条件性环磷酰胺抑制迟发过敏反应及其机制的初步分析
梅林 李乐群 邓玉兰 孙长伟 丁桂凤 范少光
摘要 目的：观察在条件性环磷酰胺免疫抑制反应中小鼠耳廓重量和白细胞移动抑制因子(LMIF)活性的变化，并分析条件性反应小鼠血清中是否产生了某种介导物质。方法：以樟脑气味为条件刺激，以腹腔注射环磷酰胺为非条件刺激，以2，4-二硝基氯苯(DNCB)作为致敏原诱发耳廓皮肤肿胀和同时诱发淋巴细胞释放LMIF。在条件性反应训练结束后，取耳称重并同时取肠系膜淋巴结细胞制备LMIF。以左/右耳重量之比和游出细胞光密度作为迟发过敏(DTH)反应的检测指标。结果：(1) DTH皮肤反应和以LMIF活性为指标的DTH反应在条件反应组均明显减弱，与不经过条件性训练的对照组相比差异显著，而与非条件反应组相比则没有差异。(2) 条件性反应组小鼠的血清在透析前能够抑制正常小鼠皮肤DTH反应，但经过透析处理后(阻滞相对分子质量10 000)则不表现抑制DTH的作用。结论：本工作建立了稳定的环磷酰胺条件性抑制DTH皮肤反应和LMIF活性的模型；并发现条件性反应小鼠血液中存在一种(类)小分子物质，介导了DTH的抑制效应。条件性抑制LMIF活性的模型，为进一步分析血清中这种介导物质的生化特性提供了一个十分方便的检测手段。
, 百拇医药
关键词：条件性免疫反应 环磷酰胺 樟脑 2，4-二硝基氯苯 迟发过敏反应
神经内分泌系统对免疫功能调节作用的研究在近10多年取得了很大进展，其中之一是关于免疫功能的条件反应[1，2]。免疫功能的条件反应是指：一些对免疫功能有调节作用的物质(通常被称为非条件刺激)如环磷酰胺[2]、环孢菌素[3]、PolyI∶C[4]等，当与某些中性刺激如味觉[3]、嗅觉[4]刺激相结合后，再单独给予该中性刺激即可出现与非条件刺激引起的免疫功能相同的变化，此时该中性刺激被称为条件刺激，说明免疫反应通过神经系统可形成条件反射。目前已经证明各种免疫反应包括免疫抑制[3]、免疫加强[4]、移植免疫[5]、肿瘤免疫[6]等都能建立条件性反应。本工作以2，4-二硝基氯苯(DNCB)诱发皮肤迟发过敏(DTH)反应和诱发白细胞移动抑制因子(LMIF)释放作为免疫指标，将樟脑条件刺激与环磷酰胺(CY)非条件刺激经过两次结合/强化，发现可建立稳定的环磷酰胺条件性抑制DTH反应模型；并进一步发现，条件性反应小鼠血清中存在一种相对分子质量小于10 000的物质，介导了DTH的抑制效应。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物 雄性LACA小鼠，体重18～24 g，Wistar大鼠，体重250 g，雌雄不限。均由北京医科大学实验动物中心提供。
1.2 溶液配制
1.2.1 环磷酰胺溶液：以无菌生理盐水(NS)配制，质量浓度为7.5 g/L，置4 ℃保存备用。1.2.2 DNCB溶液：称取DNCB 200 mg，溶于丙酮/橄榄油混合液(1∶1)中(33 g/L)，封好瓶口，-20℃保存备用。
1.2.3 phytohemagglutinin(PHA)溶液：称取PHA 100 mg，溶于10 mL不完全RPMI1640培养液中，过滤除菌，-20℃保存备用。
1.3 樟脑气味(条件刺激)的制备 将固体樟脑精15 g放入装有40 mL液体石腊的烧杯中，加热至有烟雾和气味溢出，置此烧杯于实验组鼠笼内，并保持鼠笼空间较密闭状态。每15 min取出烧杯加热一次以保持一定的樟脑烟雾和气味。
, http://www.100md.com
1.4 皮肤DTH反应的测量 实验小鼠在第1天(d)被DNCB涂腹致敏后，第6 d左耳涂以DNCB激发过敏，右耳涂等量丙酮/橄榄油，第7 d将动物处死后从其耳根沿耳廓剪下外耳，将左、右耳分别称重，以左/右耳重量之比作为皮肤DTH反应强弱的指标。同时设置DTH阴性对照组即第1 d腹部涂NS，第6 d处理方法同实验组(表1)。
1.5 LMIF吸光度检测
1.5.1 LMIF的制备：方法详见参考文献[7]。简述如下：实验第7 d，取小鼠肠系膜淋巴结制成细胞悬液(浓度2.0×106 个/mL)，并加入PHA(PHA终浓度为60 mg/L)，37 ℃、5%(体积分数) CO2培养72 h后离心(2000 r/min,15 min)，取上清(内含LMIF)冷冻抽干，-20℃保存备用。以不加PHA的细胞培养上清收集液作为PHA阴性对照。
1.5.2 指示细胞吸光度测定：制备Wistar大鼠外周血白细胞，将细胞液调至(1.6～1.8)×107 个/mL。以此作为游出细胞(指示细胞)。以间接毛细管方法，用酶标仪测定游出细胞在600 nm波长下的光密度[D(λ)值]。
, http://www.100md.com
1.6 环磷酰胺条件性抑制DTH反应动物模型的建立 将LACA小鼠随机分为6组，每组7只。条件反应组的处理过程是：从第0 d开始给予樟脑气味条件刺激1 h之后，立即腹腔注射环磷酰胺(75 mg/kg)作为非条件刺激。第1 d重复此程序后，用DNCB(50 μL)涂腹致敏动物，第6 d仅嗅樟脑气味不再注射环磷酰胺(CY)并用DNCB(10 μL)涂左耳激发过敏。第7 d处死动物，剪耳称重并取其肠系膜淋巴结细胞制备LMIF。非条件反应组的处理过程与条件反应组的不同之处在于：第0、1和6 d不给予樟脑，第6 d以CY代替NS注射(表1)。实验中还设置了CY对照组、樟脑对照组和其它对照组，其处理过程详见表1。
表 1 条件性抑制小鼠迟发过敏反应的实验程序
Table 1 Treatment schedule for the conditioned suppression of delayed
, http://www.100md.com type hypersensitivity response in mice
Group
Day0 treatment
Day1 treatment
Day6 treatment
Day7 treatment
Weighing ears
LMIF preparation
CAM
Air
CY
, 百拇医药
NS
CAM
Air
CY
NS
S
CAM
Air
CY
NS
C
DTH(-)
+
+
, 百拇医药
+
+
-
+
+
+
+
DTH
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
CR
+
+
+
+
+
+
+
+
+
UCR
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ECY
+
+
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
ECAM
+
+
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
CAM: camphor odor; CY: cyclophosphamide; NS: normal saline; S: sensitization; C: challenge; LMIF: leukocyte migration inhibitory factor; DTH: delayed type hypersensitivity; DTH(-): NS was smeared instead of DNCB on abdominal skin in day 1; CR: conditioned response; UCR: unconditioned response; ECY: effect of CY 6 days after administration; ECAM: effect of camphor odor on DTH response. n=7 in each group
1.7 血清的制备和注射 实验第6 d处理程序结束后6 h，将非条件反应组和条件反应组小鼠经眼内眦静脉取血后处死，制备血清。血清分为两部分，一部分不作透析，其中非条件反应组血清和条件反应组血清分别称为第1和第2组；另一部分为透析血清，用阻滞相对分子质量10 000的透析袋4℃透析24 h，其中非条件反应组血清和条件反应组血清分别称为第3和第4组。将这两部分4组血清置-20℃保存备用。
, http://www.100md.com
取正常LACA雄性小鼠，分为第1、2、3和4组，每组6只。实验第1 d 4组动物均被给予DNCB涂腹致敏，第6 d 4组动物分别给予尾静脉注射第1、2、3、4组分血清(200μL/只)，然后以DNCB涂左耳。第7 d剪耳称重，检测皮肤DTH反应(表2)。
表 2 条件性反应小鼠血清抑制正常小鼠皮肤迟发过敏反应的实验程序
Table 2 Treatment schedule for testing the effect of the conditioned serum on delayed type hypersensitivity response of skin in normal mice
Group
Day0 treatment
Day1 treatment
, 百拇医药
Day6 treatment
Day7 treatment
Weighing ears
CAM
Air
CY
NS
CAM
Air
CY
NS
S
CAM
, http://www.100md.com
Air
CY
NS
C
B
UCR(11)
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+(6)
+(5)
CR(15)
+
+
+
+
+
+
+
+
+(8)
+(7)
NOR1
, http://www.100md.com
+
iv serum 1
+
+
NOR2
+
iv serum 2
+
+
NOR3
+
iv serum 3
+
, http://www.100md.com
+
NOR4
+
iv serum 4
+
+
CAM: camphor odor; CY: cyclophosphamide; NS: normal saline; S: sensitization; C: challenge; UCR: unconditioned response; CR: conditioned response; iv: intravenous; NOR: normal mice (n=6 in each group); B: bloodletting. The number in parenthesis represents the number of mouse used. Serum 1: UCR serum; Serum 2: CR serum; Serum 3: dialyzed UCR serum; Serum 4: dialyzed CR serum
, 百拇医药
1.8 数据处理 实验数据以均值±标准误(x±sx)表示，以方差分析(ANOVA)进行显著性检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 环磷酰胺条件性抑制DTH反应动物模型的建立
2.1.1 皮肤DTH反应：结果如图1A所示，DTH组与DTH阴性组相比差异有显著性(P<0.001)；非条件反应组与DTH组相比差异有显著性(P<0.001)；条件反应组与DTH组相比差异有显著性(P<0.001)但与非条件反应组相比差异不显著(P>0.05)；CY对照组与DTH组相比差异不显著(P>0.05)；樟脑对照组与DTH组相比差异也不显著(P>0.05)。
2.1.2 DTH反应的LMIF活性测定：结果如图1B所示，DTH组与对照组相比差异有显著性(P<0.001)；非条件反应组与DTH组相比差异显著(P<0.05)；条件反应组与DTH组相比差异显著(P<0.01)，但与非条件反应组相比差异不显著(P>0.05)；CY对照组与DTH组相比差异不显著(P>0.05)；樟脑对照组与条件反应组相比差异显著(P<0.05)，与非条件反应组相比差异也显著(P<0.05)，但与DTH组相比差异不显著(P>0.05)。
, 百拇医药
图1A 环磷酰胺条件性抑制皮肤迟发过敏反应
Fig 1A Conditioned cyclophosphamide immuno-
suppression on DTH response of skin in mice
***: P<0.001 compared with DTH (-); +++: P<0.001 compared with DTH (ANOVA). DTH: delayed type hypersensitivi- ty; CR: conditioned response; UCR: unconditio- ned response; ECY: effect of cyclophosphamide 6 days after administration; ECAM: effect of camphor odor on DTH response. n=7 in each group
, http://www.100md.com
图1B 环磷酰胺条件性抑制LMIF活性
Fig 1B Conditioned cyclophosphamide immuno-
suppression on LMIF activity
***: P<0.001 compared with control; +: P<0.05 compared with DTH;++: P<0.01 compared with DTH; #: P<0.05 compared with CR and UCR (ANOVA). LMIF： leukocyte migration inhibitory factor; DTH: delayed type hypersensitivity; CR: conditioned response; UCR: unconditioned response; ECY: effect of cyclophosphamide 6 days after administration; ECAM: effect of camphor odor on DTH response. n=7 in each group
, 百拇医药
2.2 条件性反应小鼠血清对正常小鼠皮肤DTH反应的影响 结果如图2所示：给4组经过DNCB致敏和激发过敏的小鼠尾静脉分别注入4种不同组分的血清后，第2组与第1组小鼠左/右耳重之比差异有显著性(P<0.01)；第4组与第3组小鼠左/右耳重之比差异无显著性(P>0.05)。第3、4组的左/右耳重比值与第1、2组的左/右耳重比值之间差异也无显著性(P>0.05)。
图2 条件性反应小鼠血清对正常小鼠皮肤迟发过敏反应的影响
Fig 2 Effect of the conditioned serum on delayed type hypersensitivity response of skin in normal mice
**: P<0.01 compared with group 1 (ANOVA). UCR: unconditioned response; CR: conditioned response. n=6 in each group
, http://www.100md.com
3 讨论
3.1 关于条件性抑制DTH反应的动物模型 本实验选用DTH皮肤反应和LMIF活性测定作为免疫指标，建立了条件性环磷酰胺抑制DTH反应的整体和离体模型。(1) 两种模型均设置了6个组(图1A、图1B)。其中DTH组与DTH阴性组(或对照组)相比差异显著[P<0.001(图1A)，P<0.001(图1B)]，说明DTH反应出现了阳性结果。已知皮肤DTH反应出现阳性结果是由于小鼠在第1 d以DNCB涂腹致敏后，第6 d以DNCB涂左耳激发过敏造成左耳充血和水肿，重量增加，因此左/右耳重之比明显大于DTH阴性组；DNCB引起LMIF活性升高的原因是由于致敏T淋巴细胞与相应的抗原反应能够释放出多种生物活性物质，其中之一是LMIF[8]。LMIF的含量与DTH反应有明显的相关性，即DTH反应越强，LMIF含量越高[9]。我们利用间接毛细管方法结合分光光度计，测定游出细胞的D(λ)值。D(λ)值越小说明游出的细胞数越少，提示LMIF的活性越大。(2) 图1示，非条件反应组与DTH组相比差异显著[P<0.001(图1A)，P<0.05(图1B)]，说明非条件刺激CY能够抑制DTH反应；条件反应组与DTH组相比差异显著[P<0.001(图1A)，P<0.01(图1B)]而与非条件反应组相比差异不显著，说明小鼠经过非条件刺激与樟脑结合/强化训练后，樟脑已由无关刺激变成条件刺激，它所引起的条件反应模拟了CY非条件刺激引起的免疫抑制反应。(3) 为了验证条件反应组出现的抑制作用是否由于CY注射后的后遗作用引起，实验中设置了CY对照组，结果表明CY对照组与DTH组相比没有差异，提示CY用药6 d后已经不会抑制DTH，因此说明条件反应组出现的DTH反应抑制不是由CY本身引起。(4) 我们还设置了樟脑对照组。图1A显示了樟脑对照组与DTH组相比差异不显著；图1B显示了樟脑对照组抑制LMIF活性的作用略强于DTH组，但经过检验两组差异并没有统计学意义(P>0.05)，而且樟脑对照组不论是与条件反应组相比还是与非条件反应组相比差异均显著(P值分别<0.05)，因此能够排除樟脑本身及实验操作过程等因素对结果的影响。总之，通过这些对照，最后明确了条件反应组的DTH反应减弱是由于已建立了条件反应的结果。
, http://www.100md.com
3.2 关于条件性免疫反应的机制 1992年加拿大Gorczynski的一项研究发现，在孕期小鼠条件性免疫抑制反应的过程中，可能产生了某些物质，这些物质可通过胎盘或经乳汁传递给乳鼠，从而抑制子代的免疫功能[10]。这究竟是一种什么性质的物质?由什么部位产生?至今未见进一步报道。本实验第二部分的结果表明，将建立了条件性免疫抑制反应的小鼠血清注入正常小鼠体内，正常小鼠的皮肤DTH反应也被抑制，说明条件性反应小鼠的血清中存在某种物质介导了这种抑制效应。如果用阻滞相对分子质量10 000的透析袋将血清透析处理后，这种抑制作用完全消失。初步提示这种介导物质是一种(或一类)小分子物质。这项研究工作刚刚开始，关于它的其它生化特性及其与Gorczynski报道的因子的关系，还有待进一步阐明。本研究建立的条件性抑制LMIF反应的体外模型将为进一步分析血清中这种介导物质的生化特性提供一个十分方便的检测手段。
基金项目：卫生部基金资助项目(95-2-23)
, 百拇医药
作者简介：梅林(1956年生)，女，湖南省人，博士，副教授，现任北京生理科学会理事。1999-02～1999-08有香港大学研修。
作者单位：梅林(北京医科大学生理学系)
李乐群(北京医科大学免疫学系，北京 100083)
邓玉兰(北京医科大学免疫学系，北京 100083)
孙长伟(北京医科大学生理学系)
丁桂凤(北京医科大学免疫学系，北京 100083)
范少光(北京医科大学生理学系)
参考文献
[1]Hiramoto RN, Roger CF, Demissie S, et al. Psychoneuroendocrine immunology: site of recognition, learning and memory in the immune system and the brain[J]. Int J Neurosci, 1997, 92(3-4): 259-285.
, http://www.100md.com
[2]Cohen N, Moynihan JA, Ader R. Pavlovian conditioning of the immune system [J]. Int Arch Allergy Immunol, 1994, 105(2): 101-106.
[3]Klosterhalfen S, Klosterhalfen W. Conditioned cyclosporine effects but not conditioned taste aversion in immunized rats [J]. Behav Neurosci, 1990, 104(5):716-724.
[4]Rogers C, Ghanta V, Huseh CM, et al. The direction of the conditioned natural killer cell response can be re-directed with indomethacin and/or handling [J]. Int J Neurosci, 1992, 67(1-4): 229-239.
, 百拇医药
[5]Gorczynzki RM, Macrea S, Kennedy M. Conditioned immune response associated with allogeneic skin grafts in mice [J]. J Immunol, 1982, 129(2):704-709.
[6]Ghanta VK, Hiramoto NS, Soong SJ, et al. Conditioning of the secondary cytotoxic T-lymphocyte response to YC8 tumor [J]. Pharmacol Biochem Behav, 1995, 50(3): 399-403.
[7]纪敏，刘登奇，叶天星. MIF光密度检测法的研究. 中国免疫学杂志[J]，1988，4(3)：173-175.
[8]应大明.T淋巴细胞功能的检测.陶义训审编，临床免疫学检验[M]. 上海：科学技术出版社，1983. 77-83.
, 百拇医药
[9]Malorny U, Goebeler M, Gutwald J, et al. Difference in migration inhibitory factor production by C57B1/6 and BALB/c mice in allergic and irritant contact dermatitis [J]. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1990, 92(4): 356-360.
[10]Gorczynski RM. Conditioned stress responses by pregnant and/or lactating mice reduce immune responses of their oppspring after weaning [J]. Brain Behav Immun, 1992, 6(1)：87-95., 百拇医药
摘要 目的：观察在条件性环磷酰胺免疫抑制反应中小鼠耳廓重量和白细胞移动抑制因子(LMIF)活性的变化，并分析条件性反应小鼠血清中是否产生了某种介导物质。方法：以樟脑气味为条件刺激，以腹腔注射环磷酰胺为非条件刺激，以2，4-二硝基氯苯(DNCB)作为致敏原诱发耳廓皮肤肿胀和同时诱发淋巴细胞释放LMIF。在条件性反应训练结束后，取耳称重并同时取肠系膜淋巴结细胞制备LMIF。以左/右耳重量之比和游出细胞光密度作为迟发过敏(DTH)反应的检测指标。结果：(1) DTH皮肤反应和以LMIF活性为指标的DTH反应在条件反应组均明显减弱，与不经过条件性训练的对照组相比差异显著，而与非条件反应组相比则没有差异。(2) 条件性反应组小鼠的血清在透析前能够抑制正常小鼠皮肤DTH反应，但经过透析处理后(阻滞相对分子质量10 000)则不表现抑制DTH的作用。结论：本工作建立了稳定的环磷酰胺条件性抑制DTH皮肤反应和LMIF活性的模型；并发现条件性反应小鼠血液中存在一种(类)小分子物质，介导了DTH的抑制效应。条件性抑制LMIF活性的模型，为进一步分析血清中这种介导物质的生化特性提供了一个十分方便的检测手段。
, 百拇医药
关键词：条件性免疫反应 环磷酰胺 樟脑 2，4-二硝基氯苯 迟发过敏反应
神经内分泌系统对免疫功能调节作用的研究在近10多年取得了很大进展，其中之一是关于免疫功能的条件反应[1，2]。免疫功能的条件反应是指：一些对免疫功能有调节作用的物质(通常被称为非条件刺激)如环磷酰胺[2]、环孢菌素[3]、PolyI∶C[4]等，当与某些中性刺激如味觉[3]、嗅觉[4]刺激相结合后，再单独给予该中性刺激即可出现与非条件刺激引起的免疫功能相同的变化，此时该中性刺激被称为条件刺激，说明免疫反应通过神经系统可形成条件反射。目前已经证明各种免疫反应包括免疫抑制[3]、免疫加强[4]、移植免疫[5]、肿瘤免疫[6]等都能建立条件性反应。本工作以2，4-二硝基氯苯(DNCB)诱发皮肤迟发过敏(DTH)反应和诱发白细胞移动抑制因子(LMIF)释放作为免疫指标，将樟脑条件刺激与环磷酰胺(CY)非条件刺激经过两次结合/强化，发现可建立稳定的环磷酰胺条件性抑制DTH反应模型；并进一步发现，条件性反应小鼠血清中存在一种相对分子质量小于10 000的物质，介导了DTH的抑制效应。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物 雄性LACA小鼠，体重18～24 g，Wistar大鼠，体重250 g，雌雄不限。均由北京医科大学实验动物中心提供。
1.2 溶液配制
1.2.1 环磷酰胺溶液：以无菌生理盐水(NS)配制，质量浓度为7.5 g/L，置4 ℃保存备用。1.2.2 DNCB溶液：称取DNCB 200 mg，溶于丙酮/橄榄油混合液(1∶1)中(33 g/L)，封好瓶口，-20℃保存备用。
1.2.3 phytohemagglutinin(PHA)溶液：称取PHA 100 mg，溶于10 mL不完全RPMI1640培养液中，过滤除菌，-20℃保存备用。
1.3 樟脑气味(条件刺激)的制备 将固体樟脑精15 g放入装有40 mL液体石腊的烧杯中，加热至有烟雾和气味溢出，置此烧杯于实验组鼠笼内，并保持鼠笼空间较密闭状态。每15 min取出烧杯加热一次以保持一定的樟脑烟雾和气味。
, http://www.100md.com
1.4 皮肤DTH反应的测量 实验小鼠在第1天(d)被DNCB涂腹致敏后，第6 d左耳涂以DNCB激发过敏，右耳涂等量丙酮/橄榄油，第7 d将动物处死后从其耳根沿耳廓剪下外耳，将左、右耳分别称重，以左/右耳重量之比作为皮肤DTH反应强弱的指标。同时设置DTH阴性对照组即第1 d腹部涂NS，第6 d处理方法同实验组(表1)。
1.5 LMIF吸光度检测
1.5.1 LMIF的制备：方法详见参考文献[7]。简述如下：实验第7 d，取小鼠肠系膜淋巴结制成细胞悬液(浓度2.0×106 个/mL)，并加入PHA(PHA终浓度为60 mg/L)，37 ℃、5%(体积分数) CO2培养72 h后离心(2000 r/min,15 min)，取上清(内含LMIF)冷冻抽干，-20℃保存备用。以不加PHA的细胞培养上清收集液作为PHA阴性对照。
1.5.2 指示细胞吸光度测定：制备Wistar大鼠外周血白细胞，将细胞液调至(1.6～1.8)×107 个/mL。以此作为游出细胞(指示细胞)。以间接毛细管方法，用酶标仪测定游出细胞在600 nm波长下的光密度[D(λ)值]。
, http://www.100md.com
1.6 环磷酰胺条件性抑制DTH反应动物模型的建立 将LACA小鼠随机分为6组，每组7只。条件反应组的处理过程是：从第0 d开始给予樟脑气味条件刺激1 h之后，立即腹腔注射环磷酰胺(75 mg/kg)作为非条件刺激。第1 d重复此程序后，用DNCB(50 μL)涂腹致敏动物，第6 d仅嗅樟脑气味不再注射环磷酰胺(CY)并用DNCB(10 μL)涂左耳激发过敏。第7 d处死动物，剪耳称重并取其肠系膜淋巴结细胞制备LMIF。非条件反应组的处理过程与条件反应组的不同之处在于：第0、1和6 d不给予樟脑，第6 d以CY代替NS注射(表1)。实验中还设置了CY对照组、樟脑对照组和其它对照组，其处理过程详见表1。
表 1 条件性抑制小鼠迟发过敏反应的实验程序
Table 1 Treatment schedule for the conditioned suppression of delayed
, http://www.100md.com type hypersensitivity response in mice
Group
Day0 treatment
Day1 treatment
Day6 treatment
Day7 treatment
Weighing ears
LMIF preparation
CAM
Air
CY
, 百拇医药
NS
CAM
Air
CY
NS
S
CAM
Air
CY
NS
C
DTH(-)
+
+
, 百拇医药
+
+
-
+
+
+
+
DTH
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
CR
+
+
+
+
+
+
+
+
+
UCR
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ECY
+
+
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
ECAM
+
+
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
CAM: camphor odor; CY: cyclophosphamide; NS: normal saline; S: sensitization; C: challenge; LMIF: leukocyte migration inhibitory factor; DTH: delayed type hypersensitivity; DTH(-): NS was smeared instead of DNCB on abdominal skin in day 1; CR: conditioned response; UCR: unconditioned response; ECY: effect of CY 6 days after administration; ECAM: effect of camphor odor on DTH response. n=7 in each group
1.7 血清的制备和注射 实验第6 d处理程序结束后6 h，将非条件反应组和条件反应组小鼠经眼内眦静脉取血后处死，制备血清。血清分为两部分，一部分不作透析，其中非条件反应组血清和条件反应组血清分别称为第1和第2组；另一部分为透析血清，用阻滞相对分子质量10 000的透析袋4℃透析24 h，其中非条件反应组血清和条件反应组血清分别称为第3和第4组。将这两部分4组血清置-20℃保存备用。
, http://www.100md.com
取正常LACA雄性小鼠，分为第1、2、3和4组，每组6只。实验第1 d 4组动物均被给予DNCB涂腹致敏，第6 d 4组动物分别给予尾静脉注射第1、2、3、4组分血清(200μL/只)，然后以DNCB涂左耳。第7 d剪耳称重，检测皮肤DTH反应(表2)。
表 2 条件性反应小鼠血清抑制正常小鼠皮肤迟发过敏反应的实验程序
Table 2 Treatment schedule for testing the effect of the conditioned serum on delayed type hypersensitivity response of skin in normal mice
Group
Day0 treatment
Day1 treatment
, 百拇医药
Day6 treatment
Day7 treatment
Weighing ears
CAM
Air
CY
NS
CAM
Air
CY
NS
S
CAM
, http://www.100md.com
Air
CY
NS
C
B
UCR(11)
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+(6)
+(5)
CR(15)
+
+
+
+
+
+
+
+
+(8)
+(7)
NOR1
, http://www.100md.com
+
iv serum 1
+
+
NOR2
+
iv serum 2
+
+
NOR3
+
iv serum 3
+
, http://www.100md.com
+
NOR4
+
iv serum 4
+
+
CAM: camphor odor; CY: cyclophosphamide; NS: normal saline; S: sensitization; C: challenge; UCR: unconditioned response; CR: conditioned response; iv: intravenous; NOR: normal mice (n=6 in each group); B: bloodletting. The number in parenthesis represents the number of mouse used. Serum 1: UCR serum; Serum 2: CR serum; Serum 3: dialyzed UCR serum; Serum 4: dialyzed CR serum
, 百拇医药
1.8 数据处理 实验数据以均值±标准误(x±sx)表示，以方差分析(ANOVA)进行显著性检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 环磷酰胺条件性抑制DTH反应动物模型的建立
2.1.1 皮肤DTH反应：结果如图1A所示，DTH组与DTH阴性组相比差异有显著性(P<0.001)；非条件反应组与DTH组相比差异有显著性(P<0.001)；条件反应组与DTH组相比差异有显著性(P<0.001)但与非条件反应组相比差异不显著(P>0.05)；CY对照组与DTH组相比差异不显著(P>0.05)；樟脑对照组与DTH组相比差异也不显著(P>0.05)。
2.1.2 DTH反应的LMIF活性测定：结果如图1B所示，DTH组与对照组相比差异有显著性(P<0.001)；非条件反应组与DTH组相比差异显著(P<0.05)；条件反应组与DTH组相比差异显著(P<0.01)，但与非条件反应组相比差异不显著(P>0.05)；CY对照组与DTH组相比差异不显著(P>0.05)；樟脑对照组与条件反应组相比差异显著(P<0.05)，与非条件反应组相比差异也显著(P<0.05)，但与DTH组相比差异不显著(P>0.05)。
, 百拇医药
图1A 环磷酰胺条件性抑制皮肤迟发过敏反应
Fig 1A Conditioned cyclophosphamide immuno-
suppression on DTH response of skin in mice
***: P<0.001 compared with DTH (-); +++: P<0.001 compared with DTH (ANOVA). DTH: delayed type hypersensitivi- ty; CR: conditioned response; UCR: unconditio- ned response; ECY: effect of cyclophosphamide 6 days after administration; ECAM: effect of camphor odor on DTH response. n=7 in each group
, http://www.100md.com
图1B 环磷酰胺条件性抑制LMIF活性
Fig 1B Conditioned cyclophosphamide immuno-
suppression on LMIF activity
***: P<0.001 compared with control; +: P<0.05 compared with DTH;++: P<0.01 compared with DTH; #: P<0.05 compared with CR and UCR (ANOVA). LMIF： leukocyte migration inhibitory factor; DTH: delayed type hypersensitivity; CR: conditioned response; UCR: unconditioned response; ECY: effect of cyclophosphamide 6 days after administration; ECAM: effect of camphor odor on DTH response. n=7 in each group
, 百拇医药
2.2 条件性反应小鼠血清对正常小鼠皮肤DTH反应的影响 结果如图2所示：给4组经过DNCB致敏和激发过敏的小鼠尾静脉分别注入4种不同组分的血清后，第2组与第1组小鼠左/右耳重之比差异有显著性(P<0.01)；第4组与第3组小鼠左/右耳重之比差异无显著性(P>0.05)。第3、4组的左/右耳重比值与第1、2组的左/右耳重比值之间差异也无显著性(P>0.05)。
图2 条件性反应小鼠血清对正常小鼠皮肤迟发过敏反应的影响
Fig 2 Effect of the conditioned serum on delayed type hypersensitivity response of skin in normal mice
**: P<0.01 compared with group 1 (ANOVA). UCR: unconditioned response; CR: conditioned response. n=6 in each group
, http://www.100md.com
3 讨论
3.1 关于条件性抑制DTH反应的动物模型 本实验选用DTH皮肤反应和LMIF活性测定作为免疫指标，建立了条件性环磷酰胺抑制DTH反应的整体和离体模型。(1) 两种模型均设置了6个组(图1A、图1B)。其中DTH组与DTH阴性组(或对照组)相比差异显著[P<0.001(图1A)，P<0.001(图1B)]，说明DTH反应出现了阳性结果。已知皮肤DTH反应出现阳性结果是由于小鼠在第1 d以DNCB涂腹致敏后，第6 d以DNCB涂左耳激发过敏造成左耳充血和水肿，重量增加，因此左/右耳重之比明显大于DTH阴性组；DNCB引起LMIF活性升高的原因是由于致敏T淋巴细胞与相应的抗原反应能够释放出多种生物活性物质，其中之一是LMIF[8]。LMIF的含量与DTH反应有明显的相关性，即DTH反应越强，LMIF含量越高[9]。我们利用间接毛细管方法结合分光光度计，测定游出细胞的D(λ)值。D(λ)值越小说明游出的细胞数越少，提示LMIF的活性越大。(2) 图1示，非条件反应组与DTH组相比差异显著[P<0.001(图1A)，P<0.05(图1B)]，说明非条件刺激CY能够抑制DTH反应；条件反应组与DTH组相比差异显著[P<0.001(图1A)，P<0.01(图1B)]而与非条件反应组相比差异不显著，说明小鼠经过非条件刺激与樟脑结合/强化训练后，樟脑已由无关刺激变成条件刺激，它所引起的条件反应模拟了CY非条件刺激引起的免疫抑制反应。(3) 为了验证条件反应组出现的抑制作用是否由于CY注射后的后遗作用引起，实验中设置了CY对照组，结果表明CY对照组与DTH组相比没有差异，提示CY用药6 d后已经不会抑制DTH，因此说明条件反应组出现的DTH反应抑制不是由CY本身引起。(4) 我们还设置了樟脑对照组。图1A显示了樟脑对照组与DTH组相比差异不显著；图1B显示了樟脑对照组抑制LMIF活性的作用略强于DTH组，但经过检验两组差异并没有统计学意义(P>0.05)，而且樟脑对照组不论是与条件反应组相比还是与非条件反应组相比差异均显著(P值分别<0.05)，因此能够排除樟脑本身及实验操作过程等因素对结果的影响。总之，通过这些对照，最后明确了条件反应组的DTH反应减弱是由于已建立了条件反应的结果。
, http://www.100md.com
3.2 关于条件性免疫反应的机制 1992年加拿大Gorczynski的一项研究发现，在孕期小鼠条件性免疫抑制反应的过程中，可能产生了某些物质，这些物质可通过胎盘或经乳汁传递给乳鼠，从而抑制子代的免疫功能[10]。这究竟是一种什么性质的物质?由什么部位产生?至今未见进一步报道。本实验第二部分的结果表明，将建立了条件性免疫抑制反应的小鼠血清注入正常小鼠体内，正常小鼠的皮肤DTH反应也被抑制，说明条件性反应小鼠的血清中存在某种物质介导了这种抑制效应。如果用阻滞相对分子质量10 000的透析袋将血清透析处理后，这种抑制作用完全消失。初步提示这种介导物质是一种(或一类)小分子物质。这项研究工作刚刚开始，关于它的其它生化特性及其与Gorczynski报道的因子的关系，还有待进一步阐明。本研究建立的条件性抑制LMIF反应的体外模型将为进一步分析血清中这种介导物质的生化特性提供一个十分方便的检测手段。
基金项目：卫生部基金资助项目(95-2-23)
, 百拇医药
作者简介：梅林(1956年生)，女，湖南省人，博士，副教授，现任北京生理科学会理事。1999-02～1999-08有香港大学研修。
作者单位：梅林(北京医科大学生理学系)
李乐群(北京医科大学免疫学系，北京 100083)
邓玉兰(北京医科大学免疫学系，北京 100083)
孙长伟(北京医科大学生理学系)
丁桂凤(北京医科大学免疫学系，北京 100083)
范少光(北京医科大学生理学系)
参考文献
[1]Hiramoto RN, Roger CF, Demissie S, et al. Psychoneuroendocrine immunology: site of recognition, learning and memory in the immune system and the brain[J]. Int J Neurosci, 1997, 92(3-4): 259-285.
, http://www.100md.com
[2]Cohen N, Moynihan JA, Ader R. Pavlovian conditioning of the immune system [J]. Int Arch Allergy Immunol, 1994, 105(2): 101-106.
[3]Klosterhalfen S, Klosterhalfen W. Conditioned cyclosporine effects but not conditioned taste aversion in immunized rats [J]. Behav Neurosci, 1990, 104(5):716-724.
[4]Rogers C, Ghanta V, Huseh CM, et al. The direction of the conditioned natural killer cell response can be re-directed with indomethacin and/or handling [J]. Int J Neurosci, 1992, 67(1-4): 229-239.
, 百拇医药
[5]Gorczynzki RM, Macrea S, Kennedy M. Conditioned immune response associated with allogeneic skin grafts in mice [J]. J Immunol, 1982, 129(2):704-709.
[6]Ghanta VK, Hiramoto NS, Soong SJ, et al. Conditioning of the secondary cytotoxic T-lymphocyte response to YC8 tumor [J]. Pharmacol Biochem Behav, 1995, 50(3): 399-403.
[7]纪敏，刘登奇，叶天星. MIF光密度检测法的研究. 中国免疫学杂志[J]，1988，4(3)：173-175.
[8]应大明.T淋巴细胞功能的检测.陶义训审编，临床免疫学检验[M]. 上海：科学技术出版社，1983. 77-83.
, 百拇医药
[9]Malorny U, Goebeler M, Gutwald J, et al. Difference in migration inhibitory factor production by C57B1/6 and BALB/c mice in allergic and irritant contact dermatitis [J]. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1990, 92(4): 356-360.
[10]Gorczynski RM. Conditioned stress responses by pregnant and/or lactating mice reduce immune responses of their oppspring after weaning [J]. Brain Behav Immun, 1992, 6(1)：87-95., 百拇医药