肾移植长期存活受者致敏状态的检测及其临床意义
肖家全 唐孝达 王祥慧 徐达 周佩军 丁言德 沈瑾
摘 要 目的 检测肾移植长期存活受者的致敏状态，并分析其与移植肾功能的关系。方法 在定期随访的肾移植受者中，选取存活3年以上的受者66例，其中肾功能正常者46例，慢性肾功能减退者20例，用Lambda Antigen Tray(LAT) 酶联免疫试剂盒检测血清中的可溶性抗HLA抗体，分析抗体的类型和特异性、致敏与肾功能及移植后时间的关系。结果 肾功能正常组轻度、中度、高度致敏分别为9例、0例、2例，肾功能减退组为3例、1例、4例；移植后3～5年、6～8年及8年以上的致敏率没有差异；致敏类型：肾功能正常组Ⅰ类抗原致敏0例、Ⅱ类抗原致敏8例、Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏3例，肾功能减退组分别为1例、2例、5例。结论 致敏率与移植后的时间长短无关；HLA Ⅱ类抗原是致敏的主要原因；移植肾功能受损与高度致敏和Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏有关。
关键词：肾移植 检测，免疫学 HLA抗原 抗体生成
, 百拇医药
肾移植受者在移植前进行群体反应性抗体(PRA)的检测已受到人们的重视。PRA阳性，说明受者已致敏，移植后发生排斥的风险较大。移植本身是一种致敏因素，长期存活的受者可因移植而呈致敏状态。对肾移植长期存活受者的致敏状态及其与移植肾功能关系的研究目前还较少。本研究采用Lambda Antigen Tray(LAT)酶联免疫试剂盒对我院存活3年以上受者的致敏状态进行检测，分析抗体的类型和特异性、致敏率与肾功能的关系及致敏率与移植后时间的关系，以期探讨影响长期存活率的因素。现报告如下。
对象与方法
在我院定期随访的肾移植受者中，选取存活3年以上的受者66例，其中肾功能正常者(血肌酐<177μmol/L)46例，慢性肾功能减退者(血肌酐>177μmol/L，平均264.5μmol/L，排除输尿管梗阻、肾动脉狭窄、环孢素A肾中毒、感染等因素)20例，其肾功能减退持续时间为1～5年。两组在年龄、性别比例、平均存活时间、移植前输血次数、冷缺血及热缺血时间、淋巴细胞毒方面的差异均无显著性，移植后均用环孢素A+泼尼松+硫唑嘌呤作为基础免疫抑制治疗。测定时抽取外周血3ml，凝固后离心，分离出血清，用LAT ELISA 1240型试剂盒检测可溶性抗HLA抗体(IgG类，sHLA-IgG)。检测严格按试剂盒说明书进行，在One Lambda专用酶标仪上读取结果，并用软件分析阳性样本抗体的百分率和特异性，所有检测均达到试剂盒要求的质量控制标准，结果可靠。
, 百拇医药
数据的统计学处理采用χ2检验，取单侧P＝0.05为显著性水平。
结 果
一、 致敏率
根据血清中sHLA-IgG的百分率，将样本的致敏程度分为4级：≤10%为未致敏(阴性)；≤50%为轻度致敏；≤80%为中度致敏；>80%为高度致敏。两个组的致敏例数见表1。总致敏率肾功能正常组和肾功能减退组分别为24%(11/46)和40%(8/20)，两者比较，差异不显著，但两个组高度致敏率的差异有显著性，提示高度致敏与移植肾功能受损有关。
表1 两个组的致敏例数
组 别
n
轻度致敏
, 百拇医药
中度致敏
高度致敏
肾功能正常组
46
9
0
2
肾功能减退组
20
3
1
4
注： * 与肾功能正常组比较， χ2=4.02， P<0.05
, 百拇医药
二、 致敏率在移植后不同时间段的分布(表2)
表2 移植后不同时间段两组致敏率的比较
组 别
n
3～5年
6～8年
>8年
肾功能正常组
46
4/14
3/14
4/18
, 百拇医药
肾功能减退组
20
3/9
4/8
1/3
表2列出了两个组在移植后不同时间段的致敏率，结果显示，无论是在两组间比较，还是同一组内比较，在不同时间段内致敏率的差异均无显著性(χ2=1.92，P>0.05)，说明致敏的发生与移植后时间长短无关。
三、 致敏类型(表3)
表3 两个组致敏类型的比较
组 别
n
, 百拇医药
Ⅰ类抗原 致敏
Ⅱ类抗原
致敏
Ⅰ、Ⅱ类抗原
同时致敏
肾功能正常组
46
0
8
3
肾功能减退组
20
1
, http://www.100md.com
2
5*
注： * 与肾功能正常组比较， χ2＝4.47， P<0.05
自表3可以看出，单纯由Ⅰ类抗原致敏者较少，由Ⅱ类或Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏者常见，这说明Ⅱ类抗原是致敏的主要因素，特别是Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏，功能减退组明显高于正常组，提示肾功能减退与Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏有关。
四、 抗体的特异性
根据致敏样本阳性孔所在的位置及反应格局，由软件自动分析抗体的特异性。结果显示，Ⅰ类抗体以抗HLA-A26、B45抗体多见，Ⅱ类抗体以抗HLA-DR9、DR17、DR18、DQ8、DQ9抗体多见。若供受者HLA错配，大多存在针对错配位点的抗体，即供者反应性抗体(DRA)。由于早期尚未常规开展HLA配型，且在已行HLA分型的病例中，方法也在不断改进，因此难以与移植前HLA的资料进行比较。
, 百拇医药
讨 论
据器官共享联合网络(UNOS)的统计，影响移植肾长期存活的因素按程度排序依次为PRA、HLA-B及DR的错配、移植次数、移植前输血、供者年龄和种族差异[1]。肾移植受者在接受了HLA不同的供肾后，体内产生抗HLA抗体而成为致敏状态。致敏不但与急性排斥有关，而且与慢性排斥及长期存活率也有关。Kerman等[2]报告肾移植受者sHLA-IgG阳性与术后12个月内排斥反应和1～3年存活率具有明显的相关性(P<0.01)。Barr等[3]报告sHLA-IgG对同种心、肾移植长期存活率存在明显的影响，术后1年若sHLA-IgG阳性，移植肾的5年存活率为53%，而阴性者的存活率为70%。Kerman等[4]还报告了在发生慢性排斥的患者中，63%的受者致敏，而无排斥的受者只有6%的致敏，说明致敏与慢性排斥有关。我们的结果显示，高度致敏及Ⅰ 、Ⅱ类抗原同时致敏与肾功能受损有关。因此，无论是在移植前致敏还是在移植后致敏，都对肾功能和长期存活率产生不利影响。
, http://www.100md.com
检测PRA的方法很多，经典的有Amos方法、抗人球蛋白法(AHG)和美国国立卫生研究院法(NIH)，90年代又出现了流式细胞分析法(FCXM)[5]，这些方法只能检测到与补体结合的抗体，且需要活的淋巴细胞。1995年，美国5大著名实验室联合研制的PRA-STAT法，克服了上述缺点，但尚不能区分Ⅰ、Ⅱ类抗体[6]。1998年推出LAT检测系统，它的原理是将纯化的HLA Ⅰ、Ⅱ类抗原分别包被在Terasaki微板的不同孔内，其中Ⅰ类抗原70个，包被28孔，Ⅱ类抗原24个，包被12孔，每块板均设有空白及阴、阳性对照，可同时检测2份样本。如果待检血清中存在HLA抗体，此抗体便与相应孔内的抗原结合，通过分析阳性孔的数目和分布格局，不但可以计算出阳性样本抗体的百分率，而且能区分Ⅰ、Ⅱ类抗体，还能分析抗体的特异性。通过多次使用，我们认为LAT操作简捷，灵敏度高，重复性好，结果可靠，适合临床应用。
有研究结果显示，移植后抗体的产生与嵌合状态的形成有关，嵌合体可能扮演了同种抗原的角色[7]。供者器官进入受者体内后，打破了受者体内固有的免疫平衡状态，随着移植时间的延长，供、受者之间由激烈对抗逐渐趋向和谐共存的新平衡，供者器官的抗原性也逐渐减弱，但由于形成了嵌合体，受者就会不断产生针对供者的抗体[7]。此种观点与嵌合有利于免疫耐受形成的理论明显不同，有关致敏与嵌合体的关系还需要深入地研究。
, http://www.100md.com
本研究结果提示我们，经常检测移植患者的sHLA-IgG具有重要的临床意义，它可以作为评价受者免疫状态的一项指标。由于高度致敏与移植肾功能受损有关，因此受者若处在高度致敏状态，应严密监测移植肾功能，必要时调整免疫抑制剂或采取去除抗体的措施，如血浆置换、免疫吸附等。HLA Ⅱ类抗原是致敏的主要因素，故应重视移植前的组织配型，特别是HLA Ⅱ类抗原的配型，以避免术后产生抗体。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870706)
作者单位：肖家全(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
唐孝达(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
王祥慧(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
徐达(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
, http://www.100md.com
周佩军(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
丁言德(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
沈瑾(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
参考文献
[1]Smith JD, Danskine AJ, Rose ML, et al. Specificity of lymphocytoxic antibodies formed after cardiac transplantation and correlation with rejection episodes. Transplantation, 1992, 6:1358-1360.
[2]Kerman R, Susskind B, Buelow R, et al. Correlation of ELISA-detected IgG and IgA anti-HLA antibodies in pretransplant sera with renal allograft rejection. Transplantation, 1996, 62:201-203.
, 百拇医药
[3]Barr ML, Cohen DJ, Benvenisty AI, et al. Effect of anti-HLA antibodies on the long-term survival of heart and kidney allografts. Transplant Proc, 1993, 25(1 pt 1):262-264.
[4]Kerman R, Susskind B, Kerman M, et al. ELISA-detected anti-HLA antibodies in posttransplant renal allograft recipient sera correlate with chronic rejection. In: Paul L， Terasaki，eds. Visuals of The 11th Clinical Histocompatibility Workshop， Bahamas, 1996, March. 8-9.
, 百拇医药
[5]Orosz C, Hennessy P, Pelletier R, et al. Comparison of cross-match methodologies. In: Paul L， Terasaki，eds. Visuals of The 11th Clinical Histocompatibility Workshop， Bahamas, 1996,March. 34-35.
[6]Buolow R, Mercier I, Glanville L, et al. Detection of panel-reactive anti-HLA class I antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay or lymphocytotoxicity: results of a blinded, controlled multicenter study. Human Immunol, 1995, 44:1.
[7]Okasha KM, Al-Tweigeri TA, Jurado AV, et al. Analysis of the relationship between chimerism and the allogeneic humoral response. Transplantation, 1998, 66:1028-1033.
收稿日期：2000-03-03, 百拇医药
摘 要 目的 检测肾移植长期存活受者的致敏状态，并分析其与移植肾功能的关系。方法 在定期随访的肾移植受者中，选取存活3年以上的受者66例，其中肾功能正常者46例，慢性肾功能减退者20例，用Lambda Antigen Tray(LAT) 酶联免疫试剂盒检测血清中的可溶性抗HLA抗体，分析抗体的类型和特异性、致敏与肾功能及移植后时间的关系。结果 肾功能正常组轻度、中度、高度致敏分别为9例、0例、2例，肾功能减退组为3例、1例、4例；移植后3～5年、6～8年及8年以上的致敏率没有差异；致敏类型：肾功能正常组Ⅰ类抗原致敏0例、Ⅱ类抗原致敏8例、Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏3例，肾功能减退组分别为1例、2例、5例。结论 致敏率与移植后的时间长短无关；HLA Ⅱ类抗原是致敏的主要原因；移植肾功能受损与高度致敏和Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏有关。
关键词：肾移植 检测，免疫学 HLA抗原 抗体生成
, 百拇医药
肾移植受者在移植前进行群体反应性抗体(PRA)的检测已受到人们的重视。PRA阳性，说明受者已致敏，移植后发生排斥的风险较大。移植本身是一种致敏因素，长期存活的受者可因移植而呈致敏状态。对肾移植长期存活受者的致敏状态及其与移植肾功能关系的研究目前还较少。本研究采用Lambda Antigen Tray(LAT)酶联免疫试剂盒对我院存活3年以上受者的致敏状态进行检测，分析抗体的类型和特异性、致敏率与肾功能的关系及致敏率与移植后时间的关系，以期探讨影响长期存活率的因素。现报告如下。
对象与方法
在我院定期随访的肾移植受者中，选取存活3年以上的受者66例，其中肾功能正常者(血肌酐<177μmol/L)46例，慢性肾功能减退者(血肌酐>177μmol/L，平均264.5μmol/L，排除输尿管梗阻、肾动脉狭窄、环孢素A肾中毒、感染等因素)20例，其肾功能减退持续时间为1～5年。两组在年龄、性别比例、平均存活时间、移植前输血次数、冷缺血及热缺血时间、淋巴细胞毒方面的差异均无显著性，移植后均用环孢素A+泼尼松+硫唑嘌呤作为基础免疫抑制治疗。测定时抽取外周血3ml，凝固后离心，分离出血清，用LAT ELISA 1240型试剂盒检测可溶性抗HLA抗体(IgG类，sHLA-IgG)。检测严格按试剂盒说明书进行，在One Lambda专用酶标仪上读取结果，并用软件分析阳性样本抗体的百分率和特异性，所有检测均达到试剂盒要求的质量控制标准，结果可靠。
, 百拇医药
数据的统计学处理采用χ2检验，取单侧P＝0.05为显著性水平。
结 果
一、 致敏率
根据血清中sHLA-IgG的百分率，将样本的致敏程度分为4级：≤10%为未致敏(阴性)；≤50%为轻度致敏；≤80%为中度致敏；>80%为高度致敏。两个组的致敏例数见表1。总致敏率肾功能正常组和肾功能减退组分别为24%(11/46)和40%(8/20)，两者比较，差异不显著，但两个组高度致敏率的差异有显著性，提示高度致敏与移植肾功能受损有关。
表1 两个组的致敏例数
组 别
n
轻度致敏
, 百拇医药
中度致敏
高度致敏
肾功能正常组
46
9
0
2
肾功能减退组
20
3
1
4
注： * 与肾功能正常组比较， χ2=4.02， P<0.05
, 百拇医药
二、 致敏率在移植后不同时间段的分布(表2)
表2 移植后不同时间段两组致敏率的比较
组 别
n
3～5年
6～8年
>8年
肾功能正常组
46
4/14
3/14
4/18
, 百拇医药
肾功能减退组
20
3/9
4/8
1/3
表2列出了两个组在移植后不同时间段的致敏率，结果显示，无论是在两组间比较，还是同一组内比较，在不同时间段内致敏率的差异均无显著性(χ2=1.92，P>0.05)，说明致敏的发生与移植后时间长短无关。
三、 致敏类型(表3)
表3 两个组致敏类型的比较
组 别
n
, 百拇医药
Ⅰ类抗原 致敏
Ⅱ类抗原
致敏
Ⅰ、Ⅱ类抗原
同时致敏
肾功能正常组
46
0
8
3
肾功能减退组
20
1
, http://www.100md.com
2
5*
注： * 与肾功能正常组比较， χ2＝4.47， P<0.05
自表3可以看出，单纯由Ⅰ类抗原致敏者较少，由Ⅱ类或Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏者常见，这说明Ⅱ类抗原是致敏的主要因素，特别是Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏，功能减退组明显高于正常组，提示肾功能减退与Ⅰ、Ⅱ类抗原同时致敏有关。
四、 抗体的特异性
根据致敏样本阳性孔所在的位置及反应格局，由软件自动分析抗体的特异性。结果显示，Ⅰ类抗体以抗HLA-A26、B45抗体多见，Ⅱ类抗体以抗HLA-DR9、DR17、DR18、DQ8、DQ9抗体多见。若供受者HLA错配，大多存在针对错配位点的抗体，即供者反应性抗体(DRA)。由于早期尚未常规开展HLA配型，且在已行HLA分型的病例中，方法也在不断改进，因此难以与移植前HLA的资料进行比较。
, 百拇医药
讨 论
据器官共享联合网络(UNOS)的统计，影响移植肾长期存活的因素按程度排序依次为PRA、HLA-B及DR的错配、移植次数、移植前输血、供者年龄和种族差异[1]。肾移植受者在接受了HLA不同的供肾后，体内产生抗HLA抗体而成为致敏状态。致敏不但与急性排斥有关，而且与慢性排斥及长期存活率也有关。Kerman等[2]报告肾移植受者sHLA-IgG阳性与术后12个月内排斥反应和1～3年存活率具有明显的相关性(P<0.01)。Barr等[3]报告sHLA-IgG对同种心、肾移植长期存活率存在明显的影响，术后1年若sHLA-IgG阳性，移植肾的5年存活率为53%，而阴性者的存活率为70%。Kerman等[4]还报告了在发生慢性排斥的患者中，63%的受者致敏，而无排斥的受者只有6%的致敏，说明致敏与慢性排斥有关。我们的结果显示，高度致敏及Ⅰ 、Ⅱ类抗原同时致敏与肾功能受损有关。因此，无论是在移植前致敏还是在移植后致敏，都对肾功能和长期存活率产生不利影响。
, http://www.100md.com
检测PRA的方法很多，经典的有Amos方法、抗人球蛋白法(AHG)和美国国立卫生研究院法(NIH)，90年代又出现了流式细胞分析法(FCXM)[5]，这些方法只能检测到与补体结合的抗体，且需要活的淋巴细胞。1995年，美国5大著名实验室联合研制的PRA-STAT法，克服了上述缺点，但尚不能区分Ⅰ、Ⅱ类抗体[6]。1998年推出LAT检测系统，它的原理是将纯化的HLA Ⅰ、Ⅱ类抗原分别包被在Terasaki微板的不同孔内，其中Ⅰ类抗原70个，包被28孔，Ⅱ类抗原24个，包被12孔，每块板均设有空白及阴、阳性对照，可同时检测2份样本。如果待检血清中存在HLA抗体，此抗体便与相应孔内的抗原结合，通过分析阳性孔的数目和分布格局，不但可以计算出阳性样本抗体的百分率，而且能区分Ⅰ、Ⅱ类抗体，还能分析抗体的特异性。通过多次使用，我们认为LAT操作简捷，灵敏度高，重复性好，结果可靠，适合临床应用。
有研究结果显示，移植后抗体的产生与嵌合状态的形成有关，嵌合体可能扮演了同种抗原的角色[7]。供者器官进入受者体内后，打破了受者体内固有的免疫平衡状态，随着移植时间的延长，供、受者之间由激烈对抗逐渐趋向和谐共存的新平衡，供者器官的抗原性也逐渐减弱，但由于形成了嵌合体，受者就会不断产生针对供者的抗体[7]。此种观点与嵌合有利于免疫耐受形成的理论明显不同，有关致敏与嵌合体的关系还需要深入地研究。
, http://www.100md.com
本研究结果提示我们，经常检测移植患者的sHLA-IgG具有重要的临床意义，它可以作为评价受者免疫状态的一项指标。由于高度致敏与移植肾功能受损有关，因此受者若处在高度致敏状态，应严密监测移植肾功能，必要时调整免疫抑制剂或采取去除抗体的措施，如血浆置换、免疫吸附等。HLA Ⅱ类抗原是致敏的主要因素，故应重视移植前的组织配型，特别是HLA Ⅱ类抗原的配型，以避免术后产生抗体。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870706)
作者单位：肖家全(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
唐孝达(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
王祥慧(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
徐达(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
, http://www.100md.com
周佩军(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
丁言德(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
沈瑾(200080 上海市第一人民医院泌尿外科 肾脏移植中心)
参考文献
[1]Smith JD, Danskine AJ, Rose ML, et al. Specificity of lymphocytoxic antibodies formed after cardiac transplantation and correlation with rejection episodes. Transplantation, 1992, 6:1358-1360.
[2]Kerman R, Susskind B, Buelow R, et al. Correlation of ELISA-detected IgG and IgA anti-HLA antibodies in pretransplant sera with renal allograft rejection. Transplantation, 1996, 62:201-203.
, 百拇医药
[3]Barr ML, Cohen DJ, Benvenisty AI, et al. Effect of anti-HLA antibodies on the long-term survival of heart and kidney allografts. Transplant Proc, 1993, 25(1 pt 1):262-264.
[4]Kerman R, Susskind B, Kerman M, et al. ELISA-detected anti-HLA antibodies in posttransplant renal allograft recipient sera correlate with chronic rejection. In: Paul L， Terasaki，eds. Visuals of The 11th Clinical Histocompatibility Workshop， Bahamas, 1996, March. 8-9.
, 百拇医药
[5]Orosz C, Hennessy P, Pelletier R, et al. Comparison of cross-match methodologies. In: Paul L， Terasaki，eds. Visuals of The 11th Clinical Histocompatibility Workshop， Bahamas, 1996,March. 34-35.
[6]Buolow R, Mercier I, Glanville L, et al. Detection of panel-reactive anti-HLA class I antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay or lymphocytotoxicity: results of a blinded, controlled multicenter study. Human Immunol, 1995, 44:1.
[7]Okasha KM, Al-Tweigeri TA, Jurado AV, et al. Analysis of the relationship between chimerism and the allogeneic humoral response. Transplantation, 1998, 66:1028-1033.
收稿日期：2000-03-03, 百拇医药