延长大鼠异种心脏移植后存活时间的实验研究
杜成友 姚榛祥 郑军 董蒲江 周洪伟
摘 要：目的 研究如何延长大鼠异种心脏移植后的存活时间。方法 实验分为A、B、C、D四组。A组：移植术前12、8、4、0d及10、6、2、0d分别将脾细胞1×108个，抗血清0.2ml静脉注入受体大鼠；B组：在A组的基础上，加用中华眼镜蛇毒(CCV)0.2mg.kg-1.d-1，术前3d至术日腹腔注射。C组：在B组的基础上，加用环孢素A(CsA)10mg.kg-1.d-1、环磷酰胺(Cy)20mg.kg-1.d-1，术前12d开始至术日腹腔注射。D组：在C组的基础上，加用抗巨噬细胞和抗自然杀伤细胞单克隆抗体250μg.kg-1.d-1，术前12d开始至术日腹腔注射。结果 A、B、C、D四组移植心脏分别存活(0.32±0.12)h，(25.6±9.6)h、(48.6±10.4)h和(72.4±21.7)h；术日各组IgG均下降，尤以C、D组下降明显，与A、B组比较，差异有显著性(P<0.05)。结论 术前静脉注射供体脾细胞及抗血清，尤其与CCV、CsA、Cy合用，能显著抑制IgG的产生，延长移植心脏的存活时间。
, 百拇医药
关键词：脾细胞 抗血清 心脏移植 抗体IgG
研究表明：IgM主要参与超急性排斥反应(HAR)；而IgG则参与延迟性异种移植排斥反应(DXR)[1]。本文采用各种治疗手段，降低外周血中IgG的含量，从而达到延长大鼠异种心脏移植后存活时间的目的。
材料与方法
一、药物及试剂
环孢素A(CsA)溶于10%脂肪乳剂中，配制浓度为2g/L；环磷酰胺(Cy)由生理盐水配制，浓度为2g/L；抗巨噬细胞及抗自然杀伤细胞单克隆抗体购自英国Serotec公司，配制浓度为250mg/L；中华眼镜蛇毒(CCV)配制浓度为1g/L。抗大鼠IgG血清购自邦定公司。RPMI1640液购自Gibco公司，Ficoll购自上海试剂二厂；抗C3及IgG抗体及S-P试剂盒购自迈新公司。
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二、供体脾细胞及抗脾细胞血清的制备
1.豚鼠脾切除术：30g/L戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，左上腹直肌切口入腹，显露脾脏，钳夹，结扎切断脾蒂血管和周围韧带。取脾置入无菌不锈钢网。一次性肌注青霉素20万U，清醒后回笼饲养。
2.脾细胞悬液的制备：150目不锈钢网研磨过滤，离心悬液(1000r/min)，加红细胞溶解液，Hanks液清洗2次，RPMI1640液调整细胞浓度为1×106/ml，台盼蓝拒染法判断细胞活性大于90%。
3.抗脾细胞血清的制备：参照文献所述方法[3]，选用生长8个月左右，体重2～3kg家兔1只。采用皮下注射法，分别将豚鼠细胞悬液1ml及佛氏佐剂5mg皮下注射，以后每隔1周皮下注射1次，共4周，第5周采用免疫双扩法测定抗体效价，约1∶16，经兔颈动脉放血后将盛兔血的玻璃平皿加盖，置37℃温箱1h，再放4℃冰箱过夜，待血块收缩后分离血清，无菌分装安瓶，冰冻干燥保存待用。
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三、实验动物及分组
供体随机选用体重约200g的豚鼠，受体选用体重为200～250g的雄性Wister大鼠，供受体均为21只(本校实验动物中心提供)。异种心脏移植模型采用Chen[4]报道的方法完成。实验分为A、B、C、D四组。A组(n=3)：移植术前12、8、4、0d及10、6、2、0d分别将脾细胞1×108个，抗血清0.2ml经大鼠阴茎背静脉输注；B组(n=6)：在A组的基础上，加用CCV0.2mg.kg-1.d-1，术前3d至术日腹腔注射；C组(n=6)；在B组的基础上，加用CsA10mg.kg-1.d-1，Cy20mg.kg-1.d-1，术前12d开始至术日腹腔注射。D组(n=6)：在C组的基础上，加用抗巨噬细胞和抗自然杀伤细胞单克隆抗体250μg.kg-1.d-1，术前12d开始至术日腹腔注射。
, 百拇医药
四、观察项目
观测各实验组移植心脏存活时间；用ELISA法测定术前6d、术日及移植心脏停跳时大鼠血清IgG含量。
五、统计学处理
实验结果以X±s表示，统计学分析采用t检验。
结 果
一、各实验组移植心脏存活时间
A组移植心脏仅存活(0.32±0.12)h；B组移植心脏存活(25.6±9.6)h；C组移植心脏存活时间达(48.6±10.4)h(与A、B组比较，P<0.01，P<0.05)；D组移植心脏存活时间可达(72.4±21.7)h(与A、B组比较，P<0.01，与C组比较，P<0.05)。
二、外周血IgG检测
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移植术前6d，四组外周血IgG测定值相互比较差异无显著性(P>0.05)；术日各组IgG均比术前6dIgG下降，尤其是C、D两组下降显著(与A、B组比较，P<0.05，与本组术前6d比较，P<0.05)，供心停跳时，B、C、D三组IgG值均有不同程度增加，但与术日比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。
表1 各实验组外周血IgG含量比较(X±s)
组别
IgG含量(mg/L)
术前6d
术日
移植心停跳时
A组
6735±307
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5275±376
-
B组
7210±498
5098±432
5247±398
C组
7472±375
4375±375
4574±292
D组
7063±425
, http://www.100md.com 3651±278
3982±307
讨 论
一、大鼠外周血IgG的变化与移植豚鼠心脏存活时间的关系
抗体IgG主要通过以下两种途径参与DXR：(1)通过与抗原结合，从而激活补体的经典途径；(2)通过巨噬细胞和自然杀伤细胞膜上的IgGFc受体来引导自身细胞的游走，浸润的激活[4]。因此，抑制IgG的产生，至少会减轻排斥反应的强度。本实验结果表明，外周血IgG量的变化与移植豚鼠心脏存活时间呈正相关，外周血IgG下降显著的C、D两组，其移植心脏存活时间显著延长。
二、CsA、Cy、抗巨噬细胞和抗自然杀伤细胞单克隆抗体的协同作用
CsA通过抑制CD4+T淋巴细胞释放的使B细胞增殖的细胞因子，来抑制抗体的产生，而Cy可直接抑制B细胞增殖。
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CsA、Cy对非协调性异种移植后HAR、DXR无抑制作用[5]，实验中使用CsA、Cy治疗延长移植心脏存活时间的作用，与它们抑制抗体的产生而非直接抑制异种细胞性排斥反应有关。由于巨噬细胞、自然杀伤细胞是异种移植细胞性排斥的主要效应细胞，抗巨噬细胞及抗自然杀伤细胞单克隆抗体的应用，能不同程度地延长异种移植心脏存活时间。
基金项目：重庆医科大学博士后基金资助项目
作者单位：杜成友(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
姚榛祥(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
郑军(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
董蒲江(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
, http://www.100md.com
周洪伟(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
参考文献
[1]Koren E, Neethling FA, Kosecec M, et al. Cytotoxic effects of human preformed anti-α Gal IgG and complement on cultured pig cells. Transplant Proc, 1994， 26:1336-1338.
[2]舒雨雁，陈川，庄茂章，等.中华眼镜蛇毒因子的分离，纯化及性质的研究. 生物化学与生物物理学报，1991， 23：32-35.
[3]吕世静.免疫血清制备与抗体纯化.见：杨延彬，尹学念，主编. 实用免疫学.长春：长春出版社， 1994. 365-384.
[4]Neethling FA, Joziasse D, Bovin N, et al. The reducing end of a Gal oligosaccharides contributes to their efficiency in blocking natural antibody of human and baboon sera. Transplant Int, 1996, 9:98-102.
[5]Hancock WW. The past, present and future of renal xenotransplantation. Kidney Int, 1997, 51:932-949., 百拇医药
摘 要：目的 研究如何延长大鼠异种心脏移植后的存活时间。方法 实验分为A、B、C、D四组。A组：移植术前12、8、4、0d及10、6、2、0d分别将脾细胞1×108个，抗血清0.2ml静脉注入受体大鼠；B组：在A组的基础上，加用中华眼镜蛇毒(CCV)0.2mg.kg-1.d-1，术前3d至术日腹腔注射。C组：在B组的基础上，加用环孢素A(CsA)10mg.kg-1.d-1、环磷酰胺(Cy)20mg.kg-1.d-1，术前12d开始至术日腹腔注射。D组：在C组的基础上，加用抗巨噬细胞和抗自然杀伤细胞单克隆抗体250μg.kg-1.d-1，术前12d开始至术日腹腔注射。结果 A、B、C、D四组移植心脏分别存活(0.32±0.12)h，(25.6±9.6)h、(48.6±10.4)h和(72.4±21.7)h；术日各组IgG均下降，尤以C、D组下降明显，与A、B组比较，差异有显著性(P<0.05)。结论 术前静脉注射供体脾细胞及抗血清，尤其与CCV、CsA、Cy合用，能显著抑制IgG的产生，延长移植心脏的存活时间。
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关键词：脾细胞 抗血清 心脏移植 抗体IgG
研究表明：IgM主要参与超急性排斥反应(HAR)；而IgG则参与延迟性异种移植排斥反应(DXR)[1]。本文采用各种治疗手段，降低外周血中IgG的含量，从而达到延长大鼠异种心脏移植后存活时间的目的。
材料与方法
一、药物及试剂
环孢素A(CsA)溶于10%脂肪乳剂中，配制浓度为2g/L；环磷酰胺(Cy)由生理盐水配制，浓度为2g/L；抗巨噬细胞及抗自然杀伤细胞单克隆抗体购自英国Serotec公司，配制浓度为250mg/L；中华眼镜蛇毒(CCV)配制浓度为1g/L。抗大鼠IgG血清购自邦定公司。RPMI1640液购自Gibco公司，Ficoll购自上海试剂二厂；抗C3及IgG抗体及S-P试剂盒购自迈新公司。
, 百拇医药
二、供体脾细胞及抗脾细胞血清的制备
1.豚鼠脾切除术：30g/L戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，左上腹直肌切口入腹，显露脾脏，钳夹，结扎切断脾蒂血管和周围韧带。取脾置入无菌不锈钢网。一次性肌注青霉素20万U，清醒后回笼饲养。
2.脾细胞悬液的制备：150目不锈钢网研磨过滤，离心悬液(1000r/min)，加红细胞溶解液，Hanks液清洗2次，RPMI1640液调整细胞浓度为1×106/ml，台盼蓝拒染法判断细胞活性大于90%。
3.抗脾细胞血清的制备：参照文献所述方法[3]，选用生长8个月左右，体重2～3kg家兔1只。采用皮下注射法，分别将豚鼠细胞悬液1ml及佛氏佐剂5mg皮下注射，以后每隔1周皮下注射1次，共4周，第5周采用免疫双扩法测定抗体效价，约1∶16，经兔颈动脉放血后将盛兔血的玻璃平皿加盖，置37℃温箱1h，再放4℃冰箱过夜，待血块收缩后分离血清，无菌分装安瓶，冰冻干燥保存待用。
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三、实验动物及分组
供体随机选用体重约200g的豚鼠，受体选用体重为200～250g的雄性Wister大鼠，供受体均为21只(本校实验动物中心提供)。异种心脏移植模型采用Chen[4]报道的方法完成。实验分为A、B、C、D四组。A组(n=3)：移植术前12、8、4、0d及10、6、2、0d分别将脾细胞1×108个，抗血清0.2ml经大鼠阴茎背静脉输注；B组(n=6)：在A组的基础上，加用CCV0.2mg.kg-1.d-1，术前3d至术日腹腔注射；C组(n=6)；在B组的基础上，加用CsA10mg.kg-1.d-1，Cy20mg.kg-1.d-1，术前12d开始至术日腹腔注射。D组(n=6)：在C组的基础上，加用抗巨噬细胞和抗自然杀伤细胞单克隆抗体250μg.kg-1.d-1，术前12d开始至术日腹腔注射。
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四、观察项目
观测各实验组移植心脏存活时间；用ELISA法测定术前6d、术日及移植心脏停跳时大鼠血清IgG含量。
五、统计学处理
实验结果以X±s表示，统计学分析采用t检验。
结 果
一、各实验组移植心脏存活时间
A组移植心脏仅存活(0.32±0.12)h；B组移植心脏存活(25.6±9.6)h；C组移植心脏存活时间达(48.6±10.4)h(与A、B组比较，P<0.01，P<0.05)；D组移植心脏存活时间可达(72.4±21.7)h(与A、B组比较，P<0.01，与C组比较，P<0.05)。
二、外周血IgG检测
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移植术前6d，四组外周血IgG测定值相互比较差异无显著性(P>0.05)；术日各组IgG均比术前6dIgG下降，尤其是C、D两组下降显著(与A、B组比较，P<0.05，与本组术前6d比较，P<0.05)，供心停跳时，B、C、D三组IgG值均有不同程度增加，但与术日比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。
表1 各实验组外周血IgG含量比较(X±s)
组别
IgG含量(mg/L)
术前6d
术日
移植心停跳时
A组
6735±307
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5275±376
-
B组
7210±498
5098±432
5247±398
C组
7472±375
4375±375
4574±292
D组
7063±425
, http://www.100md.com 3651±278
3982±307
讨 论
一、大鼠外周血IgG的变化与移植豚鼠心脏存活时间的关系
抗体IgG主要通过以下两种途径参与DXR：(1)通过与抗原结合，从而激活补体的经典途径；(2)通过巨噬细胞和自然杀伤细胞膜上的IgGFc受体来引导自身细胞的游走，浸润的激活[4]。因此，抑制IgG的产生，至少会减轻排斥反应的强度。本实验结果表明，外周血IgG量的变化与移植豚鼠心脏存活时间呈正相关，外周血IgG下降显著的C、D两组，其移植心脏存活时间显著延长。
二、CsA、Cy、抗巨噬细胞和抗自然杀伤细胞单克隆抗体的协同作用
CsA通过抑制CD4+T淋巴细胞释放的使B细胞增殖的细胞因子，来抑制抗体的产生，而Cy可直接抑制B细胞增殖。
, http://www.100md.com
CsA、Cy对非协调性异种移植后HAR、DXR无抑制作用[5]，实验中使用CsA、Cy治疗延长移植心脏存活时间的作用，与它们抑制抗体的产生而非直接抑制异种细胞性排斥反应有关。由于巨噬细胞、自然杀伤细胞是异种移植细胞性排斥的主要效应细胞，抗巨噬细胞及抗自然杀伤细胞单克隆抗体的应用，能不同程度地延长异种移植心脏存活时间。
基金项目：重庆医科大学博士后基金资助项目
作者单位：杜成友(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
姚榛祥(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
郑军(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
董蒲江(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
, http://www.100md.com
周洪伟(400016 重庆医科大学附属第一医院普外科)
参考文献
[1]Koren E, Neethling FA, Kosecec M, et al. Cytotoxic effects of human preformed anti-α Gal IgG and complement on cultured pig cells. Transplant Proc, 1994， 26:1336-1338.
[2]舒雨雁，陈川，庄茂章，等.中华眼镜蛇毒因子的分离，纯化及性质的研究. 生物化学与生物物理学报，1991， 23：32-35.
[3]吕世静.免疫血清制备与抗体纯化.见：杨延彬，尹学念，主编. 实用免疫学.长春：长春出版社， 1994. 365-384.
[4]Neethling FA, Joziasse D, Bovin N, et al. The reducing end of a Gal oligosaccharides contributes to their efficiency in blocking natural antibody of human and baboon sera. Transplant Int, 1996, 9:98-102.
[5]Hancock WW. The past, present and future of renal xenotransplantation. Kidney Int, 1997, 51:932-949., 百拇医药