癫痫发作后脑内一氧化氮、一氧化氮合酶及相应氨基酸的变化
赵秀鹤 迟兆富 邓小梅 卜宏磊
摘 要：目的 探讨NO在癫痫的病理生理过程中的作用及可能作用机制。方法 将大鼠随机分为对照组，实验性癫痫组，L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)抑制组，分别取双侧海马及颞叶皮层组织测定NO，NOS及相应氨基酸的含量。结果 致痫后NOS活性上升>50%。NO含量明显上升，60分钟组NO含量明显下降。L-Arg, Glu含量均显著上升。GABA则明显下降。不同剂量的L-NAME均抑制痫性发作及相应指标的变化。癫痫患者脑脊液中NO，NOS含量均较对照组明显上升。结论 NO参与癫痫发生的机制，但对其维持作用并不重要。其致痫机制仅部分与兴奋性氨基酸有关。
关键词：癫痫 一氧化氮 一氧化氮合酶 氨基酸
最近几年，国内外不少学者研究了一氧化氮(nitric oxide,NO)在癫痫病理生理过程中的作用及可能的作用机制，结论却不尽相同。有研究指出NO是一种内源性致痫物质，也有实验支持NO具有抗痫性。本文以海人酸(kainicacid, KA)致痫的大白鼠模型作为研究对象，测定脑内的NO、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)及谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、L-精氨酸(L-Arg)的含量；同时测定3日内有发作的癫痫患者脑脊液中NO及NOS的浓度，探讨NO和癫痫的关系。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物的选择与分组 选用健康雄性Wistar大鼠70只，体重100～150 g。随机分为空白对照组(A组)，实验性癫痫组(B1组和B2组)，腹腔注射KA 15 mg/kg,B1组30分钟处死，B2组60分钟处死；低剂量NOS抑制剂组(C1组和C2组)，预先腹腔注射L-硝基精氨酸甲酯(L-N-nitro-arginine methyl ester, L-NAME)20 mg/kg，30分钟后腹腔注射KA(15 mg/kg)，余处理同上；高剂量NOS抑制剂组(D1组和D2组)，腹腔注射L-NAME 100 mg/kg,余处理同低剂量组。
1.2 临床病例采集 病例来源于山东医科大学附属医院神经内科门诊、急诊室1997年5月至1997年11月期间就诊的癫痫患者，根据国际抗癫痫联盟1981年痫性发作分类方案及1989年癫痫综合征分类修正方案，筛选复杂部分性发作且于发作3日内就诊的癫痫患者20例，行腰穿检查，留取脑脊液待测。以上病例的病史及体检均排除难产、感染等，CT、MR检查排除脑内有明确病灶。所有病例均常规服用抗癫痫药物。对照组16例，来自山东医科大学附属医院普外科及骨外科病房良性疾病行腰麻者，病史、体检及实验室检查均排除心、脑、内分泌等疾病。
, 百拇医药
1.3 标本收集及测定方法 取大鼠双侧海马及颞叶皮层组织，分别称重、匀浆，上清液液氮保存，一侧待测NO和NOS(具体测定按试剂盒说明书进行)，另一侧待测氨基酸(采用高效液相色谱法)。
主要试剂：KA购自美国Sigma公司；L-NAME购自上海伯奥生物科技有限公司(批号：960607)；NO及NOS试剂盒均购自南京聚力生物医学研究所。
1.4 统计学分析 所有计量资料结果均采用均数±标准差(X±s)表示，统计学处理采用t检验和线性相关分析。
2 结果
2.1 癫痫发作的潜伏期及强度 B组大鼠发作潜伏期10～25 min，一般首先表现为面肌及口角抽搐，随后有持续时间比较长的后肢阵挛性抽动，严重者有狂跑、四肢强直性发作、摔倒等。C1、C2组除1只出现四肢抽搐外，余直至处死均未发作。
, http://www.100md.com
2.2 各组大鼠海马及颞叶皮层组织L-Arg含量测定结果 见表1。
表1 各组海马及颞叶皮层组织L-Arg,Glu,GABA
含量测定结果(X±s)(单位：nmol/g)
组别
例数
L-Arg
Glu
GABA
对照组
10
90.06±14.22
, 百拇医药
366.55±67.79
120.13±43.37
B1
10
167.64±43.601)2)
557.33±104.753)4)5)
47.53±24.243)5)
B2
10
273.05±62.341)
, http://www.100md.com
685.65±151.013)6)
33.15±15.903)6)
C1
10
44.28±20.231)2)
231.58±93.103)
75.15±34.223)
C2
10
40.41±10.581)
, http://www.100md.com
252.71±84.863)
134.56±36.57
D1
10
30.26±9.101)2)
173.41±64.083)
107.88±18.96
D2
10
23.86±8.831)
, http://www.100md.com
125.76±40.923)
108.95±23.51
1)与对照组比较，P<0.05；2)与同组内分组比较，P<0.05；3)与对照组比较，P<0.01；4)与B2组比较，P<0.05；5)与C1、D1组比较，P<0.05；6)与C2、D2组比较，P<0.05
2.3 各组大鼠脑内Glu含量测定结果 见表1。
2.4 各组大鼠脑内GABA含量测定结果 见表1。
2.5 各组大鼠海马及颞叶皮层NO含量测定结果 见表2。
表2 各组海马及颞叶皮层NO和NOS测定结果(X±s)
, 百拇医药
组别
例数
NO(μmol/g)
NOS(U/mL)
对照组
10
3.72±0.63
23.41±3.51
B1
10
7.21±2.861)3)
36.40±1.812)
, http://www.100md.com
B2
10
4.55±2.69
35.97±2.252)
C1
10
4.18±1.29
12.14±1.982)
C2
10
3.90±2.06
, http://www.100md.com
11.53±1.482)
D1
10
2.67±0.98
2.37±0.482)
D2
10
2.92±1.17
2.67±0.942)
1)与对照组比较，P<0.05； 2)与对照组比较，P<0.01； 3)与C1、D1组比较，P<0.05
, 百拇医药
2.6 各组大鼠脑内NOS活性测定结果 见表2。与对照组比较，B1组NOS活性升高55.48%，B2组升高53.62%，C、D组NOS活性均显著下降，C组下降48.14%～50.72%，D组下降88.64%～89.88%。C、D各组内分组间NOS活性无显著性差异(P>0.05)。
2.7 30分钟实验性癫痫组(B1组)NO含量与L-Arg,Glu,GABA含量的相关分析 NO与L-Arg之间成显著线性正相关关系(r=0.8650,P<0.0025)；NO与Glu、GABA之间无直线相关关系(P>0.05)。
2.8 60分钟实验性癫痫组(B2组)NO含量与L-Arg，Glu、GABA含量的相关分析 NO含量与其他3种物质含量均无线性相关关系(P>0.05)。
2.9 癫痫患者及对照组脑脊液中NO及NOS含量测定结果 癫痫患者脑脊液中NO含量[(247.5±79.68)μmol/L]、NOS活性[(1610±180)U/L]均显著高于对照组[(82.10±39.44)μmol/L和(690±140)U/L]，P<0.05。
, 百拇医药
3 讨论
NO是在NOS的催化下由L-Arg生成。NOS在脑内广泛存在。我们的研究表明，注射KA后30分钟，NOS活性增高55.48%，60分钟增高53.62%。20 mg/kg的L-NAME抑制大约50%的NOS活性，100 mg/kg的L-NAME抑制NOS活性达90%，而且不同剂量的L-NAME均完全抑制了痫性发作。Bagetta.G等的实验结果与我们基本相同[1]。而有试验则认为[2，3]，NOS活性受抑50%时表现为抗痫性，只有抑制活性达95%以上才对惊厥的持续时间有影响。
我们的试验表明，在致痫30分钟时海马及颞叶皮层中NO含量明显升高，提示NO参与了痫性发作的始动机制。至60分钟NO水平显著下降，提示NO对癫痫的维持作用并不重要。加入不同剂量的L-NAME，抑制了NOS活性，也抑制了痫性发作，表明抑制NO产生能阻断癫痫发作。癫痫患者发作3日内脑脊液中NO，NOS含量均明显升高，支持上述结论。可见，我们的研究支持NO是一种内源性致痫物质，推测内源性NO致痫的机制为[1，4～6]：①直接促进突触前膜Glu等兴奋性氨基酸释放；②抑制Glu的再摄取；③通过cGMP引发的一系列生化反应；④通过其他酶(如ADP-核糖基转移酶)作用于离子通道，引起去极化。
, 百拇医药
本研究结果显示，KA致痫后脑内L-Arg含量显著上升，而且30分钟组与NO成线性正相关，但NO代谢较快，故至60分钟二者无线性关系。Glu含量亦显著上升，60分钟组高于30分钟组，L-NAME可以完全抑制Glu的增高。GABA变化完全相反。NO作用于突触前膜，使Glu释放，同时也抑制了Glu的再摄取，而且胶质细胞也可能释放Glu，故致Glu浓度持续升高，其诱发GABA释放的能力减弱。但60分钟NO下降而Glu仍增高，提示除NO外，可能还有其他作用机制，因为我们的试验表明NO与Glu，GABA间均无线性相关关系。Lonart.G和Rowley.HL等的研究支持我们的观点[7，8]。可见，NO对癫痫的确切作用仍未得到一致的结论。产生不同的实验结果可能与动物模型的选择，用药的途径，发作形式不同等有关，因此仍需作进一步详尽的研究。
本课题由山东省科委资助(课题编号：971226306)
赵秀鹤(原山东医科大学附属医院，现在青岛大学医学院附属医院急诊科 266003)
, 百拇医药
迟兆富(山东医科大学附属医院神经科)
邓小梅(山东医科大学附属医院神经科)
卜宏磊(原山东医科大学附属医院，现在青岛大学医学院附属医院急诊科 266003)
参考文献
1.Bagetta G, Massoud R, Rodino P, et al. Systemic administration of lithium chloride and tacrine increase nitric oxide synthase activity in the hippocampus of rats. Eur J Pharmacol, 1993,237(1):61
2.Rigaud-Monnet AS, Heron A, Seglaz J, et al. Effect of inhibition NO synthesis on hippocampal extracellullar glutamate concentration in seizures induced by kainic acid. Brain Res, 1995, 637(2):297
, 百拇医药
3.Wang Q, Theard MA, Pelligrine DA, et al. Nitric oxide(NOS) is an endogenous convulsant but not a mediator of the increase in cerebral blood flow accompanying bicuculline-induced seizures in rats. Brain Res, 1994,658(2):192
4.Bagetta G, Iannone M, Scorsa AM, et al. Tacrine-induced seizures and brain damage in LiCl-treated rats can be prevented by Nω-nitro-L-arginine methyl ester. Eur J Pharmacol, 1992,213(2):301
5.Yamamoto H. Preventive effect of NG-nitro-L-arginine against L-cysteine-induced seizures in mice. Toxicol Lett, 1996,84(1):1
, http://www.100md.com
6.Osonoe K, Mori N, Suzuki K, et al. Antiepileptic effects of inhibitors of nitric oxide synthase examined in pentylenetetrazole-induced seizures in rats. Brain Res, 1994,663(2):338
7.Rowley HL, Ellis Y, Davies JA. Age-releated effects of NMDA stimulated concomitant release of nitric oxide and glutamate in cortical slices prepared from DBA/2 mice. Brain Res, 1993,613(1):49
8.Lonart G, Wang J, Johnson KM. Nitric oxide induces neurotransmitter release from hippocampal slices. Eur J Pharmacol, 1992,220(2):271, http://www.100md.com
摘 要：目的 探讨NO在癫痫的病理生理过程中的作用及可能作用机制。方法 将大鼠随机分为对照组，实验性癫痫组，L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)抑制组，分别取双侧海马及颞叶皮层组织测定NO，NOS及相应氨基酸的含量。结果 致痫后NOS活性上升>50%。NO含量明显上升，60分钟组NO含量明显下降。L-Arg, Glu含量均显著上升。GABA则明显下降。不同剂量的L-NAME均抑制痫性发作及相应指标的变化。癫痫患者脑脊液中NO，NOS含量均较对照组明显上升。结论 NO参与癫痫发生的机制，但对其维持作用并不重要。其致痫机制仅部分与兴奋性氨基酸有关。
关键词：癫痫 一氧化氮 一氧化氮合酶 氨基酸
最近几年，国内外不少学者研究了一氧化氮(nitric oxide,NO)在癫痫病理生理过程中的作用及可能的作用机制，结论却不尽相同。有研究指出NO是一种内源性致痫物质，也有实验支持NO具有抗痫性。本文以海人酸(kainicacid, KA)致痫的大白鼠模型作为研究对象，测定脑内的NO、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)及谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、L-精氨酸(L-Arg)的含量；同时测定3日内有发作的癫痫患者脑脊液中NO及NOS的浓度，探讨NO和癫痫的关系。
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1 材料与方法
1.1 实验动物的选择与分组 选用健康雄性Wistar大鼠70只，体重100～150 g。随机分为空白对照组(A组)，实验性癫痫组(B1组和B2组)，腹腔注射KA 15 mg/kg,B1组30分钟处死，B2组60分钟处死；低剂量NOS抑制剂组(C1组和C2组)，预先腹腔注射L-硝基精氨酸甲酯(L-N-nitro-arginine methyl ester, L-NAME)20 mg/kg，30分钟后腹腔注射KA(15 mg/kg)，余处理同上；高剂量NOS抑制剂组(D1组和D2组)，腹腔注射L-NAME 100 mg/kg,余处理同低剂量组。
1.2 临床病例采集 病例来源于山东医科大学附属医院神经内科门诊、急诊室1997年5月至1997年11月期间就诊的癫痫患者，根据国际抗癫痫联盟1981年痫性发作分类方案及1989年癫痫综合征分类修正方案，筛选复杂部分性发作且于发作3日内就诊的癫痫患者20例，行腰穿检查，留取脑脊液待测。以上病例的病史及体检均排除难产、感染等，CT、MR检查排除脑内有明确病灶。所有病例均常规服用抗癫痫药物。对照组16例，来自山东医科大学附属医院普外科及骨外科病房良性疾病行腰麻者，病史、体检及实验室检查均排除心、脑、内分泌等疾病。
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1.3 标本收集及测定方法 取大鼠双侧海马及颞叶皮层组织，分别称重、匀浆，上清液液氮保存，一侧待测NO和NOS(具体测定按试剂盒说明书进行)，另一侧待测氨基酸(采用高效液相色谱法)。
主要试剂：KA购自美国Sigma公司；L-NAME购自上海伯奥生物科技有限公司(批号：960607)；NO及NOS试剂盒均购自南京聚力生物医学研究所。
1.4 统计学分析 所有计量资料结果均采用均数±标准差(X±s)表示，统计学处理采用t检验和线性相关分析。
2 结果
2.1 癫痫发作的潜伏期及强度 B组大鼠发作潜伏期10～25 min，一般首先表现为面肌及口角抽搐，随后有持续时间比较长的后肢阵挛性抽动，严重者有狂跑、四肢强直性发作、摔倒等。C1、C2组除1只出现四肢抽搐外，余直至处死均未发作。
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2.2 各组大鼠海马及颞叶皮层组织L-Arg含量测定结果 见表1。
表1 各组海马及颞叶皮层组织L-Arg,Glu,GABA
含量测定结果(X±s)(单位：nmol/g)
组别
例数
L-Arg
Glu
GABA
对照组
10
90.06±14.22
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366.55±67.79
120.13±43.37
B1
10
167.64±43.601)2)
557.33±104.753)4)5)
47.53±24.243)5)
B2
10
273.05±62.341)
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685.65±151.013)6)
33.15±15.903)6)
C1
10
44.28±20.231)2)
231.58±93.103)
75.15±34.223)
C2
10
40.41±10.581)
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252.71±84.863)
134.56±36.57
D1
10
30.26±9.101)2)
173.41±64.083)
107.88±18.96
D2
10
23.86±8.831)
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125.76±40.923)
108.95±23.51
1)与对照组比较，P<0.05；2)与同组内分组比较，P<0.05；3)与对照组比较，P<0.01；4)与B2组比较，P<0.05；5)与C1、D1组比较，P<0.05；6)与C2、D2组比较，P<0.05
2.3 各组大鼠脑内Glu含量测定结果 见表1。
2.4 各组大鼠脑内GABA含量测定结果 见表1。
2.5 各组大鼠海马及颞叶皮层NO含量测定结果 见表2。
表2 各组海马及颞叶皮层NO和NOS测定结果(X±s)
, 百拇医药
组别
例数
NO(μmol/g)
NOS(U/mL)
对照组
10
3.72±0.63
23.41±3.51
B1
10
7.21±2.861)3)
36.40±1.812)
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B2
10
4.55±2.69
35.97±2.252)
C1
10
4.18±1.29
12.14±1.982)
C2
10
3.90±2.06
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11.53±1.482)
D1
10
2.67±0.98
2.37±0.482)
D2
10
2.92±1.17
2.67±0.942)
1)与对照组比较，P<0.05； 2)与对照组比较，P<0.01； 3)与C1、D1组比较，P<0.05
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2.6 各组大鼠脑内NOS活性测定结果 见表2。与对照组比较，B1组NOS活性升高55.48%，B2组升高53.62%，C、D组NOS活性均显著下降，C组下降48.14%～50.72%，D组下降88.64%～89.88%。C、D各组内分组间NOS活性无显著性差异(P>0.05)。
2.7 30分钟实验性癫痫组(B1组)NO含量与L-Arg,Glu,GABA含量的相关分析 NO与L-Arg之间成显著线性正相关关系(r=0.8650,P<0.0025)；NO与Glu、GABA之间无直线相关关系(P>0.05)。
2.8 60分钟实验性癫痫组(B2组)NO含量与L-Arg，Glu、GABA含量的相关分析 NO含量与其他3种物质含量均无线性相关关系(P>0.05)。
2.9 癫痫患者及对照组脑脊液中NO及NOS含量测定结果 癫痫患者脑脊液中NO含量[(247.5±79.68)μmol/L]、NOS活性[(1610±180)U/L]均显著高于对照组[(82.10±39.44)μmol/L和(690±140)U/L]，P<0.05。
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3 讨论
NO是在NOS的催化下由L-Arg生成。NOS在脑内广泛存在。我们的研究表明，注射KA后30分钟，NOS活性增高55.48%，60分钟增高53.62%。20 mg/kg的L-NAME抑制大约50%的NOS活性，100 mg/kg的L-NAME抑制NOS活性达90%，而且不同剂量的L-NAME均完全抑制了痫性发作。Bagetta.G等的实验结果与我们基本相同[1]。而有试验则认为[2，3]，NOS活性受抑50%时表现为抗痫性，只有抑制活性达95%以上才对惊厥的持续时间有影响。
我们的试验表明，在致痫30分钟时海马及颞叶皮层中NO含量明显升高，提示NO参与了痫性发作的始动机制。至60分钟NO水平显著下降，提示NO对癫痫的维持作用并不重要。加入不同剂量的L-NAME，抑制了NOS活性，也抑制了痫性发作，表明抑制NO产生能阻断癫痫发作。癫痫患者发作3日内脑脊液中NO，NOS含量均明显升高，支持上述结论。可见，我们的研究支持NO是一种内源性致痫物质，推测内源性NO致痫的机制为[1，4～6]：①直接促进突触前膜Glu等兴奋性氨基酸释放；②抑制Glu的再摄取；③通过cGMP引发的一系列生化反应；④通过其他酶(如ADP-核糖基转移酶)作用于离子通道，引起去极化。
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本研究结果显示，KA致痫后脑内L-Arg含量显著上升，而且30分钟组与NO成线性正相关，但NO代谢较快，故至60分钟二者无线性关系。Glu含量亦显著上升，60分钟组高于30分钟组，L-NAME可以完全抑制Glu的增高。GABA变化完全相反。NO作用于突触前膜，使Glu释放，同时也抑制了Glu的再摄取，而且胶质细胞也可能释放Glu，故致Glu浓度持续升高，其诱发GABA释放的能力减弱。但60分钟NO下降而Glu仍增高，提示除NO外，可能还有其他作用机制，因为我们的试验表明NO与Glu，GABA间均无线性相关关系。Lonart.G和Rowley.HL等的研究支持我们的观点[7，8]。可见，NO对癫痫的确切作用仍未得到一致的结论。产生不同的实验结果可能与动物模型的选择，用药的途径，发作形式不同等有关，因此仍需作进一步详尽的研究。
本课题由山东省科委资助(课题编号：971226306)
赵秀鹤(原山东医科大学附属医院，现在青岛大学医学院附属医院急诊科 266003)
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迟兆富(山东医科大学附属医院神经科)
邓小梅(山东医科大学附属医院神经科)
卜宏磊(原山东医科大学附属医院，现在青岛大学医学院附属医院急诊科 266003)
参考文献
1.Bagetta G, Massoud R, Rodino P, et al. Systemic administration of lithium chloride and tacrine increase nitric oxide synthase activity in the hippocampus of rats. Eur J Pharmacol, 1993,237(1):61
2.Rigaud-Monnet AS, Heron A, Seglaz J, et al. Effect of inhibition NO synthesis on hippocampal extracellullar glutamate concentration in seizures induced by kainic acid. Brain Res, 1995, 637(2):297
, 百拇医药
3.Wang Q, Theard MA, Pelligrine DA, et al. Nitric oxide(NOS) is an endogenous convulsant but not a mediator of the increase in cerebral blood flow accompanying bicuculline-induced seizures in rats. Brain Res, 1994,658(2):192
4.Bagetta G, Iannone M, Scorsa AM, et al. Tacrine-induced seizures and brain damage in LiCl-treated rats can be prevented by Nω-nitro-L-arginine methyl ester. Eur J Pharmacol, 1992,213(2):301
5.Yamamoto H. Preventive effect of NG-nitro-L-arginine against L-cysteine-induced seizures in mice. Toxicol Lett, 1996,84(1):1
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6.Osonoe K, Mori N, Suzuki K, et al. Antiepileptic effects of inhibitors of nitric oxide synthase examined in pentylenetetrazole-induced seizures in rats. Brain Res, 1994,663(2):338
7.Rowley HL, Ellis Y, Davies JA. Age-releated effects of NMDA stimulated concomitant release of nitric oxide and glutamate in cortical slices prepared from DBA/2 mice. Brain Res, 1993,613(1):49
8.Lonart G, Wang J, Johnson KM. Nitric oxide induces neurotransmitter release from hippocampal slices. Eur J Pharmacol, 1992,220(2):271, http://www.100md.com