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编号:10500275
葡糖基转移酶的分子结构及功能研究进展
http://www.100md.com 国外医学口腔医学分册 2000年1月第27卷第1期

     葡糖基转移酶的分子结构及功能研究进展

    华西医科大学口腔医学院 黄正蔚 黄晓晶(综述) 周学东 刘天佳(审校)

    摘 要 葡糖基转移酶是变形链球菌(简称变链)的主要链龋因子之一。本文介绍了近年来对葡糖基转移酶分子结构及功能的研究成果。

    关键词:变形链球菌 葡糖基转移酶 分子结构

    龋病是一种牙体硬组织的细菌感染性疾病,变链是公认的主要致龋菌。在对变链致龋机制的研究中,人们逐渐将注意力集中到其产生的葡糖基转移酶上来。

    1 葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTFs)的种类和作用

    通过大量研究,已知变链合成3种GTFs:GtfB(GTF-Ⅰ,162 kD)和GtfC(GTF-SI,149 kD),不依赖外源性葡聚糖前体引物,前者合成以α-1,3糖苷键为主的水不溶性葡聚糖。后者合成含α-1,3糖苷键的水不溶性葡聚糖和低分子量水溶性葡聚糖;GtfD(GTF-S,155 kD)则依赖引物,合成α-1,6水溶性葡聚糖。

    关于3种GTFs在变链致龋过程中所起的作用,目前仍有争议。一些体外实验表明,对于细菌粘附,GtfB和GtfC显得尢为重要。 Tsumori等[1]认为编码GTF-SI的gtfC基因在变链对光滑面的蔗糖依赖性粘附中是最重要的,但近期的动物模型研究又得出新的结论:变链要获得最大限度的致龋力,则3种GTFs缺一不可。同时,3种GTFs的存在方式有所不同:GTF-Ⅰ主要以结合细胞的形式存在于细胞表面,称为细胞结合型(cell-associated)GTF;GTF-S则游离于培养基的上清液中,称非细胞结合型(cell-free)GTF或游离型GTF;GTF-SI的定位尚不清。GTFs的不同存在方式可能对其性质有影响。已有研究表明吸附在唾液包被的羟磷灰石(SHA)表面的GTF和溶液中的GTF存在许多性质差异[2],如热稳定性、活性及活性的pH依赖性、对抑制剂的敏感性等。Steinberg等[3]进一步研究发现吸附在SHA表面的GTFs合成葡聚糖具有始发效应,即葡聚糖产量可在孵育的前15 min显著增高,而在此后6 h内,葡聚糖量不再增加。相反,溶液中葡聚糖的合成量随时间推移呈线性增加,无始发效应。推测吸附在SHA表面的GTFs迅速合成葡聚糖的能力可能在细菌对牙面的定植中起作用,同时也可影响酸、菌斑抑制剂等物质对获得性膜和菌斑的穿透作用。另外的研究还表明,即使是同种GTF,当其存在方式不同时,其产物的结构发生变化。Kopec等[4]报道,溶液中GtfC合成的葡聚糖主要含α-1,6葡萄糖苷键,而同种酶吸附在SHA表面时形成的葡聚却主要含α-1,3葡萄糖苷键。并且用葡聚糖变构水解酶(glucanohydrolases mutanase)和右旋糖苷酶(dextranase)消化不同部位GTFs形成的葡聚糖,发现其敏感性不同,且可溶性终产物也有所不同。这一结果对研究生物膜的自然起源具有重要意义。

    2 GTFs结构与功能分析

    GTFs在分子结构上可大致分为两个结构区:羧基端约2/3肽段葡聚糖结合区(glucanbinding domain,GBD);氨基端1/3肽段蔗糖结合区(sucrose-binding domainm,SBD);GBD和SBD分别负责蔗糖水解和葡聚糖合成。此外在整个分子前端还有个信号肽区。

    2.1 分泌信号肽

    所有GTFs都有一个共同特点,即在N端拥有一个约30个氨基酸残基的信号肽序列,这也与所有分泌性蛋白相类似,可能作为蛋白分子跨膜转运的一个信号序列[5]

    2.2 GBD结构

    GTFs的羧基端由一系列重复单位(directrepeating units,URUs)构成,这些重复序列具有一定的种属特异性,与相关的变链葡聚糖结合蛋白(glucan-binding protein,GBP)、梭状芽孢菌属clostridium difficile毒素,肺炎链球菌溶素(lysins)的多糖结合区都有同源性[6-7]。DRUs是由一个或多个芳香族氨基酸残基(通常为酪氨酸,Y)及甘氨酸(G)构成的[G...YY...G]反复,二者间一般相距3~4个氨基酸[8]。 研究表明并非所有URDs都是实现功能所必需的,针对变链GtfD的5个由65个氨基酸残基构成的DRUs[9]研究发现,只要有4个DURs即可表现出有效的多糖结合能力。同时也发现在这些DRUs上游有一段非特异的氨基酸序列对糖结合有重要意义,某一缺少些序列的突变株仅表现出对多糖极弱的结合能力。对S.gordonii的研究也证明了羧基端DRUs的这些特性[10~11]

    过去的研究将这些重复序列按序列的相似水平划成不同等级,由些在链球菌GTFs与GBP中分出了相应的A,B,C,D四级[12,13],希望能在不同URDs级别中发现不同的功能,但迄今尚无足够证据表明这些结构区具有不同的结合特性。Giffard等提出,DRUs可能是在长期的进化过程中经过多次复制增殖而产生的,其序列相似性的差异仅表现基因分化的原始程度,即越古老的基因,在分化过程中形成的变异就越多。不同级别DRUs可能拥有相同的功能,它们之间并无本质的差异。在DRUs中一些相对保守的氨基酸残基(如G与Y),是长期自然选择的结果,是真正的功能位点。表现出这样多个反复可以显著增强其对多糖的结合能力。

    2.3 SBD结构

    SBD是GTFs的主要功能区之一,这里有更明显的保守序列,也直接关系到酶的活性。并已经从中分离出一系列结构上保守、与酶催化活性密切相关的亚结构域(subdomain)。

    2.3.1 GtfB.1肽段 此肽段最早由Denzbough于1990年从GtfB中分离而得[14]。这一亲水的亚结构域由15个氨基酸残基构成[SAWNSDSEKPFDDHL],并发现这一序列在多数GTFs中高度保守,在GtfB与GtfC中则完全一致,分别位于342-356与368-382位。同一实验还发现这一肽段有很强的免疫原性,其抗血清可以抑制蔗糖合成葡聚糖多聚体,这也是第一次利用抗肽段抗体在体外获得了对GTFs酶活性的抑制。

    此外,该肽段产生的抗体对果糖基转移酶也有抑制作用。进一步比较两酶序列,发现在GtfB.1肽段中有两个非同源的三肽序列是一致的(A-W-N与F-D-D) 。因此这两个三肽序列可能作为产生抑制性抗体的抗原决定簇。

    2.3.2 CAT肽段 这一序列于1991年从远源链球菌中分离而得[15]。已证实所有GTFs都有此序列并高度保守,在GtfB与GtfC中分别位于446-454与472-480位。这一序列[DSIRVDAVD]中有三个天冬氨酸残基(D)。用放射性标记的蔗糖作为底物,加入反应体系即快速失活酶后,可观察到标记的糖就结合在第6位的天冬氨酸残基上(GtfB中即为Asp451),提示该天冬氨酸可能作为糖结合的活性位点[16]。现在认为这一天冬氨酸的羧基基团通过稳定碳氧根离子或提供糖苷一酶介质而调节葡糖苷向水或其他受体转动的过程,因而与酶的活性密切相关。这一序列在许多α葡糖苷酶与转移酶中也都相当保守,在肠蔗糖-异麦芽糖酶中也发现有同样的序列存在。这一序列在原核生物、真核生物和动植物中都广泛存在。

    2.3.3 Gtf-P1肽段 Chia等于1993年从gtfB与gtfC基因的一个多形性区域编码产物分离获得此肽段[7]。该序列也有高度保守性,尽管基因的核酸序列可有变化但不会影响氨基酸的序列,对酶活性与蔗糖依赖性粘附功能十分重要。

    这一序列[ANDVDNSNPVVQAEQLN WL]在GtfB与GtfC中分别位于409-427与432-453位。采用点突变技术将变链GtfB此肽段第413位天冬氨酸(Asp413) 替换成苏氨酸后,可使酶活性降至12%[18]。Chia等[19]进一步研究发现,Asp413变异的GTF对蔗糖的米氏常数Km并没有改变,提示这一变异并未影响到酶与底物的亲和力,推测Asp413可能并非蔗糖的结合位点,而只作为一个质了供体参与反应。通过肽链序列的比较发现围绕这一催化位点Asp413的氨基酸序列在所有变链中都是高度保守的,而且与前述CAT肽段内活性位点Asp451周围序列也有一定的相似性。[Gtf-p1:DVDN;CAT:D(A)VDN]

    用GtfB此单位附近的肽段GCY(402-420)、AND(409-427)与SAND(409-420)免疫产生的抗体,不但可以识别GTFs,也能抑制酶活性[20]。进一步研究发现含有这19个氨基酸残基的Gtf-P1肽段是一个参与体液免疫应答的B细胞抗原决定簇,且抗体水平与疾病活性也密切相关[21]

    2.4 催化区空间结构

    Smith等[20]采用X线衍射晶体分析法分析了α-淀粉酶族的葡糖苷酸结构发现其催化区都是(β/α)8-管状结构域,比较变链GTFs与白联球菌属(Leuconostoc mesenteroides)的蔗糖-6-葡糖基转移酶,发现两者催化域仅有极少的变化,因而推测GTFs催化结构域也有这一结构。基于这一假说,GTFs可能就有多个催化活性位点[22],这8个β丝状结构都可能作为催化活性的关键氨基酸残基。事实上CAT与Gtf-P1及以前研究发现的功能位点His561、Trp491都位于这一理论上的(β/α)8-管状结构上[18]

    随着对GTFs结构和功能关系的深入研究,与酶活性相关高度保守的一些氨基酸序列已基本清楚,将为研制安全、高效的GTFs防龋疫苗提供了分子基础。, http://www.100md.com
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