白血病抑制因子在早孕蜕膜组织中的表达
王琳 史常旭 俞炽阳
摘要 目的：探讨白血病抑制因子(LIF) mRNA及其蛋白在人类早孕蜕膜组织中的表达及定位。方法：采用原位杂交及免疫组织化学方法对16例正常早孕妇女蜕膜组织中的LIF mRNA及其蛋白的表达进行研究。结果：全部早孕蜕膜组织标本中腺体及间质均有LIF mRNA及其蛋白表达，腺体中LIF基因表达高于基质。结论：人类蜕膜组织中LIF表达可能与胚泡着床、维持胎盘功能和促进胚胎发育有关。
关键词：淋巴因子 生长抑制物 蜕膜 RNA，信使
白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)是一种具有多种生物学活性的分泌型糖蛋白，因其能抑制鼠M1白血病细胞系生长而得名。LIF调节多种细胞的生长与分化，如胚胎干细胞、原始生殖细胞、肝细胞、内皮细胞等[1]。已经证实小鼠子宫内膜LIF基因表达是胚泡成功植入的关键因素[2]，但LIF在人类胚胎着床及发育过程中的作用尚不清楚。本研究应用特异的LIF探针及LIF抗体，采用原位杂交及免疫组织化学(免疫组化)技术，研究人类早孕蜕膜组织中LIF mRNA及其蛋白的表达及定位。
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资料与方法
一、标本与试剂
1.标本来源：选择1998年11月在第三军医大学西南医院行人工流产术的16例健康早孕妇女，年龄20～26岁，停经42～56 d，平均(49.2±2.2) d，行人工流产术后即刻取吸出物中的蜕膜组织，并用4%多聚甲醛固定24 h，再置入20%蔗糖中脱水过夜，采用冰冻及石蜡切片，分别进行免疫组化染色和原位杂交。
2.试剂：羊抗人LIF多克隆抗体为美国Santa Cruz生化试剂公司产品，链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接(SP)试剂盒为武汉博士德公司产品。原位杂交探针为含40个碱基对的寡核苷酸探针，根据人类基因数据库中LIF cDNA序列而设计模板，由上海生物制品研究所DNA合成仪合成，3′终末标记地高辛-11-dUTP，-20℃贮存备用。
二、方法
, 百拇医药
1.免疫组化：免疫组化采用SP法。以未加抗-LIF者为阴性对照，操作按试剂盒说明书进行。在排除非特异着色情况下，光镜下见细胞内出现棕黄色颗粒为阳性。
2.原位杂交：切片经蛋白酶K消化后漂洗，滴加地高辛标记的LIF基因探针，42℃杂交16 h，漂洗后滴加抗地高辛抗血清(工作浓度1∶1 000)，显色后封片，以未加LIF探针的组织切片作为阴性对照。在排除非特异着色的情况下，光镜下见胞浆内出现紫蓝色为阳性反应。
结果
一、蜕膜组织原位杂交检测结果
全部早孕蜕膜组织标本LIF mRNA呈现阳性表达，染色位于胞浆中，胞浆染成紫蓝色，蜕膜组织中腺体及间质均有LIF mRNA阳性染色，腺体染色强度大于间质。见图1。
图1 早孕蜕膜组织中LIF mRNA表达阳性。原位杂交×200
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二、蜕膜组织免疫组化检测结果
全部早孕蜕膜标本中LIF蛋白呈阳性表达，细胞核和细胞浆中均可见棕黄色物质，但以胞核为主。蜕膜组织中腺体及间质均有LIF蛋白阳性染色，腺上皮染色强度大于间质。见图2。
图1 早孕蜕膜组织中LIF蛋白表达阳性。免疫组化染色×400
讨论
一、LIF与胚泡着床
胚泡着床是建立妊娠的第一步。成功的胚泡着床和妊娠的继续，依赖于蜕膜和胎盘之间适当的物质交换，这种交换是在某些细胞因子的调节和控制下进行的，LIF便是一种控制胚胎着床的糖蛋白。动物实验表明，LIF基因表达缺陷的小鼠能产生胚泡，但胚泡不能着床，当将这些胚胎移植到野生型小鼠子宫后，则可正常着床并发育至成体，这表明母体子宫内膜LIF表达对小鼠胚泡着床是必须的[2]。LIF在人类胚胎着床及发育过程中的作用尚不清楚，Charnock-Jones等[3]的研究发现，人类子宫内膜增殖期LIF mRNA表达很低，几乎测不到，在月经周期第19～25天表达达峰值，刚好与正常人胚泡着床时期一致，而且胚泡含有LIF受体，LIF可能通过配体受体结合激发着床，LIF还可刺激滋养细胞分泌纤连蛋白，有促进胚泡与子宫内膜粘附的作用[4]。
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二、LIF与胚胎发育
相关研究表明，LIF在胚胎的生长、发育及分化中起重要的作用，含LIF的条件培养液可促进胚胎发育，加速孵化、提高胚泡存活率，促进滋养细胞增殖和内细胞团的生长，加速囊胚脱透明带[1]。我们的研究表明，人类早孕蜕膜组织中有大量LIF基因表达，腺体表达量高于基质。蜕膜为母体和胎儿的交界面，LIF通过刺激滋养细胞产生绒毛膜促性腺激素[5]，有利于维持胎盘功能和促进胚胎的生长与发育。
总之，LIF在人类胚胎着床及发育过程中起着重要的作用，但其作用机理和调节因素尚不清楚，值得进一步探讨，多次胚胎着床失败所致不孕患者是否存在LIF表达缺陷以及LIF拮抗剂能否有效抑制着床，也将是计划生育研究的新领域。
作者单位：王 琳(重庆，第三军医大学西南医院妇产科400038 )
, 百拇医药 史常旭(重庆，第三军医大学西南医院妇产科400038 )
俞炽阳(重庆，第三军医大学西南医院妇产科400038 )
参考文献
1 Senturk LM, Arici A. Leukemia inhibitory factor in human reproduction. Am J Reprod Immunol, 1998, 39: 144-151.
2 Stewart CL, Kaspar P, Brunet LJ, et al. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukemia inhibitory factor. Nature, 1992, 359: 76-79.
, http://www.100md.com
3 Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Fenwick P, et al. Leukemia inhibitory factor mRNA concentration peaks in human endometrium at the time of implantation and the blastocyst contains mRNA for the receptor at this time. J Reprod Fertil, 1994, 101: 421-426.
4 Nachtigall AJ, Kliman HJ, Feinberg RF, et al. The effect of leukemia inhibitory factor (LIF) on trophoblast differentiation: a potential role in human implantation. J Clin Endocrinol Metab, 1996, 81: 801-806.
5 Sawal K, Matsuzaki N, Kameda T, et al. Leukemia inhibitory factor produced at the fetomaternal interface stimulates chorionic genadotropin production: its possible implication during pregnancy, including implantation period. J Clin Endocrinol Metab, 1995, 80: 1449-1456., 百拇医药
摘要 目的：探讨白血病抑制因子(LIF) mRNA及其蛋白在人类早孕蜕膜组织中的表达及定位。方法：采用原位杂交及免疫组织化学方法对16例正常早孕妇女蜕膜组织中的LIF mRNA及其蛋白的表达进行研究。结果：全部早孕蜕膜组织标本中腺体及间质均有LIF mRNA及其蛋白表达，腺体中LIF基因表达高于基质。结论：人类蜕膜组织中LIF表达可能与胚泡着床、维持胎盘功能和促进胚胎发育有关。
关键词：淋巴因子 生长抑制物 蜕膜 RNA，信使
白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)是一种具有多种生物学活性的分泌型糖蛋白，因其能抑制鼠M1白血病细胞系生长而得名。LIF调节多种细胞的生长与分化，如胚胎干细胞、原始生殖细胞、肝细胞、内皮细胞等[1]。已经证实小鼠子宫内膜LIF基因表达是胚泡成功植入的关键因素[2]，但LIF在人类胚胎着床及发育过程中的作用尚不清楚。本研究应用特异的LIF探针及LIF抗体，采用原位杂交及免疫组织化学(免疫组化)技术，研究人类早孕蜕膜组织中LIF mRNA及其蛋白的表达及定位。
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资料与方法
一、标本与试剂
1.标本来源：选择1998年11月在第三军医大学西南医院行人工流产术的16例健康早孕妇女，年龄20～26岁，停经42～56 d，平均(49.2±2.2) d，行人工流产术后即刻取吸出物中的蜕膜组织，并用4%多聚甲醛固定24 h，再置入20%蔗糖中脱水过夜，采用冰冻及石蜡切片，分别进行免疫组化染色和原位杂交。
2.试剂：羊抗人LIF多克隆抗体为美国Santa Cruz生化试剂公司产品，链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接(SP)试剂盒为武汉博士德公司产品。原位杂交探针为含40个碱基对的寡核苷酸探针，根据人类基因数据库中LIF cDNA序列而设计模板，由上海生物制品研究所DNA合成仪合成，3′终末标记地高辛-11-dUTP，-20℃贮存备用。
二、方法
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1.免疫组化：免疫组化采用SP法。以未加抗-LIF者为阴性对照，操作按试剂盒说明书进行。在排除非特异着色情况下，光镜下见细胞内出现棕黄色颗粒为阳性。
2.原位杂交：切片经蛋白酶K消化后漂洗，滴加地高辛标记的LIF基因探针，42℃杂交16 h，漂洗后滴加抗地高辛抗血清(工作浓度1∶1 000)，显色后封片，以未加LIF探针的组织切片作为阴性对照。在排除非特异着色的情况下，光镜下见胞浆内出现紫蓝色为阳性反应。
结果
一、蜕膜组织原位杂交检测结果
全部早孕蜕膜组织标本LIF mRNA呈现阳性表达，染色位于胞浆中，胞浆染成紫蓝色，蜕膜组织中腺体及间质均有LIF mRNA阳性染色，腺体染色强度大于间质。见图1。
图1 早孕蜕膜组织中LIF mRNA表达阳性。原位杂交×200
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二、蜕膜组织免疫组化检测结果
全部早孕蜕膜标本中LIF蛋白呈阳性表达，细胞核和细胞浆中均可见棕黄色物质，但以胞核为主。蜕膜组织中腺体及间质均有LIF蛋白阳性染色，腺上皮染色强度大于间质。见图2。
图1 早孕蜕膜组织中LIF蛋白表达阳性。免疫组化染色×400
讨论
一、LIF与胚泡着床
胚泡着床是建立妊娠的第一步。成功的胚泡着床和妊娠的继续，依赖于蜕膜和胎盘之间适当的物质交换，这种交换是在某些细胞因子的调节和控制下进行的，LIF便是一种控制胚胎着床的糖蛋白。动物实验表明，LIF基因表达缺陷的小鼠能产生胚泡，但胚泡不能着床，当将这些胚胎移植到野生型小鼠子宫后，则可正常着床并发育至成体，这表明母体子宫内膜LIF表达对小鼠胚泡着床是必须的[2]。LIF在人类胚胎着床及发育过程中的作用尚不清楚，Charnock-Jones等[3]的研究发现，人类子宫内膜增殖期LIF mRNA表达很低，几乎测不到，在月经周期第19～25天表达达峰值，刚好与正常人胚泡着床时期一致，而且胚泡含有LIF受体，LIF可能通过配体受体结合激发着床，LIF还可刺激滋养细胞分泌纤连蛋白，有促进胚泡与子宫内膜粘附的作用[4]。
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二、LIF与胚胎发育
相关研究表明，LIF在胚胎的生长、发育及分化中起重要的作用，含LIF的条件培养液可促进胚胎发育，加速孵化、提高胚泡存活率，促进滋养细胞增殖和内细胞团的生长，加速囊胚脱透明带[1]。我们的研究表明，人类早孕蜕膜组织中有大量LIF基因表达，腺体表达量高于基质。蜕膜为母体和胎儿的交界面，LIF通过刺激滋养细胞产生绒毛膜促性腺激素[5]，有利于维持胎盘功能和促进胚胎的生长与发育。
总之，LIF在人类胚胎着床及发育过程中起着重要的作用，但其作用机理和调节因素尚不清楚，值得进一步探讨，多次胚胎着床失败所致不孕患者是否存在LIF表达缺陷以及LIF拮抗剂能否有效抑制着床，也将是计划生育研究的新领域。
作者单位：王 琳(重庆，第三军医大学西南医院妇产科400038 )
, 百拇医药 史常旭(重庆，第三军医大学西南医院妇产科400038 )
俞炽阳(重庆，第三军医大学西南医院妇产科400038 )
参考文献
1 Senturk LM, Arici A. Leukemia inhibitory factor in human reproduction. Am J Reprod Immunol, 1998, 39: 144-151.
2 Stewart CL, Kaspar P, Brunet LJ, et al. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukemia inhibitory factor. Nature, 1992, 359: 76-79.
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3 Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Fenwick P, et al. Leukemia inhibitory factor mRNA concentration peaks in human endometrium at the time of implantation and the blastocyst contains mRNA for the receptor at this time. J Reprod Fertil, 1994, 101: 421-426.
4 Nachtigall AJ, Kliman HJ, Feinberg RF, et al. The effect of leukemia inhibitory factor (LIF) on trophoblast differentiation: a potential role in human implantation. J Clin Endocrinol Metab, 1996, 81: 801-806.
5 Sawal K, Matsuzaki N, Kameda T, et al. Leukemia inhibitory factor produced at the fetomaternal interface stimulates chorionic genadotropin production: its possible implication during pregnancy, including implantation period. J Clin Endocrinol Metab, 1995, 80: 1449-1456., 百拇医药