环孢素A与抗B7-1单克隆抗体联用诱导T淋巴细胞耐受的研究
范祖森 马宝骊
摘 要 目的 探讨抗原特异性无能T淋巴细胞的诱导及其耐受特性。方法 在体外建立抗原递呈细胞-T淋巴细胞-B淋巴细胞反应系统, 利用环孢素A(CsA)与抗B7-1单克隆抗体联用阻断B7:CD28共刺激途径, 采用3H-TdR法检测T淋巴细胞增殖，酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定B淋巴细胞分泌的抗体。 结果 CsA与抗B7-1单克隆抗体联用可诱致T淋巴细胞无能，无能T淋巴细胞不产生白细胞介素2(IL-2)；外源性IL-2能阻止T淋巴细胞无能的诱导，但不能逆转这一耐受状态。 结论 CsA与抗B7-1单克隆抗体联用可以诱导T淋巴细胞的抗原特异性耐受。
关键词：环孢菌素 抗体，单克隆 免疫耐受
大量实验表明, T淋巴细胞接受抗原递呈细胞(APC)递呈的MHC-抗原肽信号后, 如缺乏某些共刺激信号，则T淋巴细胞不能活化，而处于无能状态[1]。研究证实，B7:CD28是T淋巴细胞活化的主要共刺激信号[2,3]。B7分子是CD28/CTLA4的天然配体,目前发现的有B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3, 主要表达于APC细胞表面。我们利用抗B7-1单克隆抗体阻断B7:CD28共刺激信号，并与环孢素A(CsA)联用，观察其在体外诱导抗原特异性T淋巴细胞耐受的效果, 并对其特性及耐受机制进行了探讨。
, 百拇医药
材料与方法
一、 实验材料
健康人外周血购自上海市血液中心；淋巴细胞分层液由上海试剂二厂出品；破伤风内毒素(TT)由中国科学院上海细胞生物学研究所叶敏教授惠赠；结核杆菌纯蛋白衍生物(PPD)购自卫生部北京生物制品研究所；抗B7-1单克隆抗体(BB1单克隆抗体)、抗细胞间粘附分子1单克隆抗体(抗ICAM-1单克隆抗体)和抗CD3单克隆抗体(G19-4)由美国华盛顿大学EA.Clark 教授惠赠；CsA为瑞士Sandoz公司产品；2-溴化异脲氨基乙醇(AET)、丝裂霉素C(mito-C)、植物血凝素(PHA)及商陆促分裂原(PWM)均为Sigma公司产品；白细胞介素2(IL-2)为华新生物工程公司产品；生物素标记的Ig、酶标亲和素、FITC-羊抗鼠Ig均购自华美公司。
二、实验方法
1. APC及T淋巴细胞的分离：采用AET法。取新鲜绵羊红细胞(SRBC)，洗涤后, 用浓度为0.14mol/L的 AET处理〔SRBC与AET的比例为(5～10)∶1〕，37℃放置15min，离心，洗涤后配成2%的SRBC悬液。新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC), 加入等量的2% SRBC悬液，冰浴1h, 上淋巴细胞分层液分离, 上层作为APC，沉于管底的为T淋巴细胞和SRBC, 用红细胞裂解液(ACK)溶解SRBC, 所得即为T淋巴细胞，采用抗CD3单克隆抗体经荧光激活的细胞分类仪(FACS)鉴定其纯度为90%左右, 台酚蓝染色示活细胞>90%。
, 百拇医药
2. 特异性抗原诱导T淋巴细胞增殖反应的测定：APC经mito-C处理后, 再与TT(10mg/L)或PPD(15mg/L)混合培养过夜, 洗涤3次，然后将APC上样至96孔板中(2×104/孔)，加入T淋巴细胞(5×104/孔)，然后按分组要求(见表1)分别加入抗B7-1单克隆抗体(10mg/L)和/或CsA(500μg/L), 培养7d, 用H3-TdR掺入法检测T淋巴细胞的增殖反应。抗B7-1单克隆抗体和CsA联用诱导的T淋巴细胞即为无能T淋巴细胞。并分别于培养24h、48h、72h收集上清液, 测定IL-2的浓度(生物活性检测法)。
3. 混合同种异体淋巴细胞增殖反应的测定：经mito-C处理和未处理的无能T淋巴细胞加入96孔板(1×105/孔)，再加入同种异体淋巴细胞(1×105/孔)，培养7d，同时做8个平行样本，T淋巴细胞增殖反应的测定方法同前。
, 百拇医药
4. B淋巴细胞分泌抗体的测定：B淋巴细胞、CD4+ T淋巴细胞的制备采用本实验室的方法[4]，TT、PPD处理APC同上述第2点，APC、CD4+ T淋巴细胞及B淋巴细胞按1∶3∶3混合, 再加入抗B7-1单克隆抗体、抗ICAM-1单克隆抗体和/或CsA，剂量同前，同时做8个平行样本，培养12d，收集上清液，采用生物素-链亲合素标记的酶联免疫吸附试验(ABC-ELISA法)检测特异性抗体的分泌水平。
结 果
一、抗B7-1单克隆抗体和CsA联用诱致抗原特异性的T淋巴细胞耐受
以TT或PPD处理APC细胞后, 再以抗B7-1单克隆抗体封闭APC表面的B7:CD28共刺激信号，能抑制特异性抗原诱导的T淋巴细胞增殖，将其与CsA联用可阻断T淋巴细胞的增殖。T淋巴细胞接受抗原刺激后，其分泌的IL-2于48h达高峰, 抗B7-1单克隆抗体和CsA均能抑制IL-2的产生，两者联用可阻断IL-2的分泌(见表1)。使用诱导T淋巴细胞耐受的同种抗原不能刺激T淋巴细胞增殖，而用第三者抗原可逆转T淋巴细胞的耐受状态(结果待发表)。
, 百拇医药
表1 抗B7-1单克隆抗体及CsA对TT诱导的
T淋巴细胞增殖和IL-2产生的影响
组 别
n
T淋巴细胞
的增殖反应
(1/min)
培养不同时间上清液中
IL-2的含量(kU/L)
24h
48h
72h
, 百拇医药
TT对照组
18
2 480±361
117±23
143±24
123±25
抗B7-1单克隆
抗体组
18
1 627±214*
35±9**
41±9**
, 百拇医药
37±6**
CsA组
18
1 307±232*
31±5**
33±6**
29±7**
抗B7-1单克隆
抗体+CsA组
18
128±37**
, 百拇医药
0
0
0
T淋巴细胞对照组
18
145±41
17±6
19±8
14±5
注：与TT对照组比较，* P<0.05 ** P<0.01
二、无能T淋巴细胞对同种异体淋巴细胞增殖反应的影响
, http://www.100md.com 将无能T淋巴细胞与新分离的异体淋巴细胞混合在体外培养, 发现无能T淋巴细胞可抑制同种异体淋巴细胞的增殖, 用mito-C处理和未处理的无能T淋巴细胞的抑制作用一致。进一步研究发现, 培养无能T淋巴细胞的上清液对T淋巴细胞的增殖亦有抑制作用。无能T淋巴细胞和T淋巴细胞的比例为0.01∶1(即1000个耐受细胞)时即有明显的抑制作用(结果未显示)。
三、IL-2不能逆转无能T淋巴细胞的耐受状态
在诱导T淋巴细胞无能时, 加入200kU/L的IL-2可以阻止无能T淋巴细胞的形成，但若T淋巴细胞耐受已形成，则IL-2不能逆转这一状态。
四、无能T淋巴细胞对B淋巴细胞增殖和分泌抗体的影响
APC提呈TT或PPD后，用抗B7-1单克隆抗体和/或CsA处理APC-T-B细胞反应系统, 结果发现抗B7-1单克隆抗体能抑制B淋巴细胞分泌抗TT或抗PPD抗体(P<0.05), 抗B7-1单克隆抗体和CsA具有协同抑制作用(P<0.01)。抗ICAM-1单克隆抗体抑制B淋巴细胞的作用与抗B7-1单克隆抗体基本一致。
, 百拇医药
讨 论
T淋巴细胞活化需要两个信号的参与, 第一信号由T淋巴细胞受体(TCR)识别MHC-抗原肽所介导, 第二信号为多种共刺激分子提供的共刺激信号。B7:CD28共刺激途径在T淋巴细胞活化和无能的诱导中发挥着重要作用[5]。TCR介导的信号主要通过钙调磷酸酶和癌基因(Ras)起作用，该途径可被CsA所抑制。B7:CD28介导的信号则依赖于磷酸激酶(JNK)的活化和协同刺激所依赖的核因子抑制蛋白(IkB)的磷酸化，是非Ca++依赖性的，不能被CsA所抑制[6]。
我们的研究发现, 抗B7-1单克隆抗体可阻断B7:CD28共刺激信号，与CsA联用可抑制T淋巴细胞的增殖和IL-2的分泌，诱致抗原特异性的T淋巴细胞耐受。外源性的IL-2能够防止T淋巴细胞耐受的诱导, 但不能逆转这一耐受状态, 表明IL-2在T淋巴细胞耐受的诱导和维持中具有重要作用。我们发现抗B7-1单克隆抗体与CsA联用可以抑制混合淋巴细胞反应(MLR)，并能显著抑制B淋巴细胞的效应功能, 表明抗原特异性的耐受状态是可以传播的，这可能系无能T淋巴细胞不表达CD40L, 而B淋巴细胞活化则需要CD40/CD40L提供的共刺激信号所致[7，8]。Lombardi等[9]报道抗原特异性的耐受状态通过细胞-细胞接触而传递。我们发现培养无能T淋巴细胞的上清液亦能抑制T淋巴细胞的增殖, 表明无能T淋巴细胞的抑制作用除通过细胞接触传递外，尚有抑制因子的参与(结果待发表)。
, http://www.100md.com
上述研究结果加深了我们对无能T淋巴细胞的认识, T淋巴细胞无能是外周免疫耐受的机理之一。抗原特异性耐受是可以人为诱导的, 阻断B7:CD28共刺激信号，并加用CsA可诱致抗原特异性的T淋巴细胞耐受, 这可减少移植术后CsA的用量, 从而降低其毒性, 为防止排斥反应提供了新的方案。
基金项目：(上海市科技发展基金资助项目(94JC 14005)
作者单位：马宝骊(200025 上海第二医科大学 上海市免疫学研究所)
范祖森(中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室406组，邮政编码：200031)
范祖森(Email：aosz@server.shcnc.ac.cn)
参考文献
, 百拇医药
[1]Schwartz RH. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science,1990, 248:1349-1356.
[2]Schwartz RH. Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA4, and B7/BB1in IL-2 production and immunotherapy. Cell, 1992, 71:1065-1069.
[3]Harding FA, McArthur JG, Gross JA, et al. CD28-mediated signalling costimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T cell clones. Nature, 1992, 356:607-609.
, http://www.100md.com
[4]范祖森，马宝骊，张汉明. T细胞耐受的诱导及其机理研究. 中华微生物和免疫学杂志, 1999, 19:387-390.
[5]Wingren AG, Parra E, Varga M, et al. T cell activation pathways: B7, LFA-3 and ICAM-1 shape unique T cell profiles. Critical Rev Immunol, 1995,15:235-242.
[6]Ledbeter JA, Imboden JB, Thompson CB, et al. CD28 ligation in T cell activation: evidence for two signal transduction pathways. Blood, 1990, 75:1531-1539.
[7]Quill H. Anergy as a mechanism of peripheral T cell tolerance. J Immunol, 1996, 156:1325-1330.
[8]Kooten CV, Banchereau J. Functions of CD40 on B cells, dendritic cells and other cells. Curr Opin Immunol, 1997, 9:330-334.
[9]Lombardi G, Sidhu S, Batchelor JR, et al. Anergic T cells as suppressor cells in vitro. Science, 1994, 264:1587-1589., 百拇医药
摘 要 目的 探讨抗原特异性无能T淋巴细胞的诱导及其耐受特性。方法 在体外建立抗原递呈细胞-T淋巴细胞-B淋巴细胞反应系统, 利用环孢素A(CsA)与抗B7-1单克隆抗体联用阻断B7:CD28共刺激途径, 采用3H-TdR法检测T淋巴细胞增殖，酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定B淋巴细胞分泌的抗体。 结果 CsA与抗B7-1单克隆抗体联用可诱致T淋巴细胞无能，无能T淋巴细胞不产生白细胞介素2(IL-2)；外源性IL-2能阻止T淋巴细胞无能的诱导，但不能逆转这一耐受状态。 结论 CsA与抗B7-1单克隆抗体联用可以诱导T淋巴细胞的抗原特异性耐受。
关键词：环孢菌素 抗体，单克隆 免疫耐受
大量实验表明, T淋巴细胞接受抗原递呈细胞(APC)递呈的MHC-抗原肽信号后, 如缺乏某些共刺激信号，则T淋巴细胞不能活化，而处于无能状态[1]。研究证实，B7:CD28是T淋巴细胞活化的主要共刺激信号[2,3]。B7分子是CD28/CTLA4的天然配体,目前发现的有B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3, 主要表达于APC细胞表面。我们利用抗B7-1单克隆抗体阻断B7:CD28共刺激信号，并与环孢素A(CsA)联用，观察其在体外诱导抗原特异性T淋巴细胞耐受的效果, 并对其特性及耐受机制进行了探讨。
, 百拇医药
材料与方法
一、 实验材料
健康人外周血购自上海市血液中心；淋巴细胞分层液由上海试剂二厂出品；破伤风内毒素(TT)由中国科学院上海细胞生物学研究所叶敏教授惠赠；结核杆菌纯蛋白衍生物(PPD)购自卫生部北京生物制品研究所；抗B7-1单克隆抗体(BB1单克隆抗体)、抗细胞间粘附分子1单克隆抗体(抗ICAM-1单克隆抗体)和抗CD3单克隆抗体(G19-4)由美国华盛顿大学EA.Clark 教授惠赠；CsA为瑞士Sandoz公司产品；2-溴化异脲氨基乙醇(AET)、丝裂霉素C(mito-C)、植物血凝素(PHA)及商陆促分裂原(PWM)均为Sigma公司产品；白细胞介素2(IL-2)为华新生物工程公司产品；生物素标记的Ig、酶标亲和素、FITC-羊抗鼠Ig均购自华美公司。
二、实验方法
1. APC及T淋巴细胞的分离：采用AET法。取新鲜绵羊红细胞(SRBC)，洗涤后, 用浓度为0.14mol/L的 AET处理〔SRBC与AET的比例为(5～10)∶1〕，37℃放置15min，离心，洗涤后配成2%的SRBC悬液。新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC), 加入等量的2% SRBC悬液，冰浴1h, 上淋巴细胞分层液分离, 上层作为APC，沉于管底的为T淋巴细胞和SRBC, 用红细胞裂解液(ACK)溶解SRBC, 所得即为T淋巴细胞，采用抗CD3单克隆抗体经荧光激活的细胞分类仪(FACS)鉴定其纯度为90%左右, 台酚蓝染色示活细胞>90%。
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2. 特异性抗原诱导T淋巴细胞增殖反应的测定：APC经mito-C处理后, 再与TT(10mg/L)或PPD(15mg/L)混合培养过夜, 洗涤3次，然后将APC上样至96孔板中(2×104/孔)，加入T淋巴细胞(5×104/孔)，然后按分组要求(见表1)分别加入抗B7-1单克隆抗体(10mg/L)和/或CsA(500μg/L), 培养7d, 用H3-TdR掺入法检测T淋巴细胞的增殖反应。抗B7-1单克隆抗体和CsA联用诱导的T淋巴细胞即为无能T淋巴细胞。并分别于培养24h、48h、72h收集上清液, 测定IL-2的浓度(生物活性检测法)。
3. 混合同种异体淋巴细胞增殖反应的测定：经mito-C处理和未处理的无能T淋巴细胞加入96孔板(1×105/孔)，再加入同种异体淋巴细胞(1×105/孔)，培养7d，同时做8个平行样本，T淋巴细胞增殖反应的测定方法同前。
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4. B淋巴细胞分泌抗体的测定：B淋巴细胞、CD4+ T淋巴细胞的制备采用本实验室的方法[4]，TT、PPD处理APC同上述第2点，APC、CD4+ T淋巴细胞及B淋巴细胞按1∶3∶3混合, 再加入抗B7-1单克隆抗体、抗ICAM-1单克隆抗体和/或CsA，剂量同前，同时做8个平行样本，培养12d，收集上清液，采用生物素-链亲合素标记的酶联免疫吸附试验(ABC-ELISA法)检测特异性抗体的分泌水平。
结 果
一、抗B7-1单克隆抗体和CsA联用诱致抗原特异性的T淋巴细胞耐受
以TT或PPD处理APC细胞后, 再以抗B7-1单克隆抗体封闭APC表面的B7:CD28共刺激信号，能抑制特异性抗原诱导的T淋巴细胞增殖，将其与CsA联用可阻断T淋巴细胞的增殖。T淋巴细胞接受抗原刺激后，其分泌的IL-2于48h达高峰, 抗B7-1单克隆抗体和CsA均能抑制IL-2的产生，两者联用可阻断IL-2的分泌(见表1)。使用诱导T淋巴细胞耐受的同种抗原不能刺激T淋巴细胞增殖，而用第三者抗原可逆转T淋巴细胞的耐受状态(结果待发表)。
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表1 抗B7-1单克隆抗体及CsA对TT诱导的
T淋巴细胞增殖和IL-2产生的影响
组 别
n
T淋巴细胞
的增殖反应
(1/min)
培养不同时间上清液中
IL-2的含量(kU/L)
24h
48h
72h
, 百拇医药
TT对照组
18
2 480±361
117±23
143±24
123±25
抗B7-1单克隆
抗体组
18
1 627±214*
35±9**
41±9**
, 百拇医药
37±6**
CsA组
18
1 307±232*
31±5**
33±6**
29±7**
抗B7-1单克隆
抗体+CsA组
18
128±37**
, 百拇医药
0
0
0
T淋巴细胞对照组
18
145±41
17±6
19±8
14±5
注：与TT对照组比较，* P<0.05 ** P<0.01
二、无能T淋巴细胞对同种异体淋巴细胞增殖反应的影响
, http://www.100md.com 将无能T淋巴细胞与新分离的异体淋巴细胞混合在体外培养, 发现无能T淋巴细胞可抑制同种异体淋巴细胞的增殖, 用mito-C处理和未处理的无能T淋巴细胞的抑制作用一致。进一步研究发现, 培养无能T淋巴细胞的上清液对T淋巴细胞的增殖亦有抑制作用。无能T淋巴细胞和T淋巴细胞的比例为0.01∶1(即1000个耐受细胞)时即有明显的抑制作用(结果未显示)。
三、IL-2不能逆转无能T淋巴细胞的耐受状态
在诱导T淋巴细胞无能时, 加入200kU/L的IL-2可以阻止无能T淋巴细胞的形成，但若T淋巴细胞耐受已形成，则IL-2不能逆转这一状态。
四、无能T淋巴细胞对B淋巴细胞增殖和分泌抗体的影响
APC提呈TT或PPD后，用抗B7-1单克隆抗体和/或CsA处理APC-T-B细胞反应系统, 结果发现抗B7-1单克隆抗体能抑制B淋巴细胞分泌抗TT或抗PPD抗体(P<0.05), 抗B7-1单克隆抗体和CsA具有协同抑制作用(P<0.01)。抗ICAM-1单克隆抗体抑制B淋巴细胞的作用与抗B7-1单克隆抗体基本一致。
, 百拇医药
讨 论
T淋巴细胞活化需要两个信号的参与, 第一信号由T淋巴细胞受体(TCR)识别MHC-抗原肽所介导, 第二信号为多种共刺激分子提供的共刺激信号。B7:CD28共刺激途径在T淋巴细胞活化和无能的诱导中发挥着重要作用[5]。TCR介导的信号主要通过钙调磷酸酶和癌基因(Ras)起作用，该途径可被CsA所抑制。B7:CD28介导的信号则依赖于磷酸激酶(JNK)的活化和协同刺激所依赖的核因子抑制蛋白(IkB)的磷酸化，是非Ca++依赖性的，不能被CsA所抑制[6]。
我们的研究发现, 抗B7-1单克隆抗体可阻断B7:CD28共刺激信号，与CsA联用可抑制T淋巴细胞的增殖和IL-2的分泌，诱致抗原特异性的T淋巴细胞耐受。外源性的IL-2能够防止T淋巴细胞耐受的诱导, 但不能逆转这一耐受状态, 表明IL-2在T淋巴细胞耐受的诱导和维持中具有重要作用。我们发现抗B7-1单克隆抗体与CsA联用可以抑制混合淋巴细胞反应(MLR)，并能显著抑制B淋巴细胞的效应功能, 表明抗原特异性的耐受状态是可以传播的，这可能系无能T淋巴细胞不表达CD40L, 而B淋巴细胞活化则需要CD40/CD40L提供的共刺激信号所致[7，8]。Lombardi等[9]报道抗原特异性的耐受状态通过细胞-细胞接触而传递。我们发现培养无能T淋巴细胞的上清液亦能抑制T淋巴细胞的增殖, 表明无能T淋巴细胞的抑制作用除通过细胞接触传递外，尚有抑制因子的参与(结果待发表)。
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上述研究结果加深了我们对无能T淋巴细胞的认识, T淋巴细胞无能是外周免疫耐受的机理之一。抗原特异性耐受是可以人为诱导的, 阻断B7:CD28共刺激信号，并加用CsA可诱致抗原特异性的T淋巴细胞耐受, 这可减少移植术后CsA的用量, 从而降低其毒性, 为防止排斥反应提供了新的方案。
基金项目：(上海市科技发展基金资助项目(94JC 14005)
作者单位：马宝骊(200025 上海第二医科大学 上海市免疫学研究所)
范祖森(中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室406组，邮政编码：200031)
范祖森(Email：aosz@server.shcnc.ac.cn)
参考文献
, 百拇医药
[1]Schwartz RH. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science,1990, 248:1349-1356.
[2]Schwartz RH. Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA4, and B7/BB1in IL-2 production and immunotherapy. Cell, 1992, 71:1065-1069.
[3]Harding FA, McArthur JG, Gross JA, et al. CD28-mediated signalling costimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T cell clones. Nature, 1992, 356:607-609.
, http://www.100md.com
[4]范祖森，马宝骊，张汉明. T细胞耐受的诱导及其机理研究. 中华微生物和免疫学杂志, 1999, 19:387-390.
[5]Wingren AG, Parra E, Varga M, et al. T cell activation pathways: B7, LFA-3 and ICAM-1 shape unique T cell profiles. Critical Rev Immunol, 1995,15:235-242.
[6]Ledbeter JA, Imboden JB, Thompson CB, et al. CD28 ligation in T cell activation: evidence for two signal transduction pathways. Blood, 1990, 75:1531-1539.
[7]Quill H. Anergy as a mechanism of peripheral T cell tolerance. J Immunol, 1996, 156:1325-1330.
[8]Kooten CV, Banchereau J. Functions of CD40 on B cells, dendritic cells and other cells. Curr Opin Immunol, 1997, 9:330-334.
[9]Lombardi G, Sidhu S, Batchelor JR, et al. Anergic T cells as suppressor cells in vitro. Science, 1994, 264:1587-1589., 百拇医药