神经生长因子对红藻氨酸诱导癫痫发作大鼠海马神经细胞凋亡的影响
刘冰 柳忠兰 何桂芹
摘要 目的：探讨外源性神经生长因子(NGF)对癫痫发作所致海马神经细胞凋亡有无抑制作用。方法：采用红藻氨酸(KA)诱导癫痫大鼠模型，以原位末端标记法(TUNEL)标记DNA片段，检测凋亡细胞在大鼠海马CA1区的动态变化及NGF对其的影响。结果：海马CA1区凋亡细胞在实验24 h出现，48 h明显增多，于72 h达高峰，7 d时最少。给予NGF脑室内注射后，在各相应时间点凋亡细胞数均明显减少(P<0.01)。结论：外源性NGF能抑制癫痫发作所致的海马神经细胞凋亡，NGF对癫痫脑损伤有保护作用。
关键词：神经生长因子 癫痫 鼠 细胞凋亡 红藻氨酸
癫痫是神经科常见的一种慢性疾病。癫痫发作可使脑细胞内外环境发生剧烈改变，从而导致脑损伤。这种脑损伤既有急性脑细胞坏死，也有一些神经细胞经过2～3天(d)后才出现死亡，称为迟发性神经元死亡(DND)。近年研究认为，DND其实是细胞凋亡而不是细胞坏死[1]。神经生长因子(NGF)是一种多肽因子，能营养神经细胞，促进神经细胞的存活和生长。外源性NGF具有抑制脑缺血后脑神经细胞凋亡的作用[2]。但外源性NGF对癫痫神经细胞凋亡是否有拮抗作用尚未见报道。本实验动态观察NGF对急性癫痫发作后大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的影响，旨在探明NGF对癫痫神经细胞凋亡有无抑制作用。
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1 材料和方法
1.1 动物分组 健康雄性Wistar大鼠(中国医科大学实验动物中心提供)78只，体重180～220 g，随机分成5组。A组：正常对照组；B组：安定组；C组：标准药物对照组[红藻氨酸(KA)+安定]；D组：KA致痫组；E组：NGF组(KA+NGF)。其中A组、B组各3只，其余每组24只。
1.2 癫痫动物模型及给药方法 KA(购于Sigma公司)用生理盐水配成2 mg/mL，C、D、E组予KA 10 mg/kg颈部皮下注射；C组在注射KA 15 min后腹腔注射安定5 mg/kg，每小时重复1次，共用8次；B组参照C组予以安定；E组大鼠经戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，固定在脑立体定位仪上，于注射KA 15 min后，向左侧脑室内注射5 μL NGF(人工脑脊液配制，为3.0 μg/μL，军事医学科学院提供)；相同时间点相同给药途径注射生理盐水，使各组大鼠用药次数相等。将针电极插入大鼠双侧大脑皮质和海马，记录脑电图[3]，同时观察动物行为改变。
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1.3 石腊切片制作 在实验24 h、48 h、72 h、7 d分别从C、D、E组随机取出6只，在实验72 h从A组、B组取出全部大鼠，在麻醉下经左心室-主动脉插管后，予以40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS 0.1 mol/L,pH7.4)250 mL灌注，断头取脑，按Paxinos立体定位图谱取右侧海马，后固定24 h，常规脱水、浸蜡、包埋，5 μm厚冠状切片(Bregma平面后3.8 mm)，载玻片涂多聚赖氨酸防脱片，裱片，置62℃温箱过夜。
1.4 原位末端标记检测细胞凋亡 标记凋亡细胞按原位检测凋亡细胞试剂盒(德国宝灵曼公司)设计程序进行：切片常规脱蜡逐级酒精至水化；蛋白酶K(15 μg/mL)消化37℃，30 min；PBS清洗后滴加原位末端标记法(TUNEL)反应液(TDT buffer 8 μL,2 mmol/L Bio-dUTP 3 μL,TDT酶0.4 μL，三蒸水28.6 μL)，37℃ 2 h；滴加SA复合液，37℃ 1 h；DAB显色5～20 min(镜下监测)，显色满意后终止反应；苏木素复染，常规脱水、透明，中性树脂封片，镜下观察。显微计微尺随机计数5个线性长度1 mm的阳性细胞数，取平均值。阳性对照：在标记反应前用200 ng/mL DNA酶Ⅰ(北京华美生物公司)处理30 min；阴性对照：标记反应液省去TDT酶。
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1.5 统计学处理 实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用组间t检验、方差分析、q检验。
2 结果
2.1 脑电图及行为改变 参考Racine[4]的标准，根据惊厥程度将行为表现分为5级。Ⅰ级：咀嚼运动；Ⅱ级：颈部肌肉抽搐；Ⅲ级：一侧前肢阵挛；Ⅳ级：站立并双前肢阵挛；Ⅴ级：四肢抽搐，失去平衡跌倒。
D组和E组大鼠注射KA约30 min后，反复出现Ⅰ～Ⅳ级发作，4 h后癫痫发作减轻且次数减少，8 h后基本无癫痫发作。Ⅰ～Ⅲ级均伴典型棘波，Ⅳ级、Ⅴ级均有高幅棘波。D组与E组大鼠癫痫发作形式、持续时间均无明显差异。A组大鼠无癫痫症状，脑电图未见病理波。B组和C组大鼠处于持续睡眠状态，脑电图呈睡眠脑电图。
2.2 各组大鼠海马CA1神经细胞凋亡 D组大鼠在海马CA1区可见凋亡细胞胞核呈棕褐色(图1)，对各时间点凋亡细胞数行方差分析和q检验，两两比较差异均有显著性(P<0.01)，以实验72 h最多。C组和E组(图2)亦可见少量凋亡细胞，在各相应时间点与D组相比差异均有显著性(P<0.01)。A组、B组均未见凋亡细胞(图3)(附表)。
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图 1 KA致痫组，凋亡神经细胞大量出现
Fig 1 Many apoptotic neurons were found in the KA group×400
图 2 NGF组，凋亡神经细胞明显减少
Fig 2 Apoptotic neurons decreased remarkably in the NGF group×400
附表 不同时间大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的变化
Table Changes of apoptotic neurons in the hippocampus CA1 of the rats at different time(x±s)
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Group
t/h
24
48
72
168
A
-
-
0
-
B
-
-
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0
-
C
3.50±1.05
9.16±2.72
14.67±4.75
3.67±1.03
D
24.83±7.48*
39.50±8.39*
59.33+12.58*
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E
7.17±2.47△
13.45±4.03△
20.42±4.69△
4.67±2.37△
* P<0.01 compared with C group;△ P<0.01 compared with D group.Analysis of t test
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图 3 正常对照组，未见凋亡神经细胞
Fig 3 Apoptotic neurons were not found in the control group×400
3 讨论
细胞凋亡是医学生物学领域的研究热点之一。细胞凋亡是指由于细胞内外因素刺激，触发其本身死亡程序，一种主动的受许多凋亡相关基因严格调控的细胞自我消亡过程。既往认为神经细胞是不易发生凋亡的细胞，癫痫发作所致脑损伤也被认为只是细胞坏死。近年研究表明，细胞凋亡参与癫痫脑损伤过程。本实验发现：安定组与正常对照组均未发现凋亡细胞，提示安定(5 mg/kg ip,q1 h)并无致细胞凋亡作用；用此剂量安定充分抑制癫痫发作的标准药物对照组，可见少量凋亡细胞，证实KA本身能引起细胞凋亡；但在各相应时间点与KA致痫组相比较差异均有显著性(P<0.01)，说明癫痫发作确有致细胞凋亡作用，癫痫发作后神经细胞凋亡主要是由于痫性发作所致。神经细胞凋亡(KA致癫组)在实验24 h(约为癫痫发作后16 h)出现，48 h明显增多，72 h达高峰，7 d仍然可见。均与有关文献报道一致[1]。本实验中正常对照组海马CA1区线性1 mm平均神经细胞数为(212.67±16.53)个。在注射KA 24 h后，KA致痫组在相同区域即有(24.83±7.48)个凋亡神经细胞，72 h达(59.33±12.58)个，提示细胞凋亡在癫痫脑损伤中起着重要作用。加之其迟发且持续存在的特点，引起国内外学者广泛重视。
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NGF是中枢神经系统中最重要的生物活性物质之一。外源性NGF能促进中枢神经细胞再生，维持其存活，减少病理性坏死[5]。近年研究发现，外源性NGF具有抑制神经细胞凋亡作用。Raff[6]等发现，NGF缺乏可激活神经细胞内死亡基因表达，促进死亡蛋白合成，继之细胞死亡。Yamamofo[2]等报道给予NGF能抑制缺血后海马CA1区神经元的细胞凋亡过程。本实验以NGF作为凋亡抑制剂的NGF组与KA致痫组相比癫痫的发作形式及持续时间均无明显差异，提示NGF并无抗癫痫作用，但较KA致痫组在各相应时间点海马CA1凋亡细胞均显著性减少(P<0.01)，说明NGF对癫痫神经细胞凋亡也有抑制作用。
NGF的生物学作用是通过受体介导的。NGF有两种受体：高亲和力亲体(HNGFR-TrkA)和低亲和力受体(LNGFR-p75)。最近研究发现LNGFR-p75与细胞凋亡关系密切。LNGFR-p75的胞外部分与肿瘤坏死因子(TNF)受体、人细胞表面抗原(Fas)、B细胞抗原CD40等凋亡相关受体结构相似。LNGFR-p75表达能促进细胞凋亡，但能被NGF或其抗体结合所抑制。有人报道，神经损伤后LNGFR-p75表达增高[7]。推测癫痫发作后NGF相对或绝对不足的细胞如海马神经细胞，其LNGFR-p75未被完全结合从而产生凋亡；而得到NGF较多的细胞则保持完好。当补充外源性NGF，LNGFR-p75被结合，从而抑制了癫痫神经细胞凋亡。NGF抗凋亡的确切机制尚需深入细致的研究。
, 百拇医药
癫痫致脑损伤(细胞坏死)已被许多动物实验和临床观察所证实。癫痫脑损伤既是癫痫发作的结果，又是癫痫频发和难治的原因，更是癫痫致残(记忆力下降、智能和精神障碍以及痴呆等)的原因。由于抗癫痫药不能迅速充分抑制癫痫发作，或对有些癫痫疗效较差，甚至无效，许多学者主张脑保护剂与抗癫痫药联合应用治疗癫痫，但并未引起临床医师的足够重视。神经细胞凋亡是最近发现的癫痫脑损伤又一途径。癫痫脑神经细胞凋亡出现晚但持续存在，又为临床治疗癫痫提出新的课题。NGF作用于有其受体的神经细胞，具有定向性和专一性特点，因而它是非常有发展前途的癫痫脑损伤保护剂。它既能抑制神经细胞坏死，也能抑制神经细胞凋亡。但NGF具有抗原性，难以通过血脑屏障以及作为药物的安全性尚需评价等，对NGF进行积极而慎重的药理学研究是非常必要的。
作者简介：刘 冰(1969年生)，男，江苏徐州市人，硕士。
作者单位：刘 冰(中国医科大学第一临床学院神经内科，沈阳 110001)
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柳忠兰(中国医科大学第一临床学院神经内科，沈阳 110001)
何桂芹(营口中西医结合医院内科，营口 115001)
参考文献
[1]Pollard H,Charriaut-Marlangue C,Cantagrel S,et al.Kainate-induced apoptotic cell death in hippocampal neurons [J].Neuroscience,1994,63(1):7-18.
[2]Yamamoto S,Yoshimine T,Fujita T,et al.Protective effect of NGF atelocollagen mini-pellet on the hippocampal delayed neuronal death in gerbils [J].Neurosci Lett,1992,141(2):161-165.
, http://www.100md.com
[3]王群，阮旭中，李震中，等.雌、孕激素对马桑内脂致痫大鼠行为及皮层、海马脑电图的影响 [J].临床脑电学杂志，1997，6：28-31.
[4]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation [J].Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1972,32:281-294.
[5]Fischer W,Wictorin RK,Djörklund A,et al.Amelioration of cholinergic neuron atrophy and spatial memory impairment in aged rats by nerve growth factor [J].Nature,1987,329(6134):65-68.
[6]Raff MC.Social controls on cell survival and cell death [J].Nature,1992,356(6368):397-400.
[7]Funakoshi H,Frisen J,Barbany G,et al.Differential expression of mRNAs for neurotrophins and their receptors after axotomy of the sciatic nerve [J].J Cell Biol,1993,123(2):455-465., 百拇医药
摘要 目的：探讨外源性神经生长因子(NGF)对癫痫发作所致海马神经细胞凋亡有无抑制作用。方法：采用红藻氨酸(KA)诱导癫痫大鼠模型，以原位末端标记法(TUNEL)标记DNA片段，检测凋亡细胞在大鼠海马CA1区的动态变化及NGF对其的影响。结果：海马CA1区凋亡细胞在实验24 h出现，48 h明显增多，于72 h达高峰，7 d时最少。给予NGF脑室内注射后，在各相应时间点凋亡细胞数均明显减少(P<0.01)。结论：外源性NGF能抑制癫痫发作所致的海马神经细胞凋亡，NGF对癫痫脑损伤有保护作用。
关键词：神经生长因子 癫痫 鼠 细胞凋亡 红藻氨酸
癫痫是神经科常见的一种慢性疾病。癫痫发作可使脑细胞内外环境发生剧烈改变，从而导致脑损伤。这种脑损伤既有急性脑细胞坏死，也有一些神经细胞经过2～3天(d)后才出现死亡，称为迟发性神经元死亡(DND)。近年研究认为，DND其实是细胞凋亡而不是细胞坏死[1]。神经生长因子(NGF)是一种多肽因子，能营养神经细胞，促进神经细胞的存活和生长。外源性NGF具有抑制脑缺血后脑神经细胞凋亡的作用[2]。但外源性NGF对癫痫神经细胞凋亡是否有拮抗作用尚未见报道。本实验动态观察NGF对急性癫痫发作后大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的影响，旨在探明NGF对癫痫神经细胞凋亡有无抑制作用。
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1 材料和方法
1.1 动物分组 健康雄性Wistar大鼠(中国医科大学实验动物中心提供)78只，体重180～220 g，随机分成5组。A组：正常对照组；B组：安定组；C组：标准药物对照组[红藻氨酸(KA)+安定]；D组：KA致痫组；E组：NGF组(KA+NGF)。其中A组、B组各3只，其余每组24只。
1.2 癫痫动物模型及给药方法 KA(购于Sigma公司)用生理盐水配成2 mg/mL，C、D、E组予KA 10 mg/kg颈部皮下注射；C组在注射KA 15 min后腹腔注射安定5 mg/kg，每小时重复1次，共用8次；B组参照C组予以安定；E组大鼠经戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，固定在脑立体定位仪上，于注射KA 15 min后，向左侧脑室内注射5 μL NGF(人工脑脊液配制，为3.0 μg/μL，军事医学科学院提供)；相同时间点相同给药途径注射生理盐水，使各组大鼠用药次数相等。将针电极插入大鼠双侧大脑皮质和海马，记录脑电图[3]，同时观察动物行为改变。
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1.3 石腊切片制作 在实验24 h、48 h、72 h、7 d分别从C、D、E组随机取出6只，在实验72 h从A组、B组取出全部大鼠，在麻醉下经左心室-主动脉插管后，予以40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS 0.1 mol/L,pH7.4)250 mL灌注，断头取脑，按Paxinos立体定位图谱取右侧海马，后固定24 h，常规脱水、浸蜡、包埋，5 μm厚冠状切片(Bregma平面后3.8 mm)，载玻片涂多聚赖氨酸防脱片，裱片，置62℃温箱过夜。
1.4 原位末端标记检测细胞凋亡 标记凋亡细胞按原位检测凋亡细胞试剂盒(德国宝灵曼公司)设计程序进行：切片常规脱蜡逐级酒精至水化；蛋白酶K(15 μg/mL)消化37℃，30 min；PBS清洗后滴加原位末端标记法(TUNEL)反应液(TDT buffer 8 μL,2 mmol/L Bio-dUTP 3 μL,TDT酶0.4 μL，三蒸水28.6 μL)，37℃ 2 h；滴加SA复合液，37℃ 1 h；DAB显色5～20 min(镜下监测)，显色满意后终止反应；苏木素复染，常规脱水、透明，中性树脂封片，镜下观察。显微计微尺随机计数5个线性长度1 mm的阳性细胞数，取平均值。阳性对照：在标记反应前用200 ng/mL DNA酶Ⅰ(北京华美生物公司)处理30 min；阴性对照：标记反应液省去TDT酶。
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1.5 统计学处理 实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用组间t检验、方差分析、q检验。
2 结果
2.1 脑电图及行为改变 参考Racine[4]的标准，根据惊厥程度将行为表现分为5级。Ⅰ级：咀嚼运动；Ⅱ级：颈部肌肉抽搐；Ⅲ级：一侧前肢阵挛；Ⅳ级：站立并双前肢阵挛；Ⅴ级：四肢抽搐，失去平衡跌倒。
D组和E组大鼠注射KA约30 min后，反复出现Ⅰ～Ⅳ级发作，4 h后癫痫发作减轻且次数减少，8 h后基本无癫痫发作。Ⅰ～Ⅲ级均伴典型棘波，Ⅳ级、Ⅴ级均有高幅棘波。D组与E组大鼠癫痫发作形式、持续时间均无明显差异。A组大鼠无癫痫症状，脑电图未见病理波。B组和C组大鼠处于持续睡眠状态，脑电图呈睡眠脑电图。
2.2 各组大鼠海马CA1神经细胞凋亡 D组大鼠在海马CA1区可见凋亡细胞胞核呈棕褐色(图1)，对各时间点凋亡细胞数行方差分析和q检验，两两比较差异均有显著性(P<0.01)，以实验72 h最多。C组和E组(图2)亦可见少量凋亡细胞，在各相应时间点与D组相比差异均有显著性(P<0.01)。A组、B组均未见凋亡细胞(图3)(附表)。
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图 1 KA致痫组，凋亡神经细胞大量出现
Fig 1 Many apoptotic neurons were found in the KA group×400
图 2 NGF组，凋亡神经细胞明显减少
Fig 2 Apoptotic neurons decreased remarkably in the NGF group×400
附表 不同时间大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的变化
Table Changes of apoptotic neurons in the hippocampus CA1 of the rats at different time(x±s)
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Group
t/h
24
48
72
168
A
-
-
0
-
B
-
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0
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C
3.50±1.05
9.16±2.72
14.67±4.75
3.67±1.03
D
24.83±7.48*
39.50±8.39*
59.33+12.58*
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E
7.17±2.47△
13.45±4.03△
20.42±4.69△
4.67±2.37△
* P<0.01 compared with C group;△ P<0.01 compared with D group.Analysis of t test
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图 3 正常对照组，未见凋亡神经细胞
Fig 3 Apoptotic neurons were not found in the control group×400
3 讨论
细胞凋亡是医学生物学领域的研究热点之一。细胞凋亡是指由于细胞内外因素刺激，触发其本身死亡程序，一种主动的受许多凋亡相关基因严格调控的细胞自我消亡过程。既往认为神经细胞是不易发生凋亡的细胞，癫痫发作所致脑损伤也被认为只是细胞坏死。近年研究表明，细胞凋亡参与癫痫脑损伤过程。本实验发现：安定组与正常对照组均未发现凋亡细胞，提示安定(5 mg/kg ip,q1 h)并无致细胞凋亡作用；用此剂量安定充分抑制癫痫发作的标准药物对照组，可见少量凋亡细胞，证实KA本身能引起细胞凋亡；但在各相应时间点与KA致痫组相比较差异均有显著性(P<0.01)，说明癫痫发作确有致细胞凋亡作用，癫痫发作后神经细胞凋亡主要是由于痫性发作所致。神经细胞凋亡(KA致癫组)在实验24 h(约为癫痫发作后16 h)出现，48 h明显增多，72 h达高峰，7 d仍然可见。均与有关文献报道一致[1]。本实验中正常对照组海马CA1区线性1 mm平均神经细胞数为(212.67±16.53)个。在注射KA 24 h后，KA致痫组在相同区域即有(24.83±7.48)个凋亡神经细胞，72 h达(59.33±12.58)个，提示细胞凋亡在癫痫脑损伤中起着重要作用。加之其迟发且持续存在的特点，引起国内外学者广泛重视。
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NGF是中枢神经系统中最重要的生物活性物质之一。外源性NGF能促进中枢神经细胞再生，维持其存活，减少病理性坏死[5]。近年研究发现，外源性NGF具有抑制神经细胞凋亡作用。Raff[6]等发现，NGF缺乏可激活神经细胞内死亡基因表达，促进死亡蛋白合成，继之细胞死亡。Yamamofo[2]等报道给予NGF能抑制缺血后海马CA1区神经元的细胞凋亡过程。本实验以NGF作为凋亡抑制剂的NGF组与KA致痫组相比癫痫的发作形式及持续时间均无明显差异，提示NGF并无抗癫痫作用，但较KA致痫组在各相应时间点海马CA1凋亡细胞均显著性减少(P<0.01)，说明NGF对癫痫神经细胞凋亡也有抑制作用。
NGF的生物学作用是通过受体介导的。NGF有两种受体：高亲和力亲体(HNGFR-TrkA)和低亲和力受体(LNGFR-p75)。最近研究发现LNGFR-p75与细胞凋亡关系密切。LNGFR-p75的胞外部分与肿瘤坏死因子(TNF)受体、人细胞表面抗原(Fas)、B细胞抗原CD40等凋亡相关受体结构相似。LNGFR-p75表达能促进细胞凋亡，但能被NGF或其抗体结合所抑制。有人报道，神经损伤后LNGFR-p75表达增高[7]。推测癫痫发作后NGF相对或绝对不足的细胞如海马神经细胞，其LNGFR-p75未被完全结合从而产生凋亡；而得到NGF较多的细胞则保持完好。当补充外源性NGF，LNGFR-p75被结合，从而抑制了癫痫神经细胞凋亡。NGF抗凋亡的确切机制尚需深入细致的研究。
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癫痫致脑损伤(细胞坏死)已被许多动物实验和临床观察所证实。癫痫脑损伤既是癫痫发作的结果，又是癫痫频发和难治的原因，更是癫痫致残(记忆力下降、智能和精神障碍以及痴呆等)的原因。由于抗癫痫药不能迅速充分抑制癫痫发作，或对有些癫痫疗效较差，甚至无效，许多学者主张脑保护剂与抗癫痫药联合应用治疗癫痫，但并未引起临床医师的足够重视。神经细胞凋亡是最近发现的癫痫脑损伤又一途径。癫痫脑神经细胞凋亡出现晚但持续存在，又为临床治疗癫痫提出新的课题。NGF作用于有其受体的神经细胞，具有定向性和专一性特点，因而它是非常有发展前途的癫痫脑损伤保护剂。它既能抑制神经细胞坏死，也能抑制神经细胞凋亡。但NGF具有抗原性，难以通过血脑屏障以及作为药物的安全性尚需评价等，对NGF进行积极而慎重的药理学研究是非常必要的。
作者简介：刘 冰(1969年生)，男，江苏徐州市人，硕士。
作者单位：刘 冰(中国医科大学第一临床学院神经内科，沈阳 110001)
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柳忠兰(中国医科大学第一临床学院神经内科，沈阳 110001)
何桂芹(营口中西医结合医院内科，营口 115001)
参考文献
[1]Pollard H,Charriaut-Marlangue C,Cantagrel S,et al.Kainate-induced apoptotic cell death in hippocampal neurons [J].Neuroscience,1994,63(1):7-18.
[2]Yamamoto S,Yoshimine T,Fujita T,et al.Protective effect of NGF atelocollagen mini-pellet on the hippocampal delayed neuronal death in gerbils [J].Neurosci Lett,1992,141(2):161-165.
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[3]王群，阮旭中，李震中，等.雌、孕激素对马桑内脂致痫大鼠行为及皮层、海马脑电图的影响 [J].临床脑电学杂志，1997，6：28-31.
[4]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation [J].Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1972,32:281-294.
[5]Fischer W,Wictorin RK,Djörklund A,et al.Amelioration of cholinergic neuron atrophy and spatial memory impairment in aged rats by nerve growth factor [J].Nature,1987,329(6134):65-68.
[6]Raff MC.Social controls on cell survival and cell death [J].Nature,1992,356(6368):397-400.
[7]Funakoshi H,Frisen J,Barbany G,et al.Differential expression of mRNAs for neurotrophins and their receptors after axotomy of the sciatic nerve [J].J Cell Biol,1993,123(2):455-465., 百拇医药