牙骨质非胶原蛋白与牙周组织再生
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国外医学口腔医学分册 2000年1月第27卷第1期
牙骨质非胶原蛋白与牙周组织再生
湖北医科大学口腔医学院 李 纾(综述) 樊明文 李成章(审校)
摘要 牙骨质中含有种类繁多的非胶原蛋白，它们在维持牙周组织的正常解剖结构及病理状态下的组织再生有着重要的作用。本文从牙骨质非胶原蛋白的组成，与牙周组织再生的关系及其促进牙周韧带细胞粘附作用的机制作一综述。
关键词：牙骨质 非胶原蛋白 牙周组织再生
由于牙骨质缺乏血液供应，无淋巴系统及神经系统，传统上一直认为牙骨质是一种相对稳定的或代谢率很低的终末组织。仅起到一种结构作用[1，2]。但最近的研究表明，牙骨质中含有一些与牙骨质形成，牙周韧带附着及牙周韧带细胞(periodontal ligament cell,PDLC)胞外基质的合成等有关的非胶原蛋白质，包括非胶原糖蛋白和非胶原蛋白多糖。这类蛋白质含量甚微，可能不足牙骨质总蛋白的1%，但它们却具有很高的生物活性，有些在牙周组织再生中起着关键性的作用[3～8]。现有有关名称不尽统一，常见的如：牙骨质蛋白提取物(cementum protern extract,CPE)[9]，牙骨质蛋白(cemetum protein)[10],特异性牙骨质结合蛋白(special cementum attachment protein,CAP)[11]等，实际上它们都属于牙骨质非胶原蛋白质类(cementum noncollagenous proteins,CNCPs)。实验表明从健康牙骨质中提取的CNCPs在牙击组织再生的某些关键环节中起着重要调节作用，而从病变牙骨质中提取的CNCPs则无此作用，同时研究证实病变的牙骨质不能支持成纤维细胞的附着与生长，因此不能形成牙周的再生性附着[12，13]。从而推测在牙骨质中含有一些具有生物活性的牙骨质非胶原蛋白，研究它们在牙周组织再生中的作用是当前牙周病研究的一个方向。
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1 牙骨质非胶原蛋白(CNCPs)的组成
同牙釉质及牙本质相比，牙骨质同骨组织有着更多的相似性。因此牙骨质中含有一些在骨组织中也能提取到的非胶原蛋白质，如纤维粘连蛋白(fibronectin,FN),骨桥素(osteopntin,OPN)，玻璃体结合蛋白(vitronectin,VN)，骨钙素(osteocalcin),骨连接素(osteonectin),韧粘素(tenascin)，骨涎蛋白-Ⅱ(bone sialoprotein-Ⅱ,BSP-Ⅱ)等。此外牙骨质中可能还含有微量的成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF),表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)，胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)，转化生长因子(transforming gorwth factor,IGF)，骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等生长因子类物质[14]。但牙骨质在结构和功能上又与骨组织存在着明显的差别，所以其非胶原蛋白的组成及功能肯定存在差异。自Somerman等[15]1985年首先报道牙骨质活性蛋白的提取以来，新的CNCPs不断被分离纯化。利用醋酸，胍和胶原酶三种抽提物粗提，经亲和高效液相色谱纯化等方法，发现在成熟牙骨质中含有大量的“幽灵蛋白”(phantom prtein)[16]，这类蛋白似乎只存在于牙骨质中。根据其分子量的大小不同，分为p22，p23，p24，p36，p55，p61，p68等几种。其中p55为牙骨质胍提取物中的主要成分，该蛋白亦可同时出现在酸提取物中，另外两种重要的CNCPs,p61，p68出现在DE-G(DEAE-cellulose chromatography)提取物中。p36则出现在HS-0.2(heparin-sepharose,0.2 mol/1 NaCl)提取物中，p23,p24未检测到其生物活性，推测可能是在电泳和(或)提取过程中蛋白质发生变性，也可能是由于它们不能结合在培养板上所致。p22为一种高有丝分裂原活性的蛋白质，有人认为该蛋白质就是牙骨质衍化生长因子(cementum derived growth facter，CDGF)[17]。BSP-Ⅱ亦可出现在胍/EDTA提取物中，Western blost显示有三个带可以与BSP-Ⅱ发生交叉反应，p68便是其中一种。是否p68和BSP-Ⅱ为同一种物质，尚需进一步研究证实。而p55，p61，p36皆不与BSP-Ⅱ发生交叉反应。
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2 CNCPs在牙周组织再生中的作用
目前牙周病治疗的结果，大多数是病损组织的修复，而不是真正意义的再生[18]。探索具有生物活性的牙骨质非常胶原蛋白及其在牙周组织再生中的作用，或许能为有效促进牙周组织再生打开开一个新的窗口。
2.1 CNCPs与牙周组织再生的细胞学研究
体外实验表明CNCPs可以诱导在牙周组织再生中具有重要作用的间充质细胞的分化，促进PDLC的增殖、有丝分裂、迁移及在根面的附着，促进牙骨质及牙槽骨的形成，为牙骨组织再生提供必要的信号。CNCPs选择性地作用于PDLC，明显提高该细胞的生物活性。利用离子交换层析法及SDS多向凝胶电泳技术在人牙骨质胍提取物中发现至少有4种与成纤维细胞附着有关的蛋白质(p68，p61，p55，p36)，然而，对人结合上皮细胞在最大实验浓度时仍无明显促附着作用，提示健康的牙根面对成纤维细胞的附着作用大于对上皮细胞的附着作用[10]。牛牙骨质胍-EDTA提取物质可以增强人牙龈成纤维细胞总蛋白及胶原的合成，但其促细胞合成活性低于骨和牙本质的提取物[19]。Pitarus等[11]利用Olson法得到一种部分纯化的以p55为主的特异性牙骨质结合蛋白(CAP)，利用氚标胸腺嘧啶标记体外培养的人牙槽骨细胞(human alveolar bone cell,HABC)，牙周韧带细胞(PDLC)和牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)，研究它们在牙根面小片上的迁移及附着作用，结果证明CAP可选择性的作用于PDLC和HABC而对HGF的作用较弱。体外实验表明CNCPs亦有明显的促成骨特性。利用以p55为主的CNCPs作用于体外培养19 d的Balb/c胎鼠前肢胚芽来源的间充质细胞，当加入浓度分别为1μg/ml和5μg/ml的CNCPs时，软骨结节形成的数目分别增加40.8%和60%。胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成分别增加30%和33%，同时检测到碱性磷酸酶活性的增高和矿化作用的增强，表明CNCPs在体外具有明显的促成骨活性，提示其在新牙骨质形成及牙槽骨的再生中具有明显的促进作用，但该方面的体内研究尚少[9]。
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2.2 CNCPs与细菌内毒素
牙周病患者根面有大量的G-菌和内毒素存在，所在内毒素被认为是影响牙周组织再生的一大障碍[20]。CNCPs与内毒素对成纤维细胞附着的影响及二者间的关系进行研究，从放线共生放线杆菌(Aa)提取内毒素，分别用内毒素、胍提取CNCPs和内毒素/胍提取CNCPs作用于体外培养的成纤维细胞，结果细胞附着率分别为0%，67±14%，73%。据此，只要有CNCPs的存在，内毒素似乎对成纤维细胞的附着无明显影响，但这与临床事实并不相符。推测可能是牙根面的CNCPs在牙周病变时被破坏而丧失或在结构上被修饰，也可能存在着除内毒素以外的CNCPs抑制因子或内毒素包绕了病变根面而阻断了CNCPs与细胞成分的作用[10]。其确切的机制尚需进一步研究。
3 CNCPs促进牙周组织再生的作用机制
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大部分CNCPs(FN，BSP-Ⅱ，OPN，VN，p55等)是通过识别能够和整合素(integrin)类受体相结合的短肽RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列，arginine-glycine-aspartic acid sequence)与靶细胞表面的特异性受体相结合，经跨膜受体而发挥作用[21，22]。人工合成的含RGD序列的肽链，可竞争性抑制CNCPs的这种受体-配体作用，明显抑制CNCPs促成纤维细胞的粘附作用。利用人工合成的含RGD序列的短肽阻肽阻断GuCI/EDTA法提取的CNCPs的作用，发现各组分均不同程度地受到RGD短肽序列的抑制，但有两个组分仅能34%和54%地抑制CNCPs的粘附作用。说明CNCPs中还有一部分不是通过识别RGD短肽序列形式发挥作用，其促粘附机制目前还不清楚。
目前，牙骨质非胶原蛋白在体内的作用研究尚少，促进牙周组织再生的分子机制以及与其它细胞因子的网络调控机制等方面皆需进一步研究。但从目前的体外实验看，牙骨质非胶原蛋白作为存在于牙周组织中的一种重要的信号分子，确实能够调节牙周韧带细胞的细胞活性。, http://www.100md.com
湖北医科大学口腔医学院 李 纾(综述) 樊明文 李成章(审校)
摘要 牙骨质中含有种类繁多的非胶原蛋白，它们在维持牙周组织的正常解剖结构及病理状态下的组织再生有着重要的作用。本文从牙骨质非胶原蛋白的组成，与牙周组织再生的关系及其促进牙周韧带细胞粘附作用的机制作一综述。
关键词：牙骨质 非胶原蛋白 牙周组织再生
由于牙骨质缺乏血液供应，无淋巴系统及神经系统，传统上一直认为牙骨质是一种相对稳定的或代谢率很低的终末组织。仅起到一种结构作用[1，2]。但最近的研究表明，牙骨质中含有一些与牙骨质形成，牙周韧带附着及牙周韧带细胞(periodontal ligament cell,PDLC)胞外基质的合成等有关的非胶原蛋白质，包括非胶原糖蛋白和非胶原蛋白多糖。这类蛋白质含量甚微，可能不足牙骨质总蛋白的1%，但它们却具有很高的生物活性，有些在牙周组织再生中起着关键性的作用[3～8]。现有有关名称不尽统一，常见的如：牙骨质蛋白提取物(cementum protern extract,CPE)[9]，牙骨质蛋白(cemetum protein)[10],特异性牙骨质结合蛋白(special cementum attachment protein,CAP)[11]等，实际上它们都属于牙骨质非胶原蛋白质类(cementum noncollagenous proteins,CNCPs)。实验表明从健康牙骨质中提取的CNCPs在牙击组织再生的某些关键环节中起着重要调节作用，而从病变牙骨质中提取的CNCPs则无此作用，同时研究证实病变的牙骨质不能支持成纤维细胞的附着与生长，因此不能形成牙周的再生性附着[12，13]。从而推测在牙骨质中含有一些具有生物活性的牙骨质非胶原蛋白，研究它们在牙周组织再生中的作用是当前牙周病研究的一个方向。
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1 牙骨质非胶原蛋白(CNCPs)的组成
同牙釉质及牙本质相比，牙骨质同骨组织有着更多的相似性。因此牙骨质中含有一些在骨组织中也能提取到的非胶原蛋白质，如纤维粘连蛋白(fibronectin,FN),骨桥素(osteopntin,OPN)，玻璃体结合蛋白(vitronectin,VN)，骨钙素(osteocalcin),骨连接素(osteonectin),韧粘素(tenascin)，骨涎蛋白-Ⅱ(bone sialoprotein-Ⅱ,BSP-Ⅱ)等。此外牙骨质中可能还含有微量的成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF),表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)，胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)，转化生长因子(transforming gorwth factor,IGF)，骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等生长因子类物质[14]。但牙骨质在结构和功能上又与骨组织存在着明显的差别，所以其非胶原蛋白的组成及功能肯定存在差异。自Somerman等[15]1985年首先报道牙骨质活性蛋白的提取以来，新的CNCPs不断被分离纯化。利用醋酸，胍和胶原酶三种抽提物粗提，经亲和高效液相色谱纯化等方法，发现在成熟牙骨质中含有大量的“幽灵蛋白”(phantom prtein)[16]，这类蛋白似乎只存在于牙骨质中。根据其分子量的大小不同，分为p22，p23，p24，p36，p55，p61，p68等几种。其中p55为牙骨质胍提取物中的主要成分，该蛋白亦可同时出现在酸提取物中，另外两种重要的CNCPs,p61，p68出现在DE-G(DEAE-cellulose chromatography)提取物中。p36则出现在HS-0.2(heparin-sepharose,0.2 mol/1 NaCl)提取物中，p23,p24未检测到其生物活性，推测可能是在电泳和(或)提取过程中蛋白质发生变性，也可能是由于它们不能结合在培养板上所致。p22为一种高有丝分裂原活性的蛋白质，有人认为该蛋白质就是牙骨质衍化生长因子(cementum derived growth facter，CDGF)[17]。BSP-Ⅱ亦可出现在胍/EDTA提取物中，Western blost显示有三个带可以与BSP-Ⅱ发生交叉反应，p68便是其中一种。是否p68和BSP-Ⅱ为同一种物质，尚需进一步研究证实。而p55，p61，p36皆不与BSP-Ⅱ发生交叉反应。
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2 CNCPs在牙周组织再生中的作用
目前牙周病治疗的结果，大多数是病损组织的修复，而不是真正意义的再生[18]。探索具有生物活性的牙骨质非常胶原蛋白及其在牙周组织再生中的作用，或许能为有效促进牙周组织再生打开开一个新的窗口。
2.1 CNCPs与牙周组织再生的细胞学研究
体外实验表明CNCPs可以诱导在牙周组织再生中具有重要作用的间充质细胞的分化，促进PDLC的增殖、有丝分裂、迁移及在根面的附着，促进牙骨质及牙槽骨的形成，为牙骨组织再生提供必要的信号。CNCPs选择性地作用于PDLC，明显提高该细胞的生物活性。利用离子交换层析法及SDS多向凝胶电泳技术在人牙骨质胍提取物中发现至少有4种与成纤维细胞附着有关的蛋白质(p68，p61，p55，p36)，然而，对人结合上皮细胞在最大实验浓度时仍无明显促附着作用，提示健康的牙根面对成纤维细胞的附着作用大于对上皮细胞的附着作用[10]。牛牙骨质胍-EDTA提取物质可以增强人牙龈成纤维细胞总蛋白及胶原的合成，但其促细胞合成活性低于骨和牙本质的提取物[19]。Pitarus等[11]利用Olson法得到一种部分纯化的以p55为主的特异性牙骨质结合蛋白(CAP)，利用氚标胸腺嘧啶标记体外培养的人牙槽骨细胞(human alveolar bone cell,HABC)，牙周韧带细胞(PDLC)和牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)，研究它们在牙根面小片上的迁移及附着作用，结果证明CAP可选择性的作用于PDLC和HABC而对HGF的作用较弱。体外实验表明CNCPs亦有明显的促成骨特性。利用以p55为主的CNCPs作用于体外培养19 d的Balb/c胎鼠前肢胚芽来源的间充质细胞，当加入浓度分别为1μg/ml和5μg/ml的CNCPs时，软骨结节形成的数目分别增加40.8%和60%。胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成分别增加30%和33%，同时检测到碱性磷酸酶活性的增高和矿化作用的增强，表明CNCPs在体外具有明显的促成骨活性，提示其在新牙骨质形成及牙槽骨的再生中具有明显的促进作用，但该方面的体内研究尚少[9]。
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2.2 CNCPs与细菌内毒素
牙周病患者根面有大量的G-菌和内毒素存在，所在内毒素被认为是影响牙周组织再生的一大障碍[20]。CNCPs与内毒素对成纤维细胞附着的影响及二者间的关系进行研究，从放线共生放线杆菌(Aa)提取内毒素，分别用内毒素、胍提取CNCPs和内毒素/胍提取CNCPs作用于体外培养的成纤维细胞，结果细胞附着率分别为0%，67±14%，73%。据此，只要有CNCPs的存在，内毒素似乎对成纤维细胞的附着无明显影响，但这与临床事实并不相符。推测可能是牙根面的CNCPs在牙周病变时被破坏而丧失或在结构上被修饰，也可能存在着除内毒素以外的CNCPs抑制因子或内毒素包绕了病变根面而阻断了CNCPs与细胞成分的作用[10]。其确切的机制尚需进一步研究。
3 CNCPs促进牙周组织再生的作用机制
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大部分CNCPs(FN，BSP-Ⅱ，OPN，VN，p55等)是通过识别能够和整合素(integrin)类受体相结合的短肽RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列，arginine-glycine-aspartic acid sequence)与靶细胞表面的特异性受体相结合，经跨膜受体而发挥作用[21，22]。人工合成的含RGD序列的肽链，可竞争性抑制CNCPs的这种受体-配体作用，明显抑制CNCPs促成纤维细胞的粘附作用。利用人工合成的含RGD序列的短肽阻肽阻断GuCI/EDTA法提取的CNCPs的作用，发现各组分均不同程度地受到RGD短肽序列的抑制，但有两个组分仅能34%和54%地抑制CNCPs的粘附作用。说明CNCPs中还有一部分不是通过识别RGD短肽序列形式发挥作用，其促粘附机制目前还不清楚。
目前，牙骨质非胶原蛋白在体内的作用研究尚少，促进牙周组织再生的分子机制以及与其它细胞因子的网络调控机制等方面皆需进一步研究。但从目前的体外实验看，牙骨质非胶原蛋白作为存在于牙周组织中的一种重要的信号分子，确实能够调节牙周韧带细胞的细胞活性。, http://www.100md.com