猪供人异种移植超急性排斥反应体外实验模型的初步研究
猪供人异种移植超急性排斥反应体外实验模型的初步研究
满国彤 张同琳 周孝思
摘 要：目的：研究通过转基因方法在猪主动脉内皮细胞上表达人CD59蛋白，抑制猪供人移植超急性排斥反应。方法：体外培养的猪主动脉和人脐静脉内皮细胞，用免疫荧光和免疫组化的方法得到鉴定。构建含人CD59cDNA的真核细胞表达载体LXSN-CD59，限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳和多聚酶链反应(PCR)法鉴定。脂质体转染法将LXSN-CD59转化进猪血管内皮细胞，G418筛选得到稳定转化子。流式细胞仪筛选得到表达人CD59蛋白最强的细胞克隆，与含有异种活性抗体和补体的人血清或猴血清共孵育，测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率，作为人CD59蛋白的功能活性指标。结果：与未转基因的对照组细胞比较，表达人CD59蛋白组细胞与人血清或猴血清共孵育时，LDH漏出率显著降低(P<0.01)。结论：通过转基因方法在猪血管内皮细胞膜上表达人补体调节蛋白CD59，可抑制异种移植超急性排斥反应。
, 百拇医药
关键词：移植，异种 补体 移植物排斥
异种移植是解决器官移植供者器官来源问题值得探索的途径，现认为猪是较为理想的异种移植器官供者来源。但异种移植必须克服超急性排斥反应。补体系统的激活在异种移植超急性排斥反应中被认为起着关键作用。鉴于此，有人提出通过转基因方法在猪的组织细胞上表达人的补体调节蛋白，从而抑制超急性排斥反应[1]。
为此，我们构建了含人补体调节蛋白CD59cDNA的真核细胞表达载体LXSN-CD59，将其转化进猪血管内皮细胞，得到表达人CD59蛋白的细胞克隆。将这些细胞克隆分别与不同浓度梯度的人或猴血清共同孵育，观察人CD59蛋白对这些细胞克隆保护作用的大小。
材料与方法
1.材料：含人CD59cDNA的质粒pFRSVα-CD59；大肠杆菌菌株Jm109、DH5α及逆转录病毒表达载体pLXSN；EcoRI、BamHI限制性内切酶，T4DNA连接酶，牛小肠碱性磷酸酶，蛋白酶K,不含DNA酶的RNA酶，胰酶，胶原酶I型；实验用小型猪，人脐带，肝素钠，DMEM培养基，M199培养基，胎牛血清，小牛血清，DiI-Ac-LDL，内皮细胞生长因子，脂质体G418，小鼠抗人CD59单克隆抗体，羊抗小鼠IgG(FITC标记)。
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2.实验方法：(1)LXSN-CD59逆转录病毒表达载体的构建、扩增、纯化、及鉴定：EcoRI酶切质粒pFRSVα-CD59，得到476 bp的人CD59cDNA，低溶点琼脂糖凝胶电泳回收CD59cDNA；EcoRI酶切pLXSN逆转录病毒表达载体，去磷酸化处理。将人CD59cDNA插入到载体pLXSN中。用CaCl2法转染大肠杆菌DH5α，Amp抗性筛选阳性菌落，小量扩增阳性菌落，碱裂解法抽提质粒，分别用EcoRI、BamHI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；选取插入人CD59cDNA且方向正确的克隆进行大量抽提；聚乙二醇8000(PEG8000)沉淀法纯化质粒；紫外分光光度法测定质粒DNA含量，检测波长在260和280处的OD值，估计DNA纯度。(2)细胞培养①用人脐静脉内皮细胞培养：取健康产妇分娩后新鲜脐带，0.25%胰酶消化得到人脐静脉内皮细胞，用M199培养液(含20%胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，内皮细胞生长因子20 μg/ml，肝素钠100 U/ml)混悬细胞接种培养。用相差显微镜观察及人第8因子相关抗原抗血清免疫组化检测加以鉴定。②原代猪主动脉内皮细胞培养：处死实验用小型乳猪，无菌条件下取主动脉，1%胶原酶消化或刀片轻刮血管腔内膜面获得猪主动脉内皮细胞，DMEM培养液(含10%小牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml)混悬细胞接种培养。相差显微镜观察及DiI-AC-LDL染色鉴定。(3)基因转染及转染细胞筛选：脂质体转染法分别将LXSN-CD59、LXSN转化进猪血管内皮细胞，G418筛选(G418剂量从200 μg/ml开始，在2周内升至600 μg/ml)得到阳性细胞克隆，将阳性克隆转移至24孔板，400 μg/ml G418维持，继续培养至80%融合，传代，保种。(4)流式细胞仪测定细胞表面CD59蛋白表达：人脐静脉内皮细胞(阳性对照)、转染及未转染LXSN-CD59的猪血管内皮细胞(阴性对照及转基因实验组)、转染LXSN(控制表达载体影响因素的对照组)的猪血管内皮细胞分别与鼠抗人CD59单克隆抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG共孵育，上流式细胞仪测定细胞表面人CD59蛋白表达情况，得到表达人CD59蛋白的细胞克隆，传代，保种。(5)人CD59蛋白在猪血管内皮细胞表达后功能测定：转基因且表达人CD59蛋白和未转基因之猪血管内皮细胞，分别接种于24孔板，待100%融合时，PBS洗2遍，用DMEM培养基(培养基中分别加入5%、10%、15%、20%、25%人血清或猴血清，每种浓度重复6孔)于5%CO2，95%空气，37℃孵育半小时，吸取培养液，在日立全自动生化分析仪上用速率法测定及记录乳酸脱氢酶(LDH)活性，测量值记为E；未与细胞共孵育但含人或猴血清的培养基中的LDH活性，记为S；不含血清培养基与不同细胞共孵育，其中LDH活性记为N；在无血清培养基中孵育后细胞完全裂解时的LDH活性，记为M。
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在本实验中，LDH漏出率大小反应人血清或猴血清中补体介导的猪血管内皮细胞毒性反应大小，即CD59蛋白对猪血管内皮细胞保护作用的弱或强。
3.统计学处理：所有计量资料用x±s表示，统计方法用双侧t检验。
实验结果
1.人CD59cDNA逆转录病毒表达载体LXSN-CD59的构建及鉴定：从连接反应后转化细菌铺板所得的菌落中，挑选多个克隆，小提后进行EcoRI及BamHI酶切鉴定。EcoRI酶切证实有CD59cDNA片段克隆插入LXSN载体中，而BamHI酶切证实CD59cDNA插入方向正确。PCR方法测定进一步得到证实。
2.LXSN-CD59脂质体介导转染猪血管内皮细胞：利用G418进行阳性克隆细胞筛选。2周内开始出现阳性克隆。
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3.流式细胞仪测定人CD59蛋白在猪血管内皮细胞的表达：正常猪血管内皮细胞、转染对照质粒LXSN的猪血管内皮细胞均不表达人CD59蛋白；而转染LXSN-CD59的猪血管内皮细胞则表达阳性(图1)。
A:人脐静脉内皮细胞为阳性对照。
B：未转染任何基因的猪血管内皮细胞为阴性对照。
C：转染对照质粒LXSN的猪血管内皮细胞。
D：转染LXSN-C59的猪血管内皮细胞
图1 人CD59蛋白在猪血管内皮细胞的表达状况
4.人CD59蛋白在猪血管内皮细胞表达后功能测定：以未转基因的猪血管内皮细胞作为阴性对照，测定结果见表1。实验结果表明，与对照组细胞比较，表达人CD59蛋白的细胞与不同浓度人血清或猴血清共孵育时，其LDH漏出率显著低于对照组(P<0.01)。
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表1 人、猴血清介导的猪血管内皮细胞LDH漏出率(x±s，n=6，%)
组别
培养基中人血清浓度(%)
5
10
15
20
25
LXSN-CD59组
5±2
9±2
11±3
, 百拇医药
13±4
20±5
对照组
12±5
17±6
34±9
49±15
56±16
组别
培养基中猴血清浓度(%)
5
10
15
, 百拇医药
20
25
LXSN-CD59组
7±2
9±3
11±3
17±3
20±5
对照组
12±3
26±6
44±10
52±9
, 百拇医药
64±12
注：与对照组相比均P<0.01讨 论
经过多年研究，现认为猪是较为理想的异种移植器官供者来源。猪的器官移植给人，属非协同性异种移植，首先必须克服超急性排斥反应的问题[2，3]。异种移植超急性排斥反应由受者的天然抗体与供者器官的血管内皮细胞结合，进而激活受者补体系统而引发。移植器官在数分钟至数小时内发生广泛性血管内凝血及实质脏器出血而丧失功能甚致坏死。因此，克服超急性排斥反应的研究也就集中于：(1)去除受者体内的天然抗体；(2)改变供者器官血管内皮细胞的免疫学特性；(3)抑制受者血液内的补体系统的激活[4，5]。Damalsso等[1]最先提出将人的补体调节蛋白在异种动物的血管内皮细胞上表达，以达到抑制异种移植时人血清中补体激活所导致的超急性排斥反应的目的。在正常生理条件下，补体级联反应过程中，补体调节蛋白在补体激活的不同阶段发挥作用，以防止激活的补体损伤机体自身的正常组织。CD59是存在于人和动物的血细胞、内皮细胞膜上的一种补体调节蛋白，作用于补体级联反应的终末阶段，即膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)形成阶段[6]。无论经典途径或替代途径，补体激活的最终阶段均为形成MAC。
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在本实验中，我们成功地构建了人CD59cDNA的表达载体LXSN-CD59，并将其转化进猪血管内皮细胞，通过流式细胞仪筛选得到表达人CD59蛋白的细胞克隆。补体调节蛋白的作用有种属特异性。但有研究者指出，在种系发生上相近的动物，进化较高级动物的补体调节蛋白对较低级动物的补体有调节作用。如人的补体调节蛋白对猴的补体有调节作用，反之则不能[7]。本研究还观察到表达在猪血管内皮细胞上的人补体调节蛋白，除对人血清中补体有抑制作用外，对猴补体也有肯定的抑制作用。利用这一点，可先将表达人补体调节蛋白的猪器官移植给猴，进行异种移植排斥反应的实验研究。
但是，如果始终以猪为对象研究解决异种移植排斥反应，存在成本高，喂养不便，实验操作不便等因素。我们以培养的原代猪血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞为研究对象，建立起一种体外实验模型，以便对异种移植排斥反应进行详细深入的研究和探索。
基金项目：国家自然科学基金资助(39670710，39770764)
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作者单位：满国彤 100085 北京医科大学第三附属医院普外科
张同琳 100085 北京医科大学第三附属医院普外科
周孝思 100085 北京医科大学第三附属医院普外科
参考文献
[1]Damalsso AP, Vercelotti GM, Platt JL,et a l. Inhibition of complement-mediated endothelial cell cytotoxicity by decayacce lerating factor.Transplantation,1991, 52:530-533.
[2]Michaels MG, Simmons RL. Xenotransplant-associated zo onoses: strategies for prevention. Transplantation,1994, 57：1-7.
, 百拇医药
[3]Ye Y, Niekrasz M, Kosanke S, et al. The pig as a po tential organ donor for man: a study of potentially transferable disease from do nor pig to recipient man. Trasplantation,1994, 57∶694-703.
[4]Tearle RG, Tange MJ, Zannettlno ZL,et al. The α-1,3 -galactosyltransferase knockout mouse: implications for xenotransplantation. Tr ansplantation, 1996,61:13-19.
[5]Byrne GW, McCarrg KR, Martin MJ,et al. Transgenic pigs expressing human CD59 and decay-accelerating factor produce an intrinsic barrier to complement-mediated damage. Transplantation, 1997, 63:149-155.
, 百拇医药
[6]Böttger EC, Bitter-Suermann D. Complement and the r egulation of humoral immune response. Immunol Today, 1987, 8:261-264.
[7]Rollins SA, Zhao J, Ninomiya H, et al. Inhibition of h omologous complement by CD59 is mediated by a species selective recognit ion conferred through binding to C8 within C3b-8 or C9 within C5b-9. J Immunol , 1991, 146:2345-2351., 百拇医药
满国彤 张同琳 周孝思
摘 要：目的：研究通过转基因方法在猪主动脉内皮细胞上表达人CD59蛋白，抑制猪供人移植超急性排斥反应。方法：体外培养的猪主动脉和人脐静脉内皮细胞，用免疫荧光和免疫组化的方法得到鉴定。构建含人CD59cDNA的真核细胞表达载体LXSN-CD59，限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳和多聚酶链反应(PCR)法鉴定。脂质体转染法将LXSN-CD59转化进猪血管内皮细胞，G418筛选得到稳定转化子。流式细胞仪筛选得到表达人CD59蛋白最强的细胞克隆，与含有异种活性抗体和补体的人血清或猴血清共孵育，测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率，作为人CD59蛋白的功能活性指标。结果：与未转基因的对照组细胞比较，表达人CD59蛋白组细胞与人血清或猴血清共孵育时，LDH漏出率显著降低(P<0.01)。结论：通过转基因方法在猪血管内皮细胞膜上表达人补体调节蛋白CD59，可抑制异种移植超急性排斥反应。
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关键词：移植，异种 补体 移植物排斥
异种移植是解决器官移植供者器官来源问题值得探索的途径，现认为猪是较为理想的异种移植器官供者来源。但异种移植必须克服超急性排斥反应。补体系统的激活在异种移植超急性排斥反应中被认为起着关键作用。鉴于此，有人提出通过转基因方法在猪的组织细胞上表达人的补体调节蛋白，从而抑制超急性排斥反应[1]。
为此，我们构建了含人补体调节蛋白CD59cDNA的真核细胞表达载体LXSN-CD59，将其转化进猪血管内皮细胞，得到表达人CD59蛋白的细胞克隆。将这些细胞克隆分别与不同浓度梯度的人或猴血清共同孵育，观察人CD59蛋白对这些细胞克隆保护作用的大小。
材料与方法
1.材料：含人CD59cDNA的质粒pFRSVα-CD59；大肠杆菌菌株Jm109、DH5α及逆转录病毒表达载体pLXSN；EcoRI、BamHI限制性内切酶，T4DNA连接酶，牛小肠碱性磷酸酶，蛋白酶K,不含DNA酶的RNA酶，胰酶，胶原酶I型；实验用小型猪，人脐带，肝素钠，DMEM培养基，M199培养基，胎牛血清，小牛血清，DiI-Ac-LDL，内皮细胞生长因子，脂质体G418，小鼠抗人CD59单克隆抗体，羊抗小鼠IgG(FITC标记)。
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2.实验方法：(1)LXSN-CD59逆转录病毒表达载体的构建、扩增、纯化、及鉴定：EcoRI酶切质粒pFRSVα-CD59，得到476 bp的人CD59cDNA，低溶点琼脂糖凝胶电泳回收CD59cDNA；EcoRI酶切pLXSN逆转录病毒表达载体，去磷酸化处理。将人CD59cDNA插入到载体pLXSN中。用CaCl2法转染大肠杆菌DH5α，Amp抗性筛选阳性菌落，小量扩增阳性菌落，碱裂解法抽提质粒，分别用EcoRI、BamHI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；选取插入人CD59cDNA且方向正确的克隆进行大量抽提；聚乙二醇8000(PEG8000)沉淀法纯化质粒；紫外分光光度法测定质粒DNA含量，检测波长在260和280处的OD值，估计DNA纯度。(2)细胞培养①用人脐静脉内皮细胞培养：取健康产妇分娩后新鲜脐带，0.25%胰酶消化得到人脐静脉内皮细胞，用M199培养液(含20%胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，内皮细胞生长因子20 μg/ml，肝素钠100 U/ml)混悬细胞接种培养。用相差显微镜观察及人第8因子相关抗原抗血清免疫组化检测加以鉴定。②原代猪主动脉内皮细胞培养：处死实验用小型乳猪，无菌条件下取主动脉，1%胶原酶消化或刀片轻刮血管腔内膜面获得猪主动脉内皮细胞，DMEM培养液(含10%小牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml)混悬细胞接种培养。相差显微镜观察及DiI-AC-LDL染色鉴定。(3)基因转染及转染细胞筛选：脂质体转染法分别将LXSN-CD59、LXSN转化进猪血管内皮细胞，G418筛选(G418剂量从200 μg/ml开始，在2周内升至600 μg/ml)得到阳性细胞克隆，将阳性克隆转移至24孔板，400 μg/ml G418维持，继续培养至80%融合，传代，保种。(4)流式细胞仪测定细胞表面CD59蛋白表达：人脐静脉内皮细胞(阳性对照)、转染及未转染LXSN-CD59的猪血管内皮细胞(阴性对照及转基因实验组)、转染LXSN(控制表达载体影响因素的对照组)的猪血管内皮细胞分别与鼠抗人CD59单克隆抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG共孵育，上流式细胞仪测定细胞表面人CD59蛋白表达情况，得到表达人CD59蛋白的细胞克隆，传代，保种。(5)人CD59蛋白在猪血管内皮细胞表达后功能测定：转基因且表达人CD59蛋白和未转基因之猪血管内皮细胞，分别接种于24孔板，待100%融合时，PBS洗2遍，用DMEM培养基(培养基中分别加入5%、10%、15%、20%、25%人血清或猴血清，每种浓度重复6孔)于5%CO2，95%空气，37℃孵育半小时，吸取培养液，在日立全自动生化分析仪上用速率法测定及记录乳酸脱氢酶(LDH)活性，测量值记为E；未与细胞共孵育但含人或猴血清的培养基中的LDH活性，记为S；不含血清培养基与不同细胞共孵育，其中LDH活性记为N；在无血清培养基中孵育后细胞完全裂解时的LDH活性，记为M。
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在本实验中，LDH漏出率大小反应人血清或猴血清中补体介导的猪血管内皮细胞毒性反应大小，即CD59蛋白对猪血管内皮细胞保护作用的弱或强。
3.统计学处理：所有计量资料用x±s表示，统计方法用双侧t检验。
实验结果
1.人CD59cDNA逆转录病毒表达载体LXSN-CD59的构建及鉴定：从连接反应后转化细菌铺板所得的菌落中，挑选多个克隆，小提后进行EcoRI及BamHI酶切鉴定。EcoRI酶切证实有CD59cDNA片段克隆插入LXSN载体中，而BamHI酶切证实CD59cDNA插入方向正确。PCR方法测定进一步得到证实。
2.LXSN-CD59脂质体介导转染猪血管内皮细胞：利用G418进行阳性克隆细胞筛选。2周内开始出现阳性克隆。
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3.流式细胞仪测定人CD59蛋白在猪血管内皮细胞的表达：正常猪血管内皮细胞、转染对照质粒LXSN的猪血管内皮细胞均不表达人CD59蛋白；而转染LXSN-CD59的猪血管内皮细胞则表达阳性(图1)。
A:人脐静脉内皮细胞为阳性对照。
B：未转染任何基因的猪血管内皮细胞为阴性对照。
C：转染对照质粒LXSN的猪血管内皮细胞。
D：转染LXSN-C59的猪血管内皮细胞
图1 人CD59蛋白在猪血管内皮细胞的表达状况
4.人CD59蛋白在猪血管内皮细胞表达后功能测定：以未转基因的猪血管内皮细胞作为阴性对照，测定结果见表1。实验结果表明，与对照组细胞比较，表达人CD59蛋白的细胞与不同浓度人血清或猴血清共孵育时，其LDH漏出率显著低于对照组(P<0.01)。
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表1 人、猴血清介导的猪血管内皮细胞LDH漏出率(x±s，n=6，%)
组别
培养基中人血清浓度(%)
5
10
15
20
25
LXSN-CD59组
5±2
9±2
11±3
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13±4
20±5
对照组
12±5
17±6
34±9
49±15
56±16
组别
培养基中猴血清浓度(%)
5
10
15
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20
25
LXSN-CD59组
7±2
9±3
11±3
17±3
20±5
对照组
12±3
26±6
44±10
52±9
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64±12
注：与对照组相比均P<0.01讨 论
经过多年研究，现认为猪是较为理想的异种移植器官供者来源。猪的器官移植给人，属非协同性异种移植，首先必须克服超急性排斥反应的问题[2，3]。异种移植超急性排斥反应由受者的天然抗体与供者器官的血管内皮细胞结合，进而激活受者补体系统而引发。移植器官在数分钟至数小时内发生广泛性血管内凝血及实质脏器出血而丧失功能甚致坏死。因此，克服超急性排斥反应的研究也就集中于：(1)去除受者体内的天然抗体；(2)改变供者器官血管内皮细胞的免疫学特性；(3)抑制受者血液内的补体系统的激活[4，5]。Damalsso等[1]最先提出将人的补体调节蛋白在异种动物的血管内皮细胞上表达，以达到抑制异种移植时人血清中补体激活所导致的超急性排斥反应的目的。在正常生理条件下，补体级联反应过程中，补体调节蛋白在补体激活的不同阶段发挥作用，以防止激活的补体损伤机体自身的正常组织。CD59是存在于人和动物的血细胞、内皮细胞膜上的一种补体调节蛋白，作用于补体级联反应的终末阶段，即膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)形成阶段[6]。无论经典途径或替代途径，补体激活的最终阶段均为形成MAC。
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在本实验中，我们成功地构建了人CD59cDNA的表达载体LXSN-CD59，并将其转化进猪血管内皮细胞，通过流式细胞仪筛选得到表达人CD59蛋白的细胞克隆。补体调节蛋白的作用有种属特异性。但有研究者指出，在种系发生上相近的动物，进化较高级动物的补体调节蛋白对较低级动物的补体有调节作用。如人的补体调节蛋白对猴的补体有调节作用，反之则不能[7]。本研究还观察到表达在猪血管内皮细胞上的人补体调节蛋白，除对人血清中补体有抑制作用外，对猴补体也有肯定的抑制作用。利用这一点，可先将表达人补体调节蛋白的猪器官移植给猴，进行异种移植排斥反应的实验研究。
但是，如果始终以猪为对象研究解决异种移植排斥反应，存在成本高，喂养不便，实验操作不便等因素。我们以培养的原代猪血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞为研究对象，建立起一种体外实验模型，以便对异种移植排斥反应进行详细深入的研究和探索。
基金项目：国家自然科学基金资助(39670710，39770764)
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作者单位：满国彤 100085 北京医科大学第三附属医院普外科
张同琳 100085 北京医科大学第三附属医院普外科
周孝思 100085 北京医科大学第三附属医院普外科
参考文献
[1]Damalsso AP, Vercelotti GM, Platt JL,et a l. Inhibition of complement-mediated endothelial cell cytotoxicity by decayacce lerating factor.Transplantation,1991, 52:530-533.
[2]Michaels MG, Simmons RL. Xenotransplant-associated zo onoses: strategies for prevention. Transplantation,1994, 57：1-7.
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[3]Ye Y, Niekrasz M, Kosanke S, et al. The pig as a po tential organ donor for man: a study of potentially transferable disease from do nor pig to recipient man. Trasplantation,1994, 57∶694-703.
[4]Tearle RG, Tange MJ, Zannettlno ZL,et al. The α-1,3 -galactosyltransferase knockout mouse: implications for xenotransplantation. Tr ansplantation, 1996,61:13-19.
[5]Byrne GW, McCarrg KR, Martin MJ,et al. Transgenic pigs expressing human CD59 and decay-accelerating factor produce an intrinsic barrier to complement-mediated damage. Transplantation, 1997, 63:149-155.
, 百拇医药
[6]Böttger EC, Bitter-Suermann D. Complement and the r egulation of humoral immune response. Immunol Today, 1987, 8:261-264.
[7]Rollins SA, Zhao J, Ninomiya H, et al. Inhibition of h omologous complement by CD59 is mediated by a species selective recognit ion conferred through binding to C8 within C3b-8 or C9 within C5b-9. J Immunol , 1991, 146:2345-2351., 百拇医药