山茛菪碱对大鼠移植肝脏保护作用的实验研究
山茛菪碱对大鼠移植肝脏保护作用的实验研究
马凯 卜献民 戴显伟 李延钧 王亮 戴阳
摘要 目的：利用山茛菪碱具有稳定细胞膜和抗氧自由基损伤的作用，在低温保存期间用山茛菪碱对移植肝脏进行保护，从而改善移植肝脏的质量。方法：建立大鼠下腔静脉内分流法自体原位肝移植动物模型。动态观察肝脏氧自由基及酶学的变化。结果：实验组用山茛菪碱可减少再灌流后脂质过氧化物酶(LPO)的增加，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的下降，丙氨酸转氨酶(ALT)乳酸脱氢酶(LDH)的升高，与对照组比较，P<0.01。结论：再灌流前应用山茛菪碱能减少再灌流后氧自由基的产生，可减轻缺血—再灌流对移植肝脏的损伤。
关键词：肝移植 氧自由基 山茛菪碱
肝移植早期并发移植肝术后无功能(PNF)的发生率为2%～23%[1]，其发生原因与移植肝组织缺血缺氧-再灌流损伤有极为密切的关系[2]。近年的体外研究发现山茛菪碱具有稳定细胞膜和抗氧自由基的作用[3-4]。本研究通过在移植肝脏保存期间，保存液中加入山茛菪碱，以达到保护肝细胞膜的作用。
, 百拇医药
材料与方法
1.大鼠自体原位肝移植动物模型的建立[5]：上腹正中切口，切断肝周各韧带，充分游离肝脏，切开肝下下腔静脉(IVC)，内置“卜”字型三通管，上端超过肝上缘5mm，结扎IVC切口上下端；阻断肝动脉；切断门静脉，其远端与“卜”字型三通管另一口连接，行门-腔静脉临时性分流；使下腔静脉及门静脉血液经管内回流至心脏。近端插管注入含肝素1mg的生理盐水5ml，在肝上内置管处临时结扎肝上下腔静脉(SVC)，打开IVC切口上方结扎线，经门静脉持续低温灌洗，使保存液从内置管外经IVC切口流出。灌洗保存液以0～4℃乳酸林格氏液为基础液，每升加地塞米松10mg，ATP100mg，胰岛素100U；各种实验因素处理后，再灌流前用36℃血定安(琥珀酰明胶)40ml经门静脉(PV)注入，使肝脏复温，取出“卜”字型三通管，套管法连接门静脉，解除肝动脉阻断，修补IVC切口，恢复肝脏再灌流。肝脏在体持续灌洗低温保存4h，灌注压力为90～100cmH2O，流速8～12ml/min。
, 百拇医药
2.实验动物选择与分组：选用Wistar系雄性大鼠20只，体重(300±30)g，鼠龄10～12周。将20只大鼠分成两组，即实验组与对照组，每组各10只。实验组在灌洗保存液中加入山茛菪碱40mmol/L，对照组不加山茛菪碱。
表1 山茛菪碱对大鼠肝脏氧自由基动态变化的影响(x±s)
检测时间
检测项目
LPO(nmol/100mg)
SOD(nU/mg)
GSH-Px(nU/mg)
实验组
对照组
, 百拇医药
实验组
对照组
实验组
对照组
血流阻断前
48.50±2.53
53.80±2.19
109.70±4.23
105.00±7.33
81.70±1.49
78.70±1.59
再灌流前
, 百拇医药
61.10±5.12
72.30±2.44
100.20±5.66
97.60±6.35
75.50±1.65
72.50±0.61
再灌流后30min
164.40±10.55
273.30±14.61
72.50±5.60
55.10±6.47
, http://www.100md.com
56.80±1.86
49.30±2.48
再灌流后60min
142.40±11.35
242.40±11.92
61.50±6.99
43.10±6.61
49.90±2.60
41.60±3.08
注：每组检测例数均为10只
表2 山茛菪碱对大鼠肝脏酶学的影响(x±s)
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检测时间
检 测 项 目
ALT(U/L)
LDH(U/L)
实验组
对照组
实验组
对照组
血流阻断前
255.50±0.86
234.50±1.46
2918.00±11.76
, 百拇医药
3191.00±11.16
再灌流后60min
1252.76±30.91
2649.50±38.24
7771.00±76.39
13058.00±89.89
3.样本的采集与检测：肝血液阻断前、再灌流前及再灌流后30min、60min各取肝组织500mg，测肝组织中SOD(邻苯三酚自氧化抑制法)、GSH-Px(DTNB比色法)、LPO(硫代巴比妥酸法)。在肝血流阻断前及再灌流后60min各取下腔静脉血1ml。测血清中ALT(连续检测法)、LDH(连续检测法)。
4.统计分析：各指标用平均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P<0.05为差异具有显著性。结 果
, 百拇医药
1.山茛菪碱对肝脏氧自由基动态变化的影响：肝脏血流阻断前、再灌流前和再灌流后30min、60min的LPO、SOD、GSH-Px的动态变化差异均有极显著性(P<0.01)，见表1。而且再灌流后30min、60minLPO的增加和SOD、GSH-Px的下降，实验组和对照组比较差异有极显著性(P<0.01)；说明氧自由主要产生于再灌流后，但用山茛菪碱可减少LPO的增加和SOD、GSH-Px的下降。
2.山茛菪碱对再灌流后肝脏酶学的影响：肝脏血流阻断前与再灌流后60min之间比较，血清ALT、LDH差异有极显著性(P<0.01)；再灌流后60minALT、LDH明显增高，见表2。再灌流后60min实验组和对照组之间ALT、LDH差异有极显著性(P<0.01)；对照组ALT和LDH明显增高。说明再灌流可使肝细胞受损伤，但山茛菪碱可减轻这种损伤。
讨 论
大鼠原位肝移植模型是肝移植基础研究的重要实验方法。1973年Lee首次报道了大鼠原位肝移植，但手术时间长，难度大、成功率低，因此任何减轻损伤，缩短手术时间在移植技术上的改进措施都具有重要意义。1980年Miyata[6]改用袖套法吻合SVC、IVC、PV获得成功，显著地缩短了无肝期。然而，大鼠下腔静脉管壁薄，SVC部位较深且固定，应用不当会发生袖套扭转、脱落及静脉张开不全，导致静脉回流不畅等并发症，但手术成功率仍较低。本模型避免了手术难度较大的SVC、IVC、肝动脉、胆总管的吻合，简化了手术的难度；灌洗保存前经PV注入盐水，可驱使肝内血液进入血液循环，相当于自家输血，增加手术耐受力；肝脏在体低温保存期间保持下腔静脉及PV血流通畅，肝脏低温保存期间及再灌流后血液循环动力学稳定，其余手术步骤与异体原位肝移植完全相同。本模型简单易行、手术时间短、重复性好，可排除血管吻合技术上的困难及排斥反应，减少并发症的发生，从而提高了动物个体之间各处理因素所得结果的可比性。
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氧自由基损害和微循环障碍是移植肝术后无功能的重要原因之一[1-2]。近年的体外研究发现山茛菪碱具有稳定细胞膜和抗氧自由基的作用，对细胞的损伤具有保护作用[4-5]。本研究是在低温保存期间用山茛菪碱对移植肝脏进行保护，结果显示：山茛菪碱对低温保存期间的LPO、SOD和GSH-Px无明显影响；但可明显减少肝脏再灌流后LPO的产生，阻止SOD和GSH-Px的下降，其结果与血清ALT和LDH改变相同步。在缺血-再灌流时，细胞内Ca2+增多，激活Ca2+依赖性蛋白酶，Ca2+依赖性蛋白酶可使黄嘌呤脱氢酶转为黄嘌呤氧化酶(XOD)，再灌流时大量O2的供应，次黄嘌呤、黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下通过有氧氧化途径产生尿酸，同时产生大量氧自由基。而山茛菪碱抗氧自由基作用的机制是与Ca2+发生拮抗作用，从而抑制黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化，减少再灌流时次黄嘌呤、黄嘌呤产生的超氧阴离子，间接达到抗氧自由基的作用，减轻细胞膜脂质过氧化损伤，稳定细胞膜，从而减轻再灌流时的肝脏损伤[4]。
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基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(962280)
作者单位：马 凯(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
卜献民(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
戴显伟(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
王 亮(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
戴 阳(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
李延钧(抚顺矿务局总医院肿瘤科)
参考文献
[1]Claven PA, Harvey PRC, Strasberg SM, et al. Preservation and reperfusion injuries in liver allografts. Transplantation, 1992, 53:957-978.
, http://www.100md.com
[2]Ploeg RJ， D'Alessandro AM, Knechtle SJ, et al. Risk factors for primary dysfunction after liver transplantation multivariate analysis. Transplantation, 1993, 55:807-813.
[3]赵世民. 茛菪碱类药物的抗氧自由基作用. 微循环技术杂志， 1993， 3:166-167.
[4]孙晓青，谢桐，徐达，等.环孢素及山茛菪碱对大鼠原代培养肝细胞酶释放的影响. 中华泌尿外科杂志， 1995， 16：270-272.
[5]马凯，卜献民，戴显伟，等.下腔静脉内分流法大鼠自体肝原位移植模型. 中国医科大学学报， 1998， 27：356-358.
[6]Migata M, Fischer JH, Fuhs M, et al. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat: cuft technique for three vascular anastomoses. Transplantation, 1980, 30:335-340., 百拇医药
马凯 卜献民 戴显伟 李延钧 王亮 戴阳
摘要 目的：利用山茛菪碱具有稳定细胞膜和抗氧自由基损伤的作用，在低温保存期间用山茛菪碱对移植肝脏进行保护，从而改善移植肝脏的质量。方法：建立大鼠下腔静脉内分流法自体原位肝移植动物模型。动态观察肝脏氧自由基及酶学的变化。结果：实验组用山茛菪碱可减少再灌流后脂质过氧化物酶(LPO)的增加，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的下降，丙氨酸转氨酶(ALT)乳酸脱氢酶(LDH)的升高，与对照组比较，P<0.01。结论：再灌流前应用山茛菪碱能减少再灌流后氧自由基的产生，可减轻缺血—再灌流对移植肝脏的损伤。
关键词：肝移植 氧自由基 山茛菪碱
肝移植早期并发移植肝术后无功能(PNF)的发生率为2%～23%[1]，其发生原因与移植肝组织缺血缺氧-再灌流损伤有极为密切的关系[2]。近年的体外研究发现山茛菪碱具有稳定细胞膜和抗氧自由基的作用[3-4]。本研究通过在移植肝脏保存期间，保存液中加入山茛菪碱，以达到保护肝细胞膜的作用。
, 百拇医药
材料与方法
1.大鼠自体原位肝移植动物模型的建立[5]：上腹正中切口，切断肝周各韧带，充分游离肝脏，切开肝下下腔静脉(IVC)，内置“卜”字型三通管，上端超过肝上缘5mm，结扎IVC切口上下端；阻断肝动脉；切断门静脉，其远端与“卜”字型三通管另一口连接，行门-腔静脉临时性分流；使下腔静脉及门静脉血液经管内回流至心脏。近端插管注入含肝素1mg的生理盐水5ml，在肝上内置管处临时结扎肝上下腔静脉(SVC)，打开IVC切口上方结扎线，经门静脉持续低温灌洗，使保存液从内置管外经IVC切口流出。灌洗保存液以0～4℃乳酸林格氏液为基础液，每升加地塞米松10mg，ATP100mg，胰岛素100U；各种实验因素处理后，再灌流前用36℃血定安(琥珀酰明胶)40ml经门静脉(PV)注入，使肝脏复温，取出“卜”字型三通管，套管法连接门静脉，解除肝动脉阻断，修补IVC切口，恢复肝脏再灌流。肝脏在体持续灌洗低温保存4h，灌注压力为90～100cmH2O，流速8～12ml/min。
, 百拇医药
2.实验动物选择与分组：选用Wistar系雄性大鼠20只，体重(300±30)g，鼠龄10～12周。将20只大鼠分成两组，即实验组与对照组，每组各10只。实验组在灌洗保存液中加入山茛菪碱40mmol/L，对照组不加山茛菪碱。
表1 山茛菪碱对大鼠肝脏氧自由基动态变化的影响(x±s)
检测时间
检测项目
LPO(nmol/100mg)
SOD(nU/mg)
GSH-Px(nU/mg)
实验组
对照组
, 百拇医药
实验组
对照组
实验组
对照组
血流阻断前
48.50±2.53
53.80±2.19
109.70±4.23
105.00±7.33
81.70±1.49
78.70±1.59
再灌流前
, 百拇医药
61.10±5.12
72.30±2.44
100.20±5.66
97.60±6.35
75.50±1.65
72.50±0.61
再灌流后30min
164.40±10.55
273.30±14.61
72.50±5.60
55.10±6.47
, http://www.100md.com
56.80±1.86
49.30±2.48
再灌流后60min
142.40±11.35
242.40±11.92
61.50±6.99
43.10±6.61
49.90±2.60
41.60±3.08
注：每组检测例数均为10只
表2 山茛菪碱对大鼠肝脏酶学的影响(x±s)
, http://www.100md.com
检测时间
检 测 项 目
ALT(U/L)
LDH(U/L)
实验组
对照组
实验组
对照组
血流阻断前
255.50±0.86
234.50±1.46
2918.00±11.76
, 百拇医药
3191.00±11.16
再灌流后60min
1252.76±30.91
2649.50±38.24
7771.00±76.39
13058.00±89.89
3.样本的采集与检测：肝血液阻断前、再灌流前及再灌流后30min、60min各取肝组织500mg，测肝组织中SOD(邻苯三酚自氧化抑制法)、GSH-Px(DTNB比色法)、LPO(硫代巴比妥酸法)。在肝血流阻断前及再灌流后60min各取下腔静脉血1ml。测血清中ALT(连续检测法)、LDH(连续检测法)。
4.统计分析：各指标用平均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P<0.05为差异具有显著性。结 果
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1.山茛菪碱对肝脏氧自由基动态变化的影响：肝脏血流阻断前、再灌流前和再灌流后30min、60min的LPO、SOD、GSH-Px的动态变化差异均有极显著性(P<0.01)，见表1。而且再灌流后30min、60minLPO的增加和SOD、GSH-Px的下降，实验组和对照组比较差异有极显著性(P<0.01)；说明氧自由主要产生于再灌流后，但用山茛菪碱可减少LPO的增加和SOD、GSH-Px的下降。
2.山茛菪碱对再灌流后肝脏酶学的影响：肝脏血流阻断前与再灌流后60min之间比较，血清ALT、LDH差异有极显著性(P<0.01)；再灌流后60minALT、LDH明显增高，见表2。再灌流后60min实验组和对照组之间ALT、LDH差异有极显著性(P<0.01)；对照组ALT和LDH明显增高。说明再灌流可使肝细胞受损伤，但山茛菪碱可减轻这种损伤。
讨 论
大鼠原位肝移植模型是肝移植基础研究的重要实验方法。1973年Lee首次报道了大鼠原位肝移植，但手术时间长，难度大、成功率低，因此任何减轻损伤，缩短手术时间在移植技术上的改进措施都具有重要意义。1980年Miyata[6]改用袖套法吻合SVC、IVC、PV获得成功，显著地缩短了无肝期。然而，大鼠下腔静脉管壁薄，SVC部位较深且固定，应用不当会发生袖套扭转、脱落及静脉张开不全，导致静脉回流不畅等并发症，但手术成功率仍较低。本模型避免了手术难度较大的SVC、IVC、肝动脉、胆总管的吻合，简化了手术的难度；灌洗保存前经PV注入盐水，可驱使肝内血液进入血液循环，相当于自家输血，增加手术耐受力；肝脏在体低温保存期间保持下腔静脉及PV血流通畅，肝脏低温保存期间及再灌流后血液循环动力学稳定，其余手术步骤与异体原位肝移植完全相同。本模型简单易行、手术时间短、重复性好，可排除血管吻合技术上的困难及排斥反应，减少并发症的发生，从而提高了动物个体之间各处理因素所得结果的可比性。
, http://www.100md.com
氧自由基损害和微循环障碍是移植肝术后无功能的重要原因之一[1-2]。近年的体外研究发现山茛菪碱具有稳定细胞膜和抗氧自由基的作用，对细胞的损伤具有保护作用[4-5]。本研究是在低温保存期间用山茛菪碱对移植肝脏进行保护，结果显示：山茛菪碱对低温保存期间的LPO、SOD和GSH-Px无明显影响；但可明显减少肝脏再灌流后LPO的产生，阻止SOD和GSH-Px的下降，其结果与血清ALT和LDH改变相同步。在缺血-再灌流时，细胞内Ca2+增多，激活Ca2+依赖性蛋白酶，Ca2+依赖性蛋白酶可使黄嘌呤脱氢酶转为黄嘌呤氧化酶(XOD)，再灌流时大量O2的供应，次黄嘌呤、黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下通过有氧氧化途径产生尿酸，同时产生大量氧自由基。而山茛菪碱抗氧自由基作用的机制是与Ca2+发生拮抗作用，从而抑制黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化，减少再灌流时次黄嘌呤、黄嘌呤产生的超氧阴离子，间接达到抗氧自由基的作用，减轻细胞膜脂质过氧化损伤，稳定细胞膜，从而减轻再灌流时的肝脏损伤[4]。
, http://www.100md.com
基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(962280)
作者单位：马 凯(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
卜献民(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
戴显伟(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
王 亮(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
戴 阳(110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院肝胆外科)
李延钧(抚顺矿务局总医院肿瘤科)
参考文献
[1]Claven PA, Harvey PRC, Strasberg SM, et al. Preservation and reperfusion injuries in liver allografts. Transplantation, 1992, 53:957-978.
, http://www.100md.com
[2]Ploeg RJ， D'Alessandro AM, Knechtle SJ, et al. Risk factors for primary dysfunction after liver transplantation multivariate analysis. Transplantation, 1993, 55:807-813.
[3]赵世民. 茛菪碱类药物的抗氧自由基作用. 微循环技术杂志， 1993， 3:166-167.
[4]孙晓青，谢桐，徐达，等.环孢素及山茛菪碱对大鼠原代培养肝细胞酶释放的影响. 中华泌尿外科杂志， 1995， 16：270-272.
[5]马凯，卜献民，戴显伟，等.下腔静脉内分流法大鼠自体肝原位移植模型. 中国医科大学学报， 1998， 27：356-358.
[6]Migata M, Fischer JH, Fuhs M, et al. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat: cuft technique for three vascular anastomoses. Transplantation, 1980, 30:335-340., 百拇医药