胰岛素受体基因17外显子点突变的测得
沈捷 丁国宪 陈家伟 庄旻 魏勇 王华 柴建华
摘要 目的：阐述胰岛素受体基因缺陷与胰岛素抵抗发生机制间的关系。方法：运用PCR-单链构型多态性技术，对9个黑棘皮病家系(计9例患者，23例他们的一级亲属)进行了该基因17外显子筛查工作，对其中带型异常者进行了DNA直接测序确认。结果：发现了3个既往未报道过的错义突变和5个沉默多态性(slient polymorphism)，即杂合子突变Val983→Met，纯合突变Gln1004→ Lys、纯合突变Gly1022→ Lys、Pro980 (CCA→CCC)、Leu1002 (CTG→CTT)、Gln1004 (CAA→CAG)、Gly1008 (GGC→GGT)、Glu1034 (GAG→GAA)。结论：上述突变可能是造成黑棘皮病患者胰岛素抵抗的主要原因。
, 百拇医药
关键词：受体，胰岛素 基因 突变 胰岛素抵抗
胰岛素抵抗常存在于胰岛素抵抗综合征患者中。非胰岛素依赖性糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、高脂血症的发生发展都与胰岛素抵抗密切相关，且发病机制上都有共同之处。已知胰岛素受体基因变异所致胰岛素抵抗是造成胰岛素抵抗的主要类型之一，因此，选择合适的研究对象，从分子生物学结构变异上去揭示基因变异对胰岛素生理效应产生的影响，阐明胰岛素抵抗的产生机制是必要的。黑棘皮病患者具有A型胰岛素抵抗综合征的基本特征，即对内生胰岛素产生抵抗。在病因学上显示此异常可为胰岛素受体单基因突变所致，这已为许多学者所证实[1-3]。但并非所有黑棘皮病患者都可测得胰岛素受体基因发生变异，且发生变异者胰岛素抵抗的严重性也不一致，故而，从家系水平研究黑棘皮患者胰岛素受体基因的缺陷很有必要。
资料与方法
一、 黑棘皮病的确认
, 百拇医药
9例黑棘皮病患者均为在我院门诊及住院治疗的患者，年龄在17～38岁之间，所有患者均有明显的高胰岛素血症(空腹胰岛素水平58.6～>160.0 mIU/L)，有3例女性患者B超确定有多囊卵巢，7例患者肥胖，符合黑棘皮病的一般特征[4]，并经病理学确认。正常对照54例(男32例，女22例)来源于本院医生及正常献血者。
二、PCR-单链构型多态性分析
1. DNA抽提：被检者血6ml肝素抗凝，酚/氯仿法抽提后沉淀提取白细胞基因组DNA，经纯度鉴定后，溶于TE，-20℃备用。
2.胰岛素受体基因外显子17扩增：根据Desbois等[5]法改良。 17外显子引物序列：上游引物: 5′ CCAAGGATGCTGTGTAGATAAG(10 654-10 671 bp); 下游引物: 5′ TCAGGAAAGCCAGCCCATGTC(10 946-10 966 bp); 扩增产物长度317 bp。
, 百拇医药
3.扩增条件：每反应总体积50 μl，其中含有25 mmol/L KCl，5 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)，0.75 mmol/L MgCl2, 100 mg/L明胶， dATP、dTTP、dGTP、dCTP各100 μmol, 上、下游引物各0.5 mmol, 0.5 μg基因组DNA(模板)。
4.反应程序：上述反应成分依次加入Eppendoff管后，先将样本94℃变性5 min，再加入2U DNA多聚酶(PE公司产品)，然后依次进入29个循环，即94℃ 1 min变性，58℃ 1 min复性，72℃ 1.5 min延伸，扩增产物经1.5%琼脂糖电泳后，与标准分子量序列对照鉴定后，放于4℃待进行单链构型多态性(SSCP)电泳分析。
5.单链构型多态性分析：为寻找基因变异点，每一被检样本均在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶下进行电泳，观察SSCP条带情况。电泳前将PCR产物95℃ 5 min热变性，然后经4℃、110V电泳，电泳12 h左右，待溴酚兰到达胶底部1h后，以银染显示条带，照像分析。对每个样本，均经2～3次电泳以保证实验的准确性。
, 百拇医药
6. DNA直接测序：所有经PCR-SSCP筛选分析、显示条带异常的黑棘皮病患者及其一级亲属均进行PCR产物直接测序分析，为保证测序结果准确性，每一样本均从二端各测一次，测序前先对PCR产物进行电泳纯化，测序用Dye Teminator Reaction Kit(PE公司产品)，在PE公司7130型自动测序仪上进行。
结果
经PCR-SSCP后将电泳带型与正常带型比较，共8个新的SSCP带型在黑棘皮病家系被检出，PCR直接测序证实，3个为错义突变，4个为沉默突变，1个为沉默多态性，所有错义突变及主要沉默多态性见表1，2。而在正常对照组仅一种新的与上述SSCP相同带型出现，即Gly1008。
鉴于我们发现的3个错义突变均未见文献报道过，故将突变者及家系间传递情况分别叙述如下：
表1 黑棘皮病患者外显子17突变
, 百拇医药
家系
编号
蛋白编码
DNA序列改变
突变
状态
家系1
Val983→Met
TGCTCTGTGTACGTG(野生型 )
杂合
TGCTCTATGTACGTG(突变型 )
家系1
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Gln1004→Lys
CTGGGGCAGGGCTCC(野生型)
纯合
CTGGGGAAGGGCTCC(突变型)
家系2
Gly1022→Lys
AAGGGTGAGGCAGAG(野生型)
纯合
AAGGGTAAGGCAGAG(突变型)
表2 检测到的沉默多态性情况
, 百拇医药
密码编号
多态性
检得次数
Pro980
CCA→CCC
1
Leu1002
CTG→CTT
1
Gln1004
CAA→CAG
1
, 百拇医药
Gly1008
GGC→GGT
2
Glu1034
GAG→GAA
1
患者标本在中间呈双带杂合(正常为单带纯合)，在双带前尚有一异常的条带
图1 患者与正常人SSCP电泳结果比较
(1)突变Val983 →Met、Gln1004→ Lys都发生于同一黑棘皮病患者。该患者17岁，独子，其空腹胰岛素82.5 mIU/L，餐后2h胰岛素>160 mIU/L，体重指数30.6 kg/m2，有轻度高血压(140/90 mm Hg, 1 mm Hg=0.133 kPa)，其父兼有糖尿病和肥胖(BMI 28.7 kg/m2)，母亲体检正常。患者SSCP电泳中检出1条与正常相异的区带(图1)。直接测序证实，在胰岛素受体基因蛋白编码区983位有缬氨酸变为甲硫胺酸(Val983→Met)的杂合突变(图2)。该突变在家系内传递情况见图3(a)。该患者在蛋白编码1004位还有一谷氨酰胺变为赖氨酸的纯合突变(图4)，该突变在其父测得为纯合，其母为杂合，家系间该突变传递情况见图3(b) 。
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图2 Val983→Met突变；2a为突变序列，2b为正常对照序列。由于在突变A处有一等高G峰，故为杂合突变
(a)Val983→Met杂合突变；(b)Gln1004→Lys突变；
(c)Gly1022→Lys突变
图3 突变在家系内的传递
, 百拇医药
图4 Gln1004→Lys突变；原序列应为GGGCAG，现变为GGGAAG，4a为突变序列，4b为正常对照序列，因4a中A为单峰，故为纯合突变
图5 Gly1022→Lys突变；5a为突变序列，5b为正常对照，因5a突变峰为单峰(A处)，故为纯合突变
表3 发生突变的黑棘皮病家系临床检查情况
家系
亲属
, http://www.100md.com
关系
年龄
(岁)
黑棘
皮病
多囊
卵巢
血压
(mm Hg)
体重
指数
(kg/m2)
胰岛素释放试验(mIU/L)
, 百拇医药
葡萄糖
耐量
试验
血脂测定(mmol/L)
0
min
30
min
60
min
120
min
180
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min
胆固醇
甘油
三酯
高密度
脂蛋白
1
父
43
无
无
108/78
28.7
, 百拇医药 14
26
30
32.5
17
糖尿病
5.20
2.10
0.41
1
母
43
无
无
, http://www.100md.com
128/92
24.0
8.3
23
17
12
7.9
正常
3.70
1.82
1.22
1
子
, 百拇医药
17
有
无
140/90
30.6
82.5
157.8
>160
>160
>160
正常
4.00
1.70
, http://www.100md.com
0.33
2
父
57
无
无
132/85
26.3
17.2
37
44
48
26
, 百拇医药 糖耐量低减
7.03
6.20
0.75
2
母
54
无
无
126/80
27.7
24
42
, 百拇医药 53
48
32
糖尿病
5.40
2.17
0.87
2
女
28
有
有
130/85
31.2
, 百拇医药
>160
>160
>160
>160
>160
正常
5.67
1.70
0.34
(2)发生于1022位的突变为密码由甘氨酸突变为赖氨酸，先证者为一20岁女性黑棘皮患者，不伴有糖尿病，有高血压、胰岛素抵抗、肥胖(BMI=28 kg/m2)，直接测序显示先证者为杂合子(图5)，家系分析显示，患者父亲有糖耐量异常，高脂血症及轻度胰岛素抵抗、肥胖，有该突变的杂合现象，其母有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病及高脂血症并伴该突变纯合现象，此突变在家系内的传递情况见图3(c)。
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(3)其他沉默多态性的检出分别来自这些黑棘皮病患者及其家系成员，因沉默多态性所造成的危害不如点突变大，限于文章篇幅，在此不一一赘述。
(4)检出突变两个家系的临床资料，见表3。
讨论
胰岛素受体基因定位于19号染色体短臂，为单基因编码[6]，该受体具有两个α-亚单位，两个β-亚单位，彼此间以二硫链相连，α-亚单位分布于胞外，而β-亚单位附着于胞膜上，由胞外延伸到胞内，当胰岛素与其受体α-亚单位结合后，位于β-亚单位内的酪氨酸特异性激酶被激活，随之β-亚单位上一些酪氨酸残基发生自动磷酸化。对既往发现的发生于胰岛素受体基因酪氨酸激酶活性区突变的患者资料的研究显示[1-4，7，8]，这些突变不仅可导致酪氨酸激酶本身活性下降，还造成联级瀑布样酶促激活过程下行步骤的一系列障碍。胰岛素受体基因17外显子位于酪氨酸激酶活性区，已知在胰岛素受体基因蛋白激酶活性区有9个绝对保守的氨基酸残基序列，这9个位点及与此相邻的一些同源性保守序列在酪氨酸激酶活性的发挥中起关键作用[9]，在17外显子中有3个这样的保守序列，即Tyr965、Tyr972和1003-1030的ATP结合区。已有研究显示，胰岛素受体基因970位突变引起该基因mRNA表达丰度的降低[8]，发生于该基因985位的突变与胰岛素抵抗和高血糖发生直接相关[10]。我们报道的983位甲硫氨酸替代了缬氨酸，该突变靠近972位Tyr，由上述证据可以推测，此突变影响到酪氨酸激酶的激活及酶促活化中心的形成，引起胰岛素抵抗。发生于1004位的赖氨酸代替了谷胺酰胺突变及发生于1022位的赖氨酸替代了甘氨酸突变，正处在一个富含甘氨酸的区域中，即我们所提及的1003-1030位之间的ATP结合点，而该区域在结构上对胰岛素受体自动磷酸化起到固定磷的作用[4]，它结构的缺陷可能直接影响到自动磷酸化[9]，即直接影响了编码基因Mg2+-ATP的γ-磷酸化过程，从而造成严重的胰岛素抵抗。从我们所掌握的临床资料也完全支持上述推断。在17外显子也检得了以下沉默突变：即Pro980、Leu1002、Gln1004、Glu1034和沉默多态性Gly1008，在上述沉默改变的性状检得者中并未发现很严重的胰岛素抵抗，这可能是由于这些性状并未改变编码氨基酸的种类，从而仅会影响到该基因的表达丰度，而不会造成更为严重的后果。我们的研究并未在所有存在重度胰岛素抵抗的病人中都测出该外显子突变，这可能是由于我们仅进行了17外显子的筛查工作，而全面筛查胰岛素受体基因外显子序列，才能确定是否其他编码区亦存在突变。更广泛、深入的研究有待进一步完成。
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基金项目：国家自然科学发展基金资助项目(39170374)
作者单位：沈 捷(南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029)
丁国宪(南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029)
陈家伟(南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029)
王 华 (南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029)
庄 旻(中国科学院化学研究所)
魏 勇(复旦大学遗传研究)
柴建华(复旦大学遗传研究)
参考文献
, 百拇医药
1 Taylor SI. Lilly lecture: molecular mechanisms of insulin resistance. Lessons from patients with mutations in the insulin-receptor gene. Diabetes,1992, 41:1473-1490.
2 Talbot JA, Bickncll BJ, Rajkhowa M , et al . Molecular scanning of the insulin receptor gene in women with polycystic ovarian syndrome. J Clin Endocrinol Metab,1996,81:1979-1983.
3 Jospe N , Kaplowitz PB , Furlanetto RW. Homozygous nonsense mutation in the insulin receptor gene of a patient with severe congenital insulin resistance. Clin Endocrinol (Oxf), 1996, 45: 229-234.
, http://www.100md.com
4 Kahn CR,Weir GC. Joslin′s Diabetes. 13th ed. Philadelphia: Lea, 1995.139-161.
5 Desbois C , Magre J , Blanquet V , et al. Detection of sequence variations in the human insulin receptor gene by parallel denaturing gradient gel electrophoresis. Hum Mutat, 1993, 2: 395-403.
6 Seino S , Seino M ,Bell GI. Human insulin receptor gene, partial sequence and amplification of exons by polymerase chain reaction. Diabetes, 1990,39:123-128.
, 百拇医药
7 Chen C, Jack J, Garofalo RS. The Drosophilar insulin receptor is required for normal growth. Endocrinology, 1996, 137:846-856.
8 Suzuki Y, Hatanaka Y, Taira M, et al. Insulin resistance associated with decreased levels of insulin-receptor messenger ribonucleic acid: evidence of a de novo mutation in the maternal allele. J Clin Endocrinol Metab,1995,80:1214-1220.
9 Cheatham B , Kahn CR . Insulin action and the insulin signaling network. Endocr Rev, 1995,16:117-142.
10 Hart LM, Stolk RP, Heine RJ, et al. Association of the insulin- receptor variant Met-985 with hyperglycemia and non-insulin-dependent diabetes mellitus in the Netherlands: a population-based study . Am J Hum Genet, 1996, 59: 1119-1125., 百拇医药
摘要 目的：阐述胰岛素受体基因缺陷与胰岛素抵抗发生机制间的关系。方法：运用PCR-单链构型多态性技术，对9个黑棘皮病家系(计9例患者，23例他们的一级亲属)进行了该基因17外显子筛查工作，对其中带型异常者进行了DNA直接测序确认。结果：发现了3个既往未报道过的错义突变和5个沉默多态性(slient polymorphism)，即杂合子突变Val983→Met，纯合突变Gln1004→ Lys、纯合突变Gly1022→ Lys、Pro980 (CCA→CCC)、Leu1002 (CTG→CTT)、Gln1004 (CAA→CAG)、Gly1008 (GGC→GGT)、Glu1034 (GAG→GAA)。结论：上述突变可能是造成黑棘皮病患者胰岛素抵抗的主要原因。
, 百拇医药
关键词：受体，胰岛素 基因 突变 胰岛素抵抗
胰岛素抵抗常存在于胰岛素抵抗综合征患者中。非胰岛素依赖性糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、高脂血症的发生发展都与胰岛素抵抗密切相关，且发病机制上都有共同之处。已知胰岛素受体基因变异所致胰岛素抵抗是造成胰岛素抵抗的主要类型之一，因此，选择合适的研究对象，从分子生物学结构变异上去揭示基因变异对胰岛素生理效应产生的影响，阐明胰岛素抵抗的产生机制是必要的。黑棘皮病患者具有A型胰岛素抵抗综合征的基本特征，即对内生胰岛素产生抵抗。在病因学上显示此异常可为胰岛素受体单基因突变所致，这已为许多学者所证实[1-3]。但并非所有黑棘皮病患者都可测得胰岛素受体基因发生变异，且发生变异者胰岛素抵抗的严重性也不一致，故而，从家系水平研究黑棘皮患者胰岛素受体基因的缺陷很有必要。
资料与方法
一、 黑棘皮病的确认
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9例黑棘皮病患者均为在我院门诊及住院治疗的患者，年龄在17～38岁之间，所有患者均有明显的高胰岛素血症(空腹胰岛素水平58.6～>160.0 mIU/L)，有3例女性患者B超确定有多囊卵巢，7例患者肥胖，符合黑棘皮病的一般特征[4]，并经病理学确认。正常对照54例(男32例，女22例)来源于本院医生及正常献血者。
二、PCR-单链构型多态性分析
1. DNA抽提：被检者血6ml肝素抗凝，酚/氯仿法抽提后沉淀提取白细胞基因组DNA，经纯度鉴定后，溶于TE，-20℃备用。
2.胰岛素受体基因外显子17扩增：根据Desbois等[5]法改良。 17外显子引物序列：上游引物: 5′ CCAAGGATGCTGTGTAGATAAG(10 654-10 671 bp); 下游引物: 5′ TCAGGAAAGCCAGCCCATGTC(10 946-10 966 bp); 扩增产物长度317 bp。
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3.扩增条件：每反应总体积50 μl，其中含有25 mmol/L KCl，5 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)，0.75 mmol/L MgCl2, 100 mg/L明胶， dATP、dTTP、dGTP、dCTP各100 μmol, 上、下游引物各0.5 mmol, 0.5 μg基因组DNA(模板)。
4.反应程序：上述反应成分依次加入Eppendoff管后，先将样本94℃变性5 min，再加入2U DNA多聚酶(PE公司产品)，然后依次进入29个循环，即94℃ 1 min变性，58℃ 1 min复性，72℃ 1.5 min延伸，扩增产物经1.5%琼脂糖电泳后，与标准分子量序列对照鉴定后，放于4℃待进行单链构型多态性(SSCP)电泳分析。
5.单链构型多态性分析：为寻找基因变异点，每一被检样本均在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶下进行电泳，观察SSCP条带情况。电泳前将PCR产物95℃ 5 min热变性，然后经4℃、110V电泳，电泳12 h左右，待溴酚兰到达胶底部1h后，以银染显示条带，照像分析。对每个样本，均经2～3次电泳以保证实验的准确性。
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6. DNA直接测序：所有经PCR-SSCP筛选分析、显示条带异常的黑棘皮病患者及其一级亲属均进行PCR产物直接测序分析，为保证测序结果准确性，每一样本均从二端各测一次，测序前先对PCR产物进行电泳纯化，测序用Dye Teminator Reaction Kit(PE公司产品)，在PE公司7130型自动测序仪上进行。
结果
经PCR-SSCP后将电泳带型与正常带型比较，共8个新的SSCP带型在黑棘皮病家系被检出，PCR直接测序证实，3个为错义突变，4个为沉默突变，1个为沉默多态性，所有错义突变及主要沉默多态性见表1，2。而在正常对照组仅一种新的与上述SSCP相同带型出现，即Gly1008。
鉴于我们发现的3个错义突变均未见文献报道过，故将突变者及家系间传递情况分别叙述如下：
表1 黑棘皮病患者外显子17突变
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家系
编号
蛋白编码
DNA序列改变
突变
状态
家系1
Val983→Met
TGCTCTGTGTACGTG(野生型 )
杂合
TGCTCTATGTACGTG(突变型 )
家系1
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Gln1004→Lys
CTGGGGCAGGGCTCC(野生型)
纯合
CTGGGGAAGGGCTCC(突变型)
家系2
Gly1022→Lys
AAGGGTGAGGCAGAG(野生型)
纯合
AAGGGTAAGGCAGAG(突变型)
表2 检测到的沉默多态性情况
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密码编号
多态性
检得次数
Pro980
CCA→CCC
1
Leu1002
CTG→CTT
1
Gln1004
CAA→CAG
1
, 百拇医药
Gly1008
GGC→GGT
2
Glu1034
GAG→GAA
1
患者标本在中间呈双带杂合(正常为单带纯合)，在双带前尚有一异常的条带
图1 患者与正常人SSCP电泳结果比较
(1)突变Val983 →Met、Gln1004→ Lys都发生于同一黑棘皮病患者。该患者17岁，独子，其空腹胰岛素82.5 mIU/L，餐后2h胰岛素>160 mIU/L，体重指数30.6 kg/m2，有轻度高血压(140/90 mm Hg, 1 mm Hg=0.133 kPa)，其父兼有糖尿病和肥胖(BMI 28.7 kg/m2)，母亲体检正常。患者SSCP电泳中检出1条与正常相异的区带(图1)。直接测序证实，在胰岛素受体基因蛋白编码区983位有缬氨酸变为甲硫胺酸(Val983→Met)的杂合突变(图2)。该突变在家系内传递情况见图3(a)。该患者在蛋白编码1004位还有一谷氨酰胺变为赖氨酸的纯合突变(图4)，该突变在其父测得为纯合，其母为杂合，家系间该突变传递情况见图3(b) 。
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图2 Val983→Met突变；2a为突变序列，2b为正常对照序列。由于在突变A处有一等高G峰，故为杂合突变
(a)Val983→Met杂合突变；(b)Gln1004→Lys突变；
(c)Gly1022→Lys突变
图3 突变在家系内的传递
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图4 Gln1004→Lys突变；原序列应为GGGCAG，现变为GGGAAG，4a为突变序列，4b为正常对照序列，因4a中A为单峰，故为纯合突变
图5 Gly1022→Lys突变；5a为突变序列，5b为正常对照，因5a突变峰为单峰(A处)，故为纯合突变
表3 发生突变的黑棘皮病家系临床检查情况
家系
亲属
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关系
年龄
(岁)
黑棘
皮病
多囊
卵巢
血压
(mm Hg)
体重
指数
(kg/m2)
胰岛素释放试验(mIU/L)
, 百拇医药
葡萄糖
耐量
试验
血脂测定(mmol/L)
0
min
30
min
60
min
120
min
180
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min
胆固醇
甘油
三酯
高密度
脂蛋白
1
父
43
无
无
108/78
28.7
, 百拇医药 14
26
30
32.5
17
糖尿病
5.20
2.10
0.41
1
母
43
无
无
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128/92
24.0
8.3
23
17
12
7.9
正常
3.70
1.82
1.22
1
子
, 百拇医药
17
有
无
140/90
30.6
82.5
157.8
>160
>160
>160
正常
4.00
1.70
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0.33
2
父
57
无
无
132/85
26.3
17.2
37
44
48
26
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7.03
6.20
0.75
2
母
54
无
无
126/80
27.7
24
42
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48
32
糖尿病
5.40
2.17
0.87
2
女
28
有
有
130/85
31.2
, 百拇医药
>160
>160
>160
>160
>160
正常
5.67
1.70
0.34
(2)发生于1022位的突变为密码由甘氨酸突变为赖氨酸，先证者为一20岁女性黑棘皮患者，不伴有糖尿病，有高血压、胰岛素抵抗、肥胖(BMI=28 kg/m2)，直接测序显示先证者为杂合子(图5)，家系分析显示，患者父亲有糖耐量异常，高脂血症及轻度胰岛素抵抗、肥胖，有该突变的杂合现象，其母有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病及高脂血症并伴该突变纯合现象，此突变在家系内的传递情况见图3(c)。
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(3)其他沉默多态性的检出分别来自这些黑棘皮病患者及其家系成员，因沉默多态性所造成的危害不如点突变大，限于文章篇幅，在此不一一赘述。
(4)检出突变两个家系的临床资料，见表3。
讨论
胰岛素受体基因定位于19号染色体短臂，为单基因编码[6]，该受体具有两个α-亚单位，两个β-亚单位，彼此间以二硫链相连，α-亚单位分布于胞外，而β-亚单位附着于胞膜上，由胞外延伸到胞内，当胰岛素与其受体α-亚单位结合后，位于β-亚单位内的酪氨酸特异性激酶被激活，随之β-亚单位上一些酪氨酸残基发生自动磷酸化。对既往发现的发生于胰岛素受体基因酪氨酸激酶活性区突变的患者资料的研究显示[1-4，7，8]，这些突变不仅可导致酪氨酸激酶本身活性下降，还造成联级瀑布样酶促激活过程下行步骤的一系列障碍。胰岛素受体基因17外显子位于酪氨酸激酶活性区，已知在胰岛素受体基因蛋白激酶活性区有9个绝对保守的氨基酸残基序列，这9个位点及与此相邻的一些同源性保守序列在酪氨酸激酶活性的发挥中起关键作用[9]，在17外显子中有3个这样的保守序列，即Tyr965、Tyr972和1003-1030的ATP结合区。已有研究显示，胰岛素受体基因970位突变引起该基因mRNA表达丰度的降低[8]，发生于该基因985位的突变与胰岛素抵抗和高血糖发生直接相关[10]。我们报道的983位甲硫氨酸替代了缬氨酸，该突变靠近972位Tyr，由上述证据可以推测，此突变影响到酪氨酸激酶的激活及酶促活化中心的形成，引起胰岛素抵抗。发生于1004位的赖氨酸代替了谷胺酰胺突变及发生于1022位的赖氨酸替代了甘氨酸突变，正处在一个富含甘氨酸的区域中，即我们所提及的1003-1030位之间的ATP结合点，而该区域在结构上对胰岛素受体自动磷酸化起到固定磷的作用[4]，它结构的缺陷可能直接影响到自动磷酸化[9]，即直接影响了编码基因Mg2+-ATP的γ-磷酸化过程，从而造成严重的胰岛素抵抗。从我们所掌握的临床资料也完全支持上述推断。在17外显子也检得了以下沉默突变：即Pro980、Leu1002、Gln1004、Glu1034和沉默多态性Gly1008，在上述沉默改变的性状检得者中并未发现很严重的胰岛素抵抗，这可能是由于这些性状并未改变编码氨基酸的种类，从而仅会影响到该基因的表达丰度，而不会造成更为严重的后果。我们的研究并未在所有存在重度胰岛素抵抗的病人中都测出该外显子突变，这可能是由于我们仅进行了17外显子的筛查工作，而全面筛查胰岛素受体基因外显子序列，才能确定是否其他编码区亦存在突变。更广泛、深入的研究有待进一步完成。
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基金项目：国家自然科学发展基金资助项目(39170374)
作者单位：沈 捷(南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029)
丁国宪(南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029)
陈家伟(南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029)
王 华 (南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029)
庄 旻(中国科学院化学研究所)
魏 勇(复旦大学遗传研究)
柴建华(复旦大学遗传研究)
参考文献
, 百拇医药
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9 Cheatham B , Kahn CR . Insulin action and the insulin signaling network. Endocr Rev, 1995,16:117-142.
10 Hart LM, Stolk RP, Heine RJ, et al. Association of the insulin- receptor variant Met-985 with hyperglycemia and non-insulin-dependent diabetes mellitus in the Netherlands: a population-based study . Am J Hum Genet, 1996, 59: 1119-1125., 百拇医药