手术缝线携载c-myc反义基因的研究
曲乐丰 景在平 曹贵松
摘要 目的：探讨手术缝线携载c-myc反义基因片断的可能性及可行性。方法：保护薇乔缝线反复浸泡于c-myc反义核酸溶液72 h，溴化乙锭(EB)标记后紫外灯下观察其吸附反义基因的情况。将吸附反义基因的缝线置于生理盐水中于不同时间点以紫外分光光度计测其吸光度(A)值，绘出体外控释曲线。同时取释放液进行电泳分析。结果：吸附核酸的缝线经EB标记后在紫外灯下呈烧红的铁丝样，释放曲线提示2 h即达释放高峰，36 h基本完全释放。电泳则可见随时间延长而逐渐变亮的电泳带。结论：保护薇乔缝线可较大量携载c-myc反义基因片段，并可缓慢释放。
关键词：缝线 反义基因 内膜增生
基因治疗，尤其是反义基因治疗血管内膜增生表现出良好的前景，但基因治疗中的一个主要难题是如何达到局部靶向性转染治疗基因，以避免全身应用的毒副作用及提高转染效率[1，2]。我们设想若手术缝线可携载反义基因，则可在血管吻合时将反义基因直接导入吻合口，既达到局部性和靶向性，避免全身应用的毒副作用，又可在术中同时完成。本实验旨在探讨手术缝线携载反义基因的可能性及可行性，现将结果报道如下。材料与方法
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1.主要试剂及器材：(1)保护薇乔缝线：美国强生公司惠赠；(2)c-myc反义核酸：上海生工生物公司合成，18 bp(序列：5′-GAAGCTCACGTTGAGGG-G-3′)；(3)溴化乙锭(EB)溶液浓度为10 g/L，TE溶液(组成为0.1 mol/L Tris溶液和0.5 mol/L EDTA溶液)pH为8.0，均购于上海华舜生物试剂公司；(4)紫外透射分析仪：购自上海长明光学电子仪器厂；(5)紫外分光光度仪、核酸电泳仪：购自美国Beckman公司。
2.保护薇乔缝线荷电情况检测：将1根在毛皮上摩擦过的聚乙烯棒靠近8/0保护薇乔缝线，可见缝线被吸起。
3.保护薇乔缝线吸附反义核酸的情况检测：将1号保护薇乔缝线3.0 cm浸于浓度为330 g/L的c-myc反义核酸溶液中24 h，晾干后再浸24 h，反复3次，共浸72 h后再晾干，浸于EB溶液1 s后，置紫外灯下观察。实验对照组缝线反复浸于TE溶液72 h后晾干，浸于EB溶液1 s，紫外灯下观察。空白对照组缝线仅浸于EB溶液中1 s，紫外灯下观察。
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4.携载反义核酸缝线的体外控释实验：将5根8/0保护薇乔缝线同时浸于330 g/L的c-myc反义核酸溶液中24 h，取出晾干后再浸24 h，反复3次，共浸72 h。然后将5根缝线分别置于1.0 ml生理盐水中，37 ℃水浴震荡，分别于0.5、2、6、24、36及72 h取其溶液在紫外分光光度仪下于220 nm和280 nm处测其吸光度(A)值，并绘出体外控释曲线。
5.携载反义核酸的缝线释放反义核酸的形态学证据：将材料与方法4中5份释放液经醋酸浓缩后电泳。
结 果
缝线被带负电荷的聚乙烯棒吸起说明缝线表面带正电荷。紫外灯下观察可见实验组缝线亮如烧红的铁丝，说明缝线上吸附有大量核酸。而实验对照组和空白对照组缝线均未见发亮，说明无核酸吸附。体外控释曲线显示2 h达释放高峰，36 h基本完全释放(图1)。电泳显示随着时间延长其亮度逐渐增强，说明其释放量逐渐增多(图2)。
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图1 缝线吸附反义核酸后的体外释放曲线
图2 缝线吸附及释放反义核酸的形态学观察结果
讨 论
反义基因在治疗血管内膜增生中已显示出良好的效果，若能紧密结合临床，将反义基因在血管手术中直接局部导入，将对反义基因的临床应用有较大的促进作用。我们在进行RNA杂交时需将核酸转移至膜上，是因为膜带正的静电荷，而核酸则带负电荷。我们设想能否将此原理应用于手术缝线上，即若缝线带正电荷不也同样可以吸附带负电的核酸吗 我们以毛皮摩擦后的带负电荷的聚乙烯棒接近保护薇乔缝线见缝线被吸起，证明此缝线带静电且为正电荷。从保护薇乔表面的化学成分分析，涂层中50%为硬脂酸钙，Ca2+带正电荷。此缝线是否可吸附核酸呢 我们以人工合成的18 bp的c-myc反义核酸溶液反复浸泡缝线，最大量吸附后以可与核酸结合的EB标记，紫外灯下见其亮如烧红的铁丝，证明表面吸附了大量核酸。我们设想将携载反义核酸的缝线直接用于血管吻合，那么它是否会释放呢 体外控释实验表明它可释放，2 h达高峰，36 h基本完全释放，凝胶电泳亦显示出类似的结果。
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保护薇乔吸附c-myc反义核酸的机理可能系其表面的钙离子与核酸本身的磷酸根离子或化学修饰基因(硫代磷酸修饰)中的负电基团结合，类似基因转染中的磷酸钙沉淀法。
需要说明的是，为什么选择保护薇乔(coated vicryl)而不用最常用的普理灵(prolene)，首先是我们未检测到普理灵缝线与带负电的聚乙烯棒相互吸引或排斥。其次是因为保护薇乔具有一些Prolene无法比拟的优点：(1)可水解吸收，减少体内异物，减少局部刺激从而降低局部反应；(2)无抗原性，引起组织反应小；(3)保护层消除了缝线的粗边缘，对组织的拖带和损伤小；(4)最近的临床应用表明其有抗感染作用，理论上推测可以降低早期血栓形成及中晚期内膜增生的发生率。总之，实验证明保护薇乔缝线可吸附反义核酸有其理论依据，体外控释曲线表明可以缓慢释放。但吸附了反义核酸的缝线用于血管吻合后反义核酸的转移吸收情况及是否可达到抑制内膜增生的目的尚待进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670707)
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作者单位：曲乐丰(200433上海，第二军医大学附属长海医院血管外科)
景在平(200433上海，第二军医大学附属长海医院血管外科)
曹贵松(200433上海，第二军医大学附属长海医院血管外科)
参考文献
[1]Wagner RW. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides.
Nature, 1994,372:333-335.
[2]Bennett MR, Schwartz SM. Antisense therapy for angioplasty
restenosis:some critical considerations. Circulation, 1995,92:1 981-1 993., 百拇医药
摘要 目的：探讨手术缝线携载c-myc反义基因片断的可能性及可行性。方法：保护薇乔缝线反复浸泡于c-myc反义核酸溶液72 h，溴化乙锭(EB)标记后紫外灯下观察其吸附反义基因的情况。将吸附反义基因的缝线置于生理盐水中于不同时间点以紫外分光光度计测其吸光度(A)值，绘出体外控释曲线。同时取释放液进行电泳分析。结果：吸附核酸的缝线经EB标记后在紫外灯下呈烧红的铁丝样，释放曲线提示2 h即达释放高峰，36 h基本完全释放。电泳则可见随时间延长而逐渐变亮的电泳带。结论：保护薇乔缝线可较大量携载c-myc反义基因片段，并可缓慢释放。
关键词：缝线 反义基因 内膜增生
基因治疗，尤其是反义基因治疗血管内膜增生表现出良好的前景，但基因治疗中的一个主要难题是如何达到局部靶向性转染治疗基因，以避免全身应用的毒副作用及提高转染效率[1，2]。我们设想若手术缝线可携载反义基因，则可在血管吻合时将反义基因直接导入吻合口，既达到局部性和靶向性，避免全身应用的毒副作用，又可在术中同时完成。本实验旨在探讨手术缝线携载反义基因的可能性及可行性，现将结果报道如下。材料与方法
, 百拇医药
1.主要试剂及器材：(1)保护薇乔缝线：美国强生公司惠赠；(2)c-myc反义核酸：上海生工生物公司合成，18 bp(序列：5′-GAAGCTCACGTTGAGGG-G-3′)；(3)溴化乙锭(EB)溶液浓度为10 g/L，TE溶液(组成为0.1 mol/L Tris溶液和0.5 mol/L EDTA溶液)pH为8.0，均购于上海华舜生物试剂公司；(4)紫外透射分析仪：购自上海长明光学电子仪器厂；(5)紫外分光光度仪、核酸电泳仪：购自美国Beckman公司。
2.保护薇乔缝线荷电情况检测：将1根在毛皮上摩擦过的聚乙烯棒靠近8/0保护薇乔缝线，可见缝线被吸起。
3.保护薇乔缝线吸附反义核酸的情况检测：将1号保护薇乔缝线3.0 cm浸于浓度为330 g/L的c-myc反义核酸溶液中24 h，晾干后再浸24 h，反复3次，共浸72 h后再晾干，浸于EB溶液1 s后，置紫外灯下观察。实验对照组缝线反复浸于TE溶液72 h后晾干，浸于EB溶液1 s，紫外灯下观察。空白对照组缝线仅浸于EB溶液中1 s，紫外灯下观察。
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4.携载反义核酸缝线的体外控释实验：将5根8/0保护薇乔缝线同时浸于330 g/L的c-myc反义核酸溶液中24 h，取出晾干后再浸24 h，反复3次，共浸72 h。然后将5根缝线分别置于1.0 ml生理盐水中，37 ℃水浴震荡，分别于0.5、2、6、24、36及72 h取其溶液在紫外分光光度仪下于220 nm和280 nm处测其吸光度(A)值，并绘出体外控释曲线。
5.携载反义核酸的缝线释放反义核酸的形态学证据：将材料与方法4中5份释放液经醋酸浓缩后电泳。
结 果
缝线被带负电荷的聚乙烯棒吸起说明缝线表面带正电荷。紫外灯下观察可见实验组缝线亮如烧红的铁丝，说明缝线上吸附有大量核酸。而实验对照组和空白对照组缝线均未见发亮，说明无核酸吸附。体外控释曲线显示2 h达释放高峰，36 h基本完全释放(图1)。电泳显示随着时间延长其亮度逐渐增强，说明其释放量逐渐增多(图2)。
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图1 缝线吸附反义核酸后的体外释放曲线
图2 缝线吸附及释放反义核酸的形态学观察结果
讨 论
反义基因在治疗血管内膜增生中已显示出良好的效果，若能紧密结合临床，将反义基因在血管手术中直接局部导入，将对反义基因的临床应用有较大的促进作用。我们在进行RNA杂交时需将核酸转移至膜上，是因为膜带正的静电荷，而核酸则带负电荷。我们设想能否将此原理应用于手术缝线上，即若缝线带正电荷不也同样可以吸附带负电的核酸吗 我们以毛皮摩擦后的带负电荷的聚乙烯棒接近保护薇乔缝线见缝线被吸起，证明此缝线带静电且为正电荷。从保护薇乔表面的化学成分分析，涂层中50%为硬脂酸钙，Ca2+带正电荷。此缝线是否可吸附核酸呢 我们以人工合成的18 bp的c-myc反义核酸溶液反复浸泡缝线，最大量吸附后以可与核酸结合的EB标记，紫外灯下见其亮如烧红的铁丝，证明表面吸附了大量核酸。我们设想将携载反义核酸的缝线直接用于血管吻合，那么它是否会释放呢 体外控释实验表明它可释放，2 h达高峰，36 h基本完全释放，凝胶电泳亦显示出类似的结果。
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保护薇乔吸附c-myc反义核酸的机理可能系其表面的钙离子与核酸本身的磷酸根离子或化学修饰基因(硫代磷酸修饰)中的负电基团结合，类似基因转染中的磷酸钙沉淀法。
需要说明的是，为什么选择保护薇乔(coated vicryl)而不用最常用的普理灵(prolene)，首先是我们未检测到普理灵缝线与带负电的聚乙烯棒相互吸引或排斥。其次是因为保护薇乔具有一些Prolene无法比拟的优点：(1)可水解吸收，减少体内异物，减少局部刺激从而降低局部反应；(2)无抗原性，引起组织反应小；(3)保护层消除了缝线的粗边缘，对组织的拖带和损伤小；(4)最近的临床应用表明其有抗感染作用，理论上推测可以降低早期血栓形成及中晚期内膜增生的发生率。总之，实验证明保护薇乔缝线可吸附反义核酸有其理论依据，体外控释曲线表明可以缓慢释放。但吸附了反义核酸的缝线用于血管吻合后反义核酸的转移吸收情况及是否可达到抑制内膜增生的目的尚待进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670707)
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作者单位：曲乐丰(200433上海，第二军医大学附属长海医院血管外科)
景在平(200433上海，第二军医大学附属长海医院血管外科)
曹贵松(200433上海，第二军医大学附属长海医院血管外科)
参考文献
[1]Wagner RW. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides.
Nature, 1994,372:333-335.
[2]Bennett MR, Schwartz SM. Antisense therapy for angioplasty
restenosis:some critical considerations. Circulation, 1995,92:1 981-1 993., 百拇医药