剂和AngⅡ受体拮抗剂的阻断作用进一步证明。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670685)
作者单位：王玉琦(200032上海医科大学附属中山医院血管外科研究室)
代望德(200032上海医科大学附属中山医院血管外科研究室)
符伟国(200032上海医科大学附属中山医院血管外科研究室)
参考文献
[1]Dzau VJ. Evolving concepts of the renin-angiotensin system. Am J Hyperteas, 1988,1:334-336.
, http://www.100md.com
[2]Soyombo AA, Angelini GD, Bryan AJ, et al. Intimal proliferation in an organ culture of human saphenous vein. Am J Pathol, 1990,137:1 401-1 410.
[3]Aschoff JM, Lazarus D, Fanburg BL, et al. Relative quantification of angiotensinconverting enzyme in human smooth muscle cells, monocytes and lymphocytes by polymerase chain reaction. Anal Biochem, 1994,219:218-223., http://www.100md.com
摘 要 目的 研究人大隐静脉器官培养过程中血管紧张素转换酶(ACE)mRNA表达的变化。方法 用内参照逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)研究大隐静脉器官培养14 d后ACE mRNA的表达。结果 对照组静脉内膜厚度为(3.5±2.0) μm，ACE mRNA水平为0.347±0.158；培养14 d后内膜厚度为(47.0±9.3) μm，ACE mRNA水平0.777±0.143，两组差异有显著性。结论 人大隐静脉器官培养过程中ACE mRNA显著增高。
关键词：人大隐静脉 器官培养 内膜增生 血管紧张素转换酶
1988年Dzau[1]描述血管局部存在肾素-血管紧张素系统(RAS)以来，RAS与血管内膜增生的关系受到关注。本研究旨在探讨大隐静脉器官培养过程中血管紧张素转换酶(ACE)mRNA表达量的变化，从而了解内膜增生与血管局部RAS是否存在关系。
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材料和方法
1.实验取材：取静脉曲张手术病人的大隐静脉进入股静脉处外观正常的一段静脉，长3 cm，立即放入组织转送液(RPMI 1640+20 mmol/L HEPES+4.1×104 IU/L肝素+5 mg/L二性霉素B)中待测，共30例。
2.实验培养及分组：按本室改良的Soyombo等[2]模型培养：40目不锈钢剪成15 mm×20 mm长方形，长边两端各弯4 mm成直角，置直径30 mm培养皿中，用擦镜纸覆盖。取下的静脉在冷的组织清洗液中切除外膜后分成长5 mm节段并纵向剪开。一段在常温下用0.2%台盼蓝染30 s，快速评估内皮细胞的覆盖情况和活力，染色面积超过50%的不用。另一段做快速切片检查，有内膜增生的亦不用。合格的静脉片立即放入上述汽-液相界面培养系统。在器官培养界面系统中加入培养液，液量以浸过擦镜纸为准。静脉内膜面朝下置擦镜纸上，在体积分数为5%CO2培养箱中37 ℃条件下培养14 d，2～3 d更换1次培养液。所有标本液氮保存备用。每个标本切成长5 mm的2段，一段作培养前对照，另一段在组织培养液中培养14 d，作为实验组。两组各30例。
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3.组织学检查：2组标本均做冰冻切片检查，即HE染色和米氏弹力纤维染色后，用图像分析比较2组的内膜厚度以及平滑肌α-肌动蛋白(α-actin)单抗免疫组织化学染色鉴定内膜层细胞成分。
4.ACE表达的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测：(1)静脉组织总RNA抽提：液氮保存的静脉低温下匀浆，用异硫氰酸胍(promega)一步法提取。(2)逆转录聚合酶链反应参照分子克隆实验指南中的程序进行(冷泉港实验出版，1989)。(3)根据文献[3]设计人ACE的PCR特异性引物，扩增人ACE cDNA序列第2 960～3 175处共216 pb片段；用人β-肌动蛋白(β-actin)作内参照，用其引物扩增β-actin cDNA片段长690 bp。引物由上海生工生物工程公司提供。(4)PCR产物电泳分析：反应结束后，直接取PCR反应产物在含0.5 mg/L的溴化乙锭(EB)及2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外线灯下观察结果并拍照记录。凝胺成像分析系统扫描电泳条带照片，做定量分析。ACE mRNA量=ACE吸光度/β-actin吸光度。
, http://www.100md.com
5.统计学处理：SAS软件包，PC微机。
结 果
培养前内膜厚度为(3.5±2.0) μm，培养后膜厚度为(47.0±9.3) μm，t检验差异有非常显著性(P<0.001)。平滑肌α-actin的单抗免疫组织化学染色显示培养后静脉片内膜细胞成分标记为棕褐色，是平滑肌细胞。培养前ACE mRNA量为0.347±0.158，培养14 d后量为0.777±0.143，基因表达水平上升224%，t检验差异有非常显著性(P<0.001)。
讨 论
自体大隐静脉是心脏和外周血管重建术的首选材料。内膜增生是影响静脉移植物远期通畅率的主要因素。内膜增生的病理学基础是血管壁中层平滑肌细胞向内膜层的移行和增生，这一病变过程的发生机理还有待进一步探讨。本研究中的人大隐静脉器官培养内膜增生模型病理切片显示平滑肌细胞由中层向内膜层的移行和增生，与来源于人体移植材料的病理检查结果相同，因此可用作研究血管内膜增生的发生机理和防治方法的实验模型，所得实验资料较动物模型更接近人体的情况。
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随着分子生物学技术的发展，已经证明血管局部可以产生RAS的各种物质，在血管局部独立发挥作用。这一系统中ACE主要来源于血管内皮细胞。肾素将血管紧张素原水解为10肽 AngI,ACE将AngI脱去羟基端的组氨酸和亮氨酸生成AngⅡ，AngⅡ通过与血管壁上相应受体结合起生物活性作用。ACE是AngⅡ生成的限速酶，ACE浓度和活性高低决定AngⅡ的产率。RAS主要通过AngⅡ作用于局部组织产生效应。血管内的AngⅡ来自内皮损伤后进入血管壁循环的AngⅡ和局部合成的AngⅡ。局部合成的AngⅡ作用可能较强，因为血管局部循环中AngⅡ浓度远低于其受体的kd值。AngⅡ的受体有主要存在于平滑肌细胞的AT1和主要存在于内皮细胞的AT2。AngⅡ主要通过AT1受体促进内膜增生。AngⅡ与受体结合后，能快速诱导c-myc、c-fos、c-jun等的表达。c-fos和c-jun的产物形成异二聚体，与靶基因的特殊DNA序列相结合并刺激其转录，而且c-fos和c-jun也参与DNA的复制。这些基因功能的变化与DNA复制的启动以及血管平滑肌细胞的增生有关。AngⅡ除通过与受体直接结合起作用外，还促使一些自分泌生长因子的合成和分泌，例如血小板生长因子(PDFG)、碱性纤维细胞生长因子(bFGF)等导致血管平滑肌细胞的增生和迁移。
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本实验结果显示，人大隐静脉器官培养14 d后内膜明显增厚。ACE mRNA水平表达也明显升高。静脉ACE水平变化与血管内膜增生的变化一致，提示两者之间存在联系。至于ACE mRNA水平的升高是不是引起内膜增生的因素之一，还需要通过ACE抑制剂和AngⅡ受体拮抗剂的阻断作用进一步证明。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670685)
作者单位：王玉琦(200032上海医科大学附属中山医院血管外科研究室)
代望德(200032上海医科大学附属中山医院血管外科研究室)
符伟国(200032上海医科大学附属中山医院血管外科研究室)
参考文献
[1]Dzau VJ. Evolving concepts of the renin-angiotensin system. Am J Hyperteas, 1988,1:334-336.
, http://www.100md.com
[2]Soyombo AA, Angelini GD, Bryan AJ, et al. Intimal proliferation in an organ culture of human saphenous vein. Am J Pathol, 1990,137:1 401-1 410.
[3]Aschoff JM, Lazarus D, Fanburg BL, et al. Relative quantification of angiotensinconverting enzyme in human smooth muscle cells, monocytes and lymphocytes by polymerase chain reaction. Anal Biochem, 1994,219:218-223., http://www.100md.com