精子膜功能试剂盒的临床应用对比研究
田中岭 徐志喜 马远方 白慧玲 赵粤萍 许国强 孙会升 李秀敏
摘 要 目的：研究精子膜功能试剂盒的临床应用价值. 方法：使用该试剂盒与精子尾部低渗膨胀试验和伊红Y水试验对33例正常生育男性和65例不育症患者进行比较观察. 结果：该试剂盒与精子尾部低渗膨胀试验和伊红Y水试验检测结果均呈显著的相关性，三种方法精子膨胀率生育组分别为(66.55±4.87)%, (65.82±4.68)%, (68.69±5.59)%；不育组分别为(45.74±13.87)%, (46.88±13.66)%, (49.38±12.62)%. 结论：精子膜功能试剂盒快速简便、结果准确，可代替精子尾部低渗膨胀试验和伊红Y水试验检测精子膜功能并在临床推广应用.
关键词：精子膜 功能试验 试剂盒
0 引言
随着男性学的不断发展，对于影响精子新陈代谢、顶体反应、精子获能以及精卵融合的精子膜功能的研究日益重要. 为找出一种快速、准确地测定精子膜功能的方法，我们根据精子尾部低渗膨胀试验(hypo-osmotic swelling test, HOST)[1]和伊红Y水试验[2]的基本原理，创建了精子膜功能检测试剂盒. 使用该试剂盒，同时对照精子尾部低渗膨胀试验和伊红Y水试验，对33例正常生育男性及65例不育患者精液进行检测分析，结果报告如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 正常生育组男33例，为妻子怀孕6 mo以上，解脲支原体阴性，抗精子抗体阴性者，年龄平均29.5岁. 不育组65例，为婚后2 a以上，性生活正常，解脲支原体阴性，抗精子抗体阴性，妻子无生育者，年龄平均28岁. 禁欲3 d～5 d，用手淫法实验室内采取全部新鲜精液，30 min内送检，液化后，先进行常规检验及解脲支原体检测.
1.2 方法
1.2.1 试剂盒检测 精子膜功能试剂盒分为A液、B液和C液. A液为精子低渗快速膨胀液，主要成分为枸橼酸钠、果糖等. B液为固定液，主要成分为甲醇、丙醋酸等. C液为染色液，主要成分为伊红Y等. 正常生育组使用同一份精液标本用同样方法同时进行重复性试验.
具体操作步骤：①取干净载玻片一张，滴加试剂A一滴；②用加样器取液化精液5 μL，与A液混匀，室温静置3 min；③推成一薄片，自然干燥或酒精灯下微热干燥；④滴加试剂B液2滴～3滴使覆盖薄片，2 min；⑤滴加试剂C液染色2 min，水洗，高倍镜下观察. 高倍镜下计数200个精子，计算各类型精子(Fig 1)百分率.
, 百拇医药
图1 精子表现类型
Fig 1 The types of sperm appearance
A: Unswelling, infunction sperm; B-E: Swelling sperm; B: Tail top swelling; C: Bent swelling; D: Cudgel-shaped swelling; E: Elliptical swelling.
1.2.2 HOST及伊红Y水试验 使用同份精液同时进行HOST及伊红Y水试验进行对照. HOST按Jeyendran[1]的方法进行(离子强度为0.15 mol/kg，渗透压为150 mmol). 伊红Y水试验参照查树伟[2]的方法进行.
2 结果
, http://www.100md.com
三种方法对33例正常生育组精子膜功能检测百分率(Tab 1), 不育组65例三种方法检测精子膜功能百分率(Tab 2)及重复性试验结果(Tab 3).
表1 正常生育组三种方法检测的精子膨胀率
Tab 1 The results of three test methods in fertile group (n=33, x±s, %)
Test
A
B-E
( B
C
D
, http://www.100md.com E )
Kit
33.4±4.9
66.6±4.9
36.2±3.2
9.1±2.0
5.1±1.3
16.2±1.3
HOST
34.2±4.7
65.8±4.7
36.2±2.8
, http://www.100md.com
8.8±2.1
4.7±1.3
16.1±1.2
Eosin Y
31.3±5.6
68.7±5.6
36.1±4.1
9.5±1.8
5.4±1.5
17.7±1.7
A,B-E,(B,C,D,E): The same as Fig 1.表2 不育组三种方法检测结果
, 百拇医药
Tab 2 The results of three test methods in infertile group (n=65, x±s)
Item
A
B-E
( B
C
D
E )
Kit
54.3±13.9
45.7±13.9
, 百拇医药 26.1±7.1
6.8±2.5
2.8±1.2
10.0±4.4
HOST
53.1±13.7
46.9±13.7
26.6±6.7
6.9±2.4
3.2±1.6
10.2±4.8
Eosin Y
, http://www.100md.com
50.6±12.6
49.4±12.6
26.8±6.2
6.9±2.3
3.9±1.1
11.7±4.4
A,B-E,(B,C,D,E): The same as Fig 1.表3 试剂盒重复性试验结果
Tab 3 The results of repetitive test of the kit (n=33, x±s)
Item
A
, http://www.100md.com
B-E
( B
C
D
E )
First
33.4±4.9
66.6±4.9
36.2±3.2
9.1±2.0
5.1±1.3
16.2±1.3
Second
, 百拇医药
33.0±4.5
67.0±4.5
36.6±2.8
9.1±2.0
4.9±1.1
16.4±1.1
A,B-E,(B,C,D,E): The same as Fig 1.
3 讨论
精子受精能力与精子胞膜结构和功能的完整性密切相关. 精子膜不仅是精子新陈代谢的基础，而且也对精子获能、顶体反应以及精卵融合等有重要作用. 因此，测定精子膜功能可以准确地反映精子功能并预测精子的受精能力，为治疗不育症提供科学依据.
, http://www.100md.com
精子膜功能低渗膨胀试验的原理在于精子在低渗环境中，为维持精子膜内外液体平衡，水分子大量透过胞膜进入胞内，而导致细胞膨胀，精子外形改变. 精子尾部膜较其它部位更柔韧疏松，进入的液体更多，外形变化更大，呈现出各种易于观察的膨胀现象，这是精子膜功能正常的标志之一. 而精子膜功能不正常者在低渗条件下呈现A型即不膨胀. Jeyendran[1]于1984年建立了HOST，此后逐渐在国内外开展应用，成为一种有效的测定精子膜功能的方法[3]. 该试验与精子穿透率以及精子顶体反应呈正相关，较精子常规试验更能准确地预测精子的受精能力，但该方法费时费事，不利于临床应用. 国内查树伟在水试验的基础上建立了伊红Y水试验，该方法对于精子膜功能测定亦有一定的价值. 为了更快速简便、准确地检测精子膜功能，更有利于临床实验室应用，我们根据HOST和伊红Y水试验的原理研制了精子膜功能检测试剂盒. 试验结果显示该试剂盒在方法学上有下列特点：①快速简便易于掌握. 标本经固定染色后更有利于观察计数，弥补了因液体流动而造成的重复计数，一般化验员1 h～2 h便可掌握. ②结果准确可靠. 从Tab 1中可以看出，生育组和不育组试剂盒试验结果均与HOST及伊红Y水试验呈显著的相关性；生育组与不育组精子膨胀率差别有非常显著意义(P<0.01)，与一般报道相同[4，5]；生育组的膨胀精子中以B, E型为最多，这和张万洲[6]的结果相近；生育组B, E型膨胀精子明显高于不育组，差别有显著意义(P<0.01)，结果与黄一红[7]的报道结果一致. ③重复性强. 经统计学处理重复性试验结果精子膨胀率及B, E型精子膨胀率差别均无显著意义. 精子膜功能检测试剂盒是一种可靠的检测精子尾部膜功能的方法. 它快速简便、结果准确、重复性强，可代替HOST和伊红Y水试验在临床上推广应用.
, 百拇医药
基金项目：河南省科技攻关项目 No. 961200605
作者简介：田中岭，男，1952-05生，河南省内黄县人，汉族. 1976年河南医科大学医疗系毕业. 校长，副教授. 主编《正常人体解剖学》、《基础肿瘤学》等多部著作, 发表论文数十篇, 承担省级科研课题多项. 电话：(0378)5986001
作者单位：开封医学高等专科学校，河南 开封 475001
参考文献
1 Jeyendran R. Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. J Reprod Fert,1984;70(3):219
, 百拇医药
2 查树伟. 伊红Y水试验法检测精子膜功能. 中华医学检验杂志，1995；18(3)：174-176
3 Fuse H, Kazama T, Katayama. Relationship between hypoosmotic swelling test, semen analysis and zena-free hamster ovurn test. Arch Androl,1991；27(1):73
4 万 奇. 精子尾部低渗肿胀试验在评价男子生育方面的应用. 男性学杂志，1991；5(1)：2-5
5 袁正英. 精子功能的评价. 生殖与避孕，1998；18(1)：58-61
6 张万洲. 精子膜功能测定在临床诊断上的意义.男性学杂志，1997；11(4)：226-228
7 黄一红. 检测精子抗低渗能力的方法学评价.南通医学院学报，1995；15(2)：336-337, 百拇医药
摘 要 目的：研究精子膜功能试剂盒的临床应用价值. 方法：使用该试剂盒与精子尾部低渗膨胀试验和伊红Y水试验对33例正常生育男性和65例不育症患者进行比较观察. 结果：该试剂盒与精子尾部低渗膨胀试验和伊红Y水试验检测结果均呈显著的相关性，三种方法精子膨胀率生育组分别为(66.55±4.87)%, (65.82±4.68)%, (68.69±5.59)%；不育组分别为(45.74±13.87)%, (46.88±13.66)%, (49.38±12.62)%. 结论：精子膜功能试剂盒快速简便、结果准确，可代替精子尾部低渗膨胀试验和伊红Y水试验检测精子膜功能并在临床推广应用.
关键词：精子膜 功能试验 试剂盒
0 引言
随着男性学的不断发展，对于影响精子新陈代谢、顶体反应、精子获能以及精卵融合的精子膜功能的研究日益重要. 为找出一种快速、准确地测定精子膜功能的方法，我们根据精子尾部低渗膨胀试验(hypo-osmotic swelling test, HOST)[1]和伊红Y水试验[2]的基本原理，创建了精子膜功能检测试剂盒. 使用该试剂盒，同时对照精子尾部低渗膨胀试验和伊红Y水试验，对33例正常生育男性及65例不育患者精液进行检测分析，结果报告如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 正常生育组男33例，为妻子怀孕6 mo以上，解脲支原体阴性，抗精子抗体阴性者，年龄平均29.5岁. 不育组65例，为婚后2 a以上，性生活正常，解脲支原体阴性，抗精子抗体阴性，妻子无生育者，年龄平均28岁. 禁欲3 d～5 d，用手淫法实验室内采取全部新鲜精液，30 min内送检，液化后，先进行常规检验及解脲支原体检测.
1.2 方法
1.2.1 试剂盒检测 精子膜功能试剂盒分为A液、B液和C液. A液为精子低渗快速膨胀液，主要成分为枸橼酸钠、果糖等. B液为固定液，主要成分为甲醇、丙醋酸等. C液为染色液，主要成分为伊红Y等. 正常生育组使用同一份精液标本用同样方法同时进行重复性试验.
具体操作步骤：①取干净载玻片一张，滴加试剂A一滴；②用加样器取液化精液5 μL，与A液混匀，室温静置3 min；③推成一薄片，自然干燥或酒精灯下微热干燥；④滴加试剂B液2滴～3滴使覆盖薄片，2 min；⑤滴加试剂C液染色2 min，水洗，高倍镜下观察. 高倍镜下计数200个精子，计算各类型精子(Fig 1)百分率.
, 百拇医药
图1 精子表现类型
Fig 1 The types of sperm appearance
A: Unswelling, infunction sperm; B-E: Swelling sperm; B: Tail top swelling; C: Bent swelling; D: Cudgel-shaped swelling; E: Elliptical swelling.
1.2.2 HOST及伊红Y水试验 使用同份精液同时进行HOST及伊红Y水试验进行对照. HOST按Jeyendran[1]的方法进行(离子强度为0.15 mol/kg，渗透压为150 mmol). 伊红Y水试验参照查树伟[2]的方法进行.
2 结果
, http://www.100md.com
三种方法对33例正常生育组精子膜功能检测百分率(Tab 1), 不育组65例三种方法检测精子膜功能百分率(Tab 2)及重复性试验结果(Tab 3).
表1 正常生育组三种方法检测的精子膨胀率
Tab 1 The results of three test methods in fertile group (n=33, x±s, %)
Test
A
B-E
( B
C
D
, http://www.100md.com E )
Kit
33.4±4.9
66.6±4.9
36.2±3.2
9.1±2.0
5.1±1.3
16.2±1.3
HOST
34.2±4.7
65.8±4.7
36.2±2.8
, http://www.100md.com
8.8±2.1
4.7±1.3
16.1±1.2
Eosin Y
31.3±5.6
68.7±5.6
36.1±4.1
9.5±1.8
5.4±1.5
17.7±1.7
A,B-E,(B,C,D,E): The same as Fig 1.表2 不育组三种方法检测结果
, 百拇医药
Tab 2 The results of three test methods in infertile group (n=65, x±s)
Item
A
B-E
( B
C
D
E )
Kit
54.3±13.9
45.7±13.9
, 百拇医药 26.1±7.1
6.8±2.5
2.8±1.2
10.0±4.4
HOST
53.1±13.7
46.9±13.7
26.6±6.7
6.9±2.4
3.2±1.6
10.2±4.8
Eosin Y
, http://www.100md.com
50.6±12.6
49.4±12.6
26.8±6.2
6.9±2.3
3.9±1.1
11.7±4.4
A,B-E,(B,C,D,E): The same as Fig 1.表3 试剂盒重复性试验结果
Tab 3 The results of repetitive test of the kit (n=33, x±s)
Item
A
, http://www.100md.com
B-E
( B
C
D
E )
First
33.4±4.9
66.6±4.9
36.2±3.2
9.1±2.0
5.1±1.3
16.2±1.3
Second
, 百拇医药
33.0±4.5
67.0±4.5
36.6±2.8
9.1±2.0
4.9±1.1
16.4±1.1
A,B-E,(B,C,D,E): The same as Fig 1.
3 讨论
精子受精能力与精子胞膜结构和功能的完整性密切相关. 精子膜不仅是精子新陈代谢的基础，而且也对精子获能、顶体反应以及精卵融合等有重要作用. 因此，测定精子膜功能可以准确地反映精子功能并预测精子的受精能力，为治疗不育症提供科学依据.
, http://www.100md.com
精子膜功能低渗膨胀试验的原理在于精子在低渗环境中，为维持精子膜内外液体平衡，水分子大量透过胞膜进入胞内，而导致细胞膨胀，精子外形改变. 精子尾部膜较其它部位更柔韧疏松，进入的液体更多，外形变化更大，呈现出各种易于观察的膨胀现象，这是精子膜功能正常的标志之一. 而精子膜功能不正常者在低渗条件下呈现A型即不膨胀. Jeyendran[1]于1984年建立了HOST，此后逐渐在国内外开展应用，成为一种有效的测定精子膜功能的方法[3]. 该试验与精子穿透率以及精子顶体反应呈正相关，较精子常规试验更能准确地预测精子的受精能力，但该方法费时费事，不利于临床应用. 国内查树伟在水试验的基础上建立了伊红Y水试验，该方法对于精子膜功能测定亦有一定的价值. 为了更快速简便、准确地检测精子膜功能，更有利于临床实验室应用，我们根据HOST和伊红Y水试验的原理研制了精子膜功能检测试剂盒. 试验结果显示该试剂盒在方法学上有下列特点：①快速简便易于掌握. 标本经固定染色后更有利于观察计数，弥补了因液体流动而造成的重复计数，一般化验员1 h～2 h便可掌握. ②结果准确可靠. 从Tab 1中可以看出，生育组和不育组试剂盒试验结果均与HOST及伊红Y水试验呈显著的相关性；生育组与不育组精子膨胀率差别有非常显著意义(P<0.01)，与一般报道相同[4，5]；生育组的膨胀精子中以B, E型为最多，这和张万洲[6]的结果相近；生育组B, E型膨胀精子明显高于不育组，差别有显著意义(P<0.01)，结果与黄一红[7]的报道结果一致. ③重复性强. 经统计学处理重复性试验结果精子膨胀率及B, E型精子膨胀率差别均无显著意义. 精子膜功能检测试剂盒是一种可靠的检测精子尾部膜功能的方法. 它快速简便、结果准确、重复性强，可代替HOST和伊红Y水试验在临床上推广应用.
, 百拇医药
基金项目：河南省科技攻关项目 No. 961200605
作者简介：田中岭，男，1952-05生，河南省内黄县人，汉族. 1976年河南医科大学医疗系毕业. 校长，副教授. 主编《正常人体解剖学》、《基础肿瘤学》等多部著作, 发表论文数十篇, 承担省级科研课题多项. 电话：(0378)5986001
作者单位：开封医学高等专科学校，河南 开封 475001
参考文献
1 Jeyendran R. Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. J Reprod Fert,1984;70(3):219
, 百拇医药
2 查树伟. 伊红Y水试验法检测精子膜功能. 中华医学检验杂志，1995；18(3)：174-176
3 Fuse H, Kazama T, Katayama. Relationship between hypoosmotic swelling test, semen analysis and zena-free hamster ovurn test. Arch Androl,1991；27(1):73
4 万 奇. 精子尾部低渗肿胀试验在评价男子生育方面的应用. 男性学杂志，1991；5(1)：2-5
5 袁正英. 精子功能的评价. 生殖与避孕，1998；18(1)：58-61
6 张万洲. 精子膜功能测定在临床诊断上的意义.男性学杂志，1997；11(4)：226-228
7 黄一红. 检测精子抗低渗能力的方法学评价.南通医学院学报，1995；15(2)：336-337, 百拇医药