兔关节软骨细胞在纤维蛋白胶中体外培养
作者：傅捷 祝云利 吴海山 周维江 董肇阳
单位：傅捷(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；祝云利(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；吴海山(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；周维江(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；董肇阳(长海医院烧伤科)
关键词：软骨细胞；纤维蛋白胶；关节软骨；培养
第二军医大学学报000722 [摘要] 目的：研究关节软骨细胞在纤维蛋白胶中三维培养时的表现。方法：(1)通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶；(2)在纤维蛋白胶凝成的纤维蛋白中立体培养关节软骨细胞，观察其表现并测定生长曲线、倍增时间；(3)通过透射电镜、AB-PAS染色、Ⅱ型胶原免疫组化检查等，了解细胞生长及软骨基质的分泌情况。结果：(1)关节软骨细胞在纤维蛋白中大部分保持卵圆形，小部分如贴壁细胞状；(2)细胞倍增时间在第1～4天为7.0 d，在第5～7天为2.3 d；(3)AB-PAS染色(+)、Ⅱ型胶原免疫组化检查(+)。结论：关节软骨细胞能在硫酸铵沉淀法制备的纤维蛋白胶中增殖，保持其表和分泌软骨基质。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 813.11 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)07-0670-03
Culture of rabbit articular chondrocytes in fibrin glue in vitro
FU Jie ZHU Yun-Li WU Hai-Shan ZHOU Wei-Jiang
(Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
DONG Zhao-Yang
, 百拇医药
(Department of Burns, Changhai Hospital)
[ABSTRACT] Objective: To study the behavior of chondrocyte when 3D were cultured in fibrin glue. Methods: (1) Fibrin glue was obtained from rabbit blood through the method of ammonium sulfate precipitation. (2) Chondrocytes cultured in fibrin glue. (3) Histology and electron microscopy were used to study the behavior of chondrocytes cultured in fibrin glue. Results: (1) Most chondrocytes retained their oval shape when cultured in fibrin, a few appeared as they did in monolayer culture. (2) The doubling time was 7.0 days between the first and 4th day, and 2.3 days between the 5th and 7th day. (3) AB-PAS stain (+), type Ⅱ collagen immunohistochemical test (+). Conclusion: Chondrocytes grow well and can synthesize cartilage extracellular matrix in fibrin glue.
, 百拇医药
[KEY WORDS] chondrocyte; fibrin glue; joint cartilage; culture
关节软骨全层缺损后自发性的修复过程是形成生物力学性能较差的纤维软骨。缺损区周缘的软骨细胞被软骨基质包围时，其分裂增殖的能力被抑制，因此缺损区边缘的软骨细胞几乎不参与缺损区的自发性修复过程。于是，用软骨细胞移植来修复关节软骨缺损很自然地成了人们注意的焦点[1,2]。应用可吸收支架及功能细胞(即关节软骨细胞)的混合物来修复关节软骨缺损符合组织工程学原理[3]。
许多天然的或人工合成的物质都可作为支架的原料，如胶原、纤维蛋白、藻酸盐、聚乙醇酸(PGA)及聚乳酸(PLA)等[4]。这些物质都满足生物相容性好、细胞毒性小或无、可降解性和可被固定于关节软骨缺损处等要求。功能细胞(关节软骨细胞)能否在该种支架中正常地增殖并合成软骨基质(硫酸粘多糖、Ⅱ型胶原纤维)是成功的关键。
, 百拇医药
Itay等[5] 用软骨细胞与纤维蛋白胶修补关节软骨缺损的体内实验仅取得了有限的结果，曾怀疑是因为纤维蛋白可能具有细胞毒性作用。Homminga等[6]在其实验中发现兔关节软骨细胞能够在人纤维蛋白胶(Tissucol等○ R)中分裂增殖、合成基质并保持其表型。兔关节软骨细胞在硫酸铵沉淀法制备的兔纤维蛋白胶中体外培养的情况尚未见报道。
1 材料和方法
1.1 药品和器材 Ham F12培养液(Gibco公司)，表皮细胞生长因子(EGF)、胰蛋白酶和亮氨酸均为Sigma公司产品。凝血酶(杭州康恩贝公司)，氯化钙和枸橼酸钠均为分析纯(上海试剂一厂产品)。EGF 0.1 μg/ml、谷氨酰胺256 mg/L, 10%小牛血清(华美公司)、维生素C 50 mg/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 Ug/ml，pH 7.4。
, 百拇医药 1.2 兔纤维蛋白原的制备 取新西兰兔1只，体质量约2.3 kg。3%戊巴比妥钠静脉麻醉。无菌操作下收集兔血。按体积比9∶1加入10%枸橼酸钠溶液抗凝。经3 200 r/min离心10 min，保留上清(即兔血浆)。向兔血浆中按体积比5∶1加入4 ℃的饱和硫酸铵溶液，立即出现乳白色的絮状沉淀。经3 200 r/min 离心3 min，所得的乳白色沉淀即为兔纤维蛋白原，-20℃保存备用。
1.3 关节软骨细胞与纤维蛋白混合物的制备 将纤维蛋白原解冻后预加温至37℃。传代4次以内的关节软骨细胞用F12培养液配制成1×106/ml的细胞悬液。向两块24孔板的每孔中滴入软骨细胞悬液100 μl，加入纤维蛋白原200 μl溶解于细胞悬液中。再先后加入预先加热至37 ℃的40 mmol/L氯化钙溶液60 μl及40 μl凝血酶溶液[200 U猪凝血酶溶于2 ml (3 mg/ml)的亮氨酸水溶液中]。然后置于37℃恒温箱中数分钟至纤维蛋白胶凝块形成。再加入F12培养液，置于37℃ 10% CO2恒温箱内培养。30 min后首次换液，以后隔日换液。倒置相差显微镜下观察软骨细胞的形态变化。取第3, 7, 11, 15天的标本各1块以10%甲醛固定，石蜡包埋及切片，行H-E，VG及PAS染色，行Ⅱ型胶原抗体免疫组化检查。取第7，15天的标本各1块，以1.25%戊二醛溶液固定，送透射电镜检查。
, 百拇医药
1.4 软骨细胞在纤维蛋白胶内培养的生长曲线测定 在培养的第1～7天，每日随机选24孔细胞培养板中的3个孔，分别加入0.5%胰蛋白酶溶液2 ml。将纤维蛋白凝块消化完毕后进行细胞锥虫蓝染色，用细胞计数板计数未着色细胞，取均值。绘制生长曲线并直接在曲线上测量倍增时间。
2 结 果
2.1 纤维蛋白胶的制备 新西兰兔股动脉切断后能收集到动脉血约110 ml，可得80 ml血浆。加入4℃饱和硫酸铵溶液后立刻出现乳白色絮状沉淀，离心可获得约6.5 ml沉淀物。溶有纤维蛋白原的软骨细胞悬液在加入凝血酶和氯化钙溶液后迅速凝固，置于37℃恒温箱1～3 min后完全凝固，呈透明无色的胶胨状物，可被手术镊夹持。
2.2 软骨细胞的形态学变化 在倒置显微镜下观察，见软骨细胞逐渐失去其流动性，均匀分布于纤维蛋白内，保持圆形外表，但较为皱缩。经过30 min后的第1次换液后，软骨细胞逐渐恢复圆滑的形态(图1A)。
, 百拇医药
图 1 关节软骨细胞在纤维蛋白胶中培养
Fig 1 The articular chondrocyte cultured in fibrin glue
A： After culturing 7 days (H-E，×40)； B：The ultrastructure of chondrocyte after culturing 7 days (×15 000)
第1天，纤维蛋白混合物的大体形态没有明显变化。大部分软骨细胞呈现卵圆形，另外可见少数软骨细胞出现细胞突起，如同在单层贴壁培养时的形态一般。后者主要集中在纤维蛋白的表层。第4天，纤维蛋白的大体形态没有明显变化，呈现贴壁样生长的软骨细胞所占的比例有所增加，细胞数量有一定程度的增长。第7天，纤维蛋白出现轻度崩解。软骨细胞的细胞密度增加，许多细胞呈现成双成对的趋势。呈贴壁样生长的软骨细胞所占的比例继续增加，细胞数量增加较明显。纤维蛋白的透光性逐渐降低。第10天，纤维蛋白的崩解开始加速，呈贴壁样生长的软骨细胞所占的比例继续增加。第15天，纤维蛋白混合物的崩解较为严重，有些已完全崩解完毕，剩余的软骨细胞凝集成不透光的小块。后者用胰蛋白酶消化后能分解并释放出大量软骨细胞。将这些软骨细胞重又接种于细胞培养瓶中后，依然能够正常地贴壁生长。
, 百拇医药
第1～7天软骨细胞计数分别为9.6×104, 11.3×104, 12.5×104, 13.6×104, 16.8×104, 23.3×104和30.1×104/ml。细胞倍增时间在第1～4天为7.0 d，在第5～7天为2.3 d。
2.3 透射电镜观察结果 透射电镜观察在纤维蛋白胶内培养的软骨细胞，可见软骨细胞包裹于纤维蛋白之中，细胞内可见大量的扩张成囊状的粗面内质网、较多的线粒体、及少量的高尔基复合体。软骨细胞的周围可见一些细胞外分泌颗粒(图1B)。
2.4 染色结果 PAS染色纤维蛋白的无软骨细胞的区域为淡红色，软骨细胞集中的区域色泽较深(图2A，见封四)。Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色可见软骨细胞周围被染成棕黄色(图2B，见封四)。
, 百拇医药 3 讨 论
3.1 软骨细胞在纤维蛋白胶中能够分裂增殖 软骨细胞的增殖速率在第1～4天较慢，而在第5～7天则明显加快。这可能是因为纤维蛋白在第4～5天已出现细微的降解(虽然在第7天时才在倒置相差显微镜下被发现)，从而在纤维蛋白内出现一些细微的裂隙面。软骨细胞在这些裂隙面上呈现贴壁样生长，长出细胞突起，增加与培养液接触的表面积。随着贴壁样生长的软骨细胞的比例增加，细胞分裂增殖的速率也随之增加。软骨细胞在初混入纤维蛋白胶时，细胞出现皱缩，但经过换液以后细胞又恢复圆润的形态。这表明软骨细胞周围呈高渗状态而出现皱缩，换液以后恢复到等渗状态，软骨细胞又逐渐恢复到圆润的形态。
3.2 软骨细胞在纤维蛋白胶中能够合成软骨基质 Homminga等[6]将兔关节软骨细胞在人纤维蛋白胶中培养，发现有酸性粘多糖的分泌。本实验AB-PAS染色示软骨细胞集中的区域为色泽较深的紫红色，这说明软骨细胞在纤维蛋白内培养时能够合成并分泌粘多糖。Ⅰ型胶原免疫组化染色示软骨细胞周围被染成棕黄色，这说明软骨细胞在纤维蛋白内培养时能够合成并分泌Ⅰ型胶原。透射电镜观察到软骨细胞周围的外分泌颗粒，更是从形态上证实了软骨细胞在纤维蛋白内培养时能够合成并分泌基质。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770743)
作者简介：傅捷(1968-)，男(汉族)，博士生，住院医师。
[参 考 文 献]
[1] Richardson JB, Caterson B, Evans EH， et al. Repair of human articular cartilage after implantation of autologous chondrocytes[J]. J Bone Joint Surg Br, 1999, 81(6): 1064-1068.
[2] Brittberg M. Autologous chondrocyte transplantation[J]. Clin Orthop, 1999, 367 (Suppl): S147-155.
, 百拇医药
[3] Vacanti CA, Upton J. Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices[J]. Clin Plastic Surg, 1994, 21(3): 445-462.
[4] 张 晨，张 东，高景恒.组织工程的研究现状[J].中华修复重建外科，1997， 11(3):164-167.
[5] Itay S, Abramovici A, Nevo Z. Use of cultured embryonal chick epiphyseal chondrocytes as grafts for defects on chick articular cartilage[J]. Clin Orthop, 1987, 220: 284-303.
[6] Homminga GN, Buma B, Koot HW, et al. Chondrocyte behavior in fibrin glue in vitro[J]. Acta Orthop Scand, 1993, 64(4): 441-445.
[收稿日期] 2000-01-14
[修回日期] 2000-05-24, http://www.100md.com
单位：傅捷(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；祝云利(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；吴海山(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；周维江(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；董肇阳(长海医院烧伤科)
关键词：软骨细胞；纤维蛋白胶；关节软骨；培养
第二军医大学学报000722 [摘要] 目的：研究关节软骨细胞在纤维蛋白胶中三维培养时的表现。方法：(1)通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶；(2)在纤维蛋白胶凝成的纤维蛋白中立体培养关节软骨细胞，观察其表现并测定生长曲线、倍增时间；(3)通过透射电镜、AB-PAS染色、Ⅱ型胶原免疫组化检查等，了解细胞生长及软骨基质的分泌情况。结果：(1)关节软骨细胞在纤维蛋白中大部分保持卵圆形，小部分如贴壁细胞状；(2)细胞倍增时间在第1～4天为7.0 d，在第5～7天为2.3 d；(3)AB-PAS染色(+)、Ⅱ型胶原免疫组化检查(+)。结论：关节软骨细胞能在硫酸铵沉淀法制备的纤维蛋白胶中增殖，保持其表和分泌软骨基质。
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[中图分类号] Q 813.11 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)07-0670-03
Culture of rabbit articular chondrocytes in fibrin glue in vitro
FU Jie ZHU Yun-Li WU Hai-Shan ZHOU Wei-Jiang
(Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
DONG Zhao-Yang
, 百拇医药
(Department of Burns, Changhai Hospital)
[ABSTRACT] Objective: To study the behavior of chondrocyte when 3D were cultured in fibrin glue. Methods: (1) Fibrin glue was obtained from rabbit blood through the method of ammonium sulfate precipitation. (2) Chondrocytes cultured in fibrin glue. (3) Histology and electron microscopy were used to study the behavior of chondrocytes cultured in fibrin glue. Results: (1) Most chondrocytes retained their oval shape when cultured in fibrin, a few appeared as they did in monolayer culture. (2) The doubling time was 7.0 days between the first and 4th day, and 2.3 days between the 5th and 7th day. (3) AB-PAS stain (+), type Ⅱ collagen immunohistochemical test (+). Conclusion: Chondrocytes grow well and can synthesize cartilage extracellular matrix in fibrin glue.
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[KEY WORDS] chondrocyte; fibrin glue; joint cartilage; culture
关节软骨全层缺损后自发性的修复过程是形成生物力学性能较差的纤维软骨。缺损区周缘的软骨细胞被软骨基质包围时，其分裂增殖的能力被抑制，因此缺损区边缘的软骨细胞几乎不参与缺损区的自发性修复过程。于是，用软骨细胞移植来修复关节软骨缺损很自然地成了人们注意的焦点[1,2]。应用可吸收支架及功能细胞(即关节软骨细胞)的混合物来修复关节软骨缺损符合组织工程学原理[3]。
许多天然的或人工合成的物质都可作为支架的原料，如胶原、纤维蛋白、藻酸盐、聚乙醇酸(PGA)及聚乳酸(PLA)等[4]。这些物质都满足生物相容性好、细胞毒性小或无、可降解性和可被固定于关节软骨缺损处等要求。功能细胞(关节软骨细胞)能否在该种支架中正常地增殖并合成软骨基质(硫酸粘多糖、Ⅱ型胶原纤维)是成功的关键。
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Itay等[5] 用软骨细胞与纤维蛋白胶修补关节软骨缺损的体内实验仅取得了有限的结果，曾怀疑是因为纤维蛋白可能具有细胞毒性作用。Homminga等[6]在其实验中发现兔关节软骨细胞能够在人纤维蛋白胶(Tissucol等○ R)中分裂增殖、合成基质并保持其表型。兔关节软骨细胞在硫酸铵沉淀法制备的兔纤维蛋白胶中体外培养的情况尚未见报道。
1 材料和方法
1.1 药品和器材 Ham F12培养液(Gibco公司)，表皮细胞生长因子(EGF)、胰蛋白酶和亮氨酸均为Sigma公司产品。凝血酶(杭州康恩贝公司)，氯化钙和枸橼酸钠均为分析纯(上海试剂一厂产品)。EGF 0.1 μg/ml、谷氨酰胺256 mg/L, 10%小牛血清(华美公司)、维生素C 50 mg/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 Ug/ml，pH 7.4。
, 百拇医药 1.2 兔纤维蛋白原的制备 取新西兰兔1只，体质量约2.3 kg。3%戊巴比妥钠静脉麻醉。无菌操作下收集兔血。按体积比9∶1加入10%枸橼酸钠溶液抗凝。经3 200 r/min离心10 min，保留上清(即兔血浆)。向兔血浆中按体积比5∶1加入4 ℃的饱和硫酸铵溶液，立即出现乳白色的絮状沉淀。经3 200 r/min 离心3 min，所得的乳白色沉淀即为兔纤维蛋白原，-20℃保存备用。
1.3 关节软骨细胞与纤维蛋白混合物的制备 将纤维蛋白原解冻后预加温至37℃。传代4次以内的关节软骨细胞用F12培养液配制成1×106/ml的细胞悬液。向两块24孔板的每孔中滴入软骨细胞悬液100 μl，加入纤维蛋白原200 μl溶解于细胞悬液中。再先后加入预先加热至37 ℃的40 mmol/L氯化钙溶液60 μl及40 μl凝血酶溶液[200 U猪凝血酶溶于2 ml (3 mg/ml)的亮氨酸水溶液中]。然后置于37℃恒温箱中数分钟至纤维蛋白胶凝块形成。再加入F12培养液，置于37℃ 10% CO2恒温箱内培养。30 min后首次换液，以后隔日换液。倒置相差显微镜下观察软骨细胞的形态变化。取第3, 7, 11, 15天的标本各1块以10%甲醛固定，石蜡包埋及切片，行H-E，VG及PAS染色，行Ⅱ型胶原抗体免疫组化检查。取第7，15天的标本各1块，以1.25%戊二醛溶液固定，送透射电镜检查。
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1.4 软骨细胞在纤维蛋白胶内培养的生长曲线测定 在培养的第1～7天，每日随机选24孔细胞培养板中的3个孔，分别加入0.5%胰蛋白酶溶液2 ml。将纤维蛋白凝块消化完毕后进行细胞锥虫蓝染色，用细胞计数板计数未着色细胞，取均值。绘制生长曲线并直接在曲线上测量倍增时间。
2 结 果
2.1 纤维蛋白胶的制备 新西兰兔股动脉切断后能收集到动脉血约110 ml，可得80 ml血浆。加入4℃饱和硫酸铵溶液后立刻出现乳白色絮状沉淀，离心可获得约6.5 ml沉淀物。溶有纤维蛋白原的软骨细胞悬液在加入凝血酶和氯化钙溶液后迅速凝固，置于37℃恒温箱1～3 min后完全凝固，呈透明无色的胶胨状物，可被手术镊夹持。
2.2 软骨细胞的形态学变化 在倒置显微镜下观察，见软骨细胞逐渐失去其流动性，均匀分布于纤维蛋白内，保持圆形外表，但较为皱缩。经过30 min后的第1次换液后，软骨细胞逐渐恢复圆滑的形态(图1A)。
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图 1 关节软骨细胞在纤维蛋白胶中培养
Fig 1 The articular chondrocyte cultured in fibrin glue
A： After culturing 7 days (H-E，×40)； B：The ultrastructure of chondrocyte after culturing 7 days (×15 000)
第1天，纤维蛋白混合物的大体形态没有明显变化。大部分软骨细胞呈现卵圆形，另外可见少数软骨细胞出现细胞突起，如同在单层贴壁培养时的形态一般。后者主要集中在纤维蛋白的表层。第4天，纤维蛋白的大体形态没有明显变化，呈现贴壁样生长的软骨细胞所占的比例有所增加，细胞数量有一定程度的增长。第7天，纤维蛋白出现轻度崩解。软骨细胞的细胞密度增加，许多细胞呈现成双成对的趋势。呈贴壁样生长的软骨细胞所占的比例继续增加，细胞数量增加较明显。纤维蛋白的透光性逐渐降低。第10天，纤维蛋白的崩解开始加速，呈贴壁样生长的软骨细胞所占的比例继续增加。第15天，纤维蛋白混合物的崩解较为严重，有些已完全崩解完毕，剩余的软骨细胞凝集成不透光的小块。后者用胰蛋白酶消化后能分解并释放出大量软骨细胞。将这些软骨细胞重又接种于细胞培养瓶中后，依然能够正常地贴壁生长。
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第1～7天软骨细胞计数分别为9.6×104, 11.3×104, 12.5×104, 13.6×104, 16.8×104, 23.3×104和30.1×104/ml。细胞倍增时间在第1～4天为7.0 d，在第5～7天为2.3 d。
2.3 透射电镜观察结果 透射电镜观察在纤维蛋白胶内培养的软骨细胞，可见软骨细胞包裹于纤维蛋白之中，细胞内可见大量的扩张成囊状的粗面内质网、较多的线粒体、及少量的高尔基复合体。软骨细胞的周围可见一些细胞外分泌颗粒(图1B)。
2.4 染色结果 PAS染色纤维蛋白的无软骨细胞的区域为淡红色，软骨细胞集中的区域色泽较深(图2A，见封四)。Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色可见软骨细胞周围被染成棕黄色(图2B，见封四)。
, 百拇医药 3 讨 论
3.1 软骨细胞在纤维蛋白胶中能够分裂增殖 软骨细胞的增殖速率在第1～4天较慢，而在第5～7天则明显加快。这可能是因为纤维蛋白在第4～5天已出现细微的降解(虽然在第7天时才在倒置相差显微镜下被发现)，从而在纤维蛋白内出现一些细微的裂隙面。软骨细胞在这些裂隙面上呈现贴壁样生长，长出细胞突起，增加与培养液接触的表面积。随着贴壁样生长的软骨细胞的比例增加，细胞分裂增殖的速率也随之增加。软骨细胞在初混入纤维蛋白胶时，细胞出现皱缩，但经过换液以后细胞又恢复圆润的形态。这表明软骨细胞周围呈高渗状态而出现皱缩，换液以后恢复到等渗状态，软骨细胞又逐渐恢复到圆润的形态。
3.2 软骨细胞在纤维蛋白胶中能够合成软骨基质 Homminga等[6]将兔关节软骨细胞在人纤维蛋白胶中培养，发现有酸性粘多糖的分泌。本实验AB-PAS染色示软骨细胞集中的区域为色泽较深的紫红色，这说明软骨细胞在纤维蛋白内培养时能够合成并分泌粘多糖。Ⅰ型胶原免疫组化染色示软骨细胞周围被染成棕黄色，这说明软骨细胞在纤维蛋白内培养时能够合成并分泌Ⅰ型胶原。透射电镜观察到软骨细胞周围的外分泌颗粒，更是从形态上证实了软骨细胞在纤维蛋白内培养时能够合成并分泌基质。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770743)
作者简介：傅捷(1968-)，男(汉族)，博士生，住院医师。
[参 考 文 献]
[1] Richardson JB, Caterson B, Evans EH， et al. Repair of human articular cartilage after implantation of autologous chondrocytes[J]. J Bone Joint Surg Br, 1999, 81(6): 1064-1068.
[2] Brittberg M. Autologous chondrocyte transplantation[J]. Clin Orthop, 1999, 367 (Suppl): S147-155.
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[3] Vacanti CA, Upton J. Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices[J]. Clin Plastic Surg, 1994, 21(3): 445-462.
[4] 张 晨，张 东，高景恒.组织工程的研究现状[J].中华修复重建外科，1997， 11(3):164-167.
[5] Itay S, Abramovici A, Nevo Z. Use of cultured embryonal chick epiphyseal chondrocytes as grafts for defects on chick articular cartilage[J]. Clin Orthop, 1987, 220: 284-303.
[6] Homminga GN, Buma B, Koot HW, et al. Chondrocyte behavior in fibrin glue in vitro[J]. Acta Orthop Scand, 1993, 64(4): 441-445.
[收稿日期] 2000-01-14
[修回日期] 2000-05-24, http://www.100md.com