膀胱癌组织中血管内皮生长因子的表达及与血管生成的关系
膀胱癌组织中血管内皮生长因子的表达及与血管生成的关系
王嵩 夏同礼 张智清 孔祥田 曾荔 宓培 薛兆英
摘 要：目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)在原发性膀胱移行细胞癌中的表达及其与膀胱癌血管生成之间的关系。方法 应用免疫组织化学技术检测68例原发性膀胱移行细胞癌和7例正常膀胱组织中血管内皮生长因子的表达，测定40例浸润性膀胱癌的微血管密度(microvessel density, MVD)，并分析VEGF和MVD间以及它们与膀胱癌病理分级和临床分期间的关系。结果 VEGF在正常膀胱组织中不表达或低表达，而在膀胱癌组织表达较强(中度以上表达占64.7%)；VEGF表达及MVD值均与肿瘤的病理分级和临床分期密切相关，并且VEGF高表达者的MVD均值显著高于VEGF低表达者(P<0.05)。结论 VEGF与膀胱癌的生长、浸润密切相关，是膀胱癌主要的血管新生诱导因子之一，可促进膀胱癌的血管生成。对膀胱癌组织中VEGF的测定将可能成为膀胱癌预后的一个有用指标，以用于识别高危转移和预后不佳者。
, 百拇医药
关键词：膀胱肿瘤 癌 血管生成因子
肿瘤相关的血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件。与大多数实体的恶性肿瘤一样，膀胱癌的发生发展依赖于血管生成[1]。目前已知有多种细胞因子可以诱导血管形成，血管内皮生长因子(VEGF)是其中作用较强而特异性又很高的一种血管生长因子[2]。我们采用免疫组织化学技术检测VEGF在膀胱移行细胞癌中的表达，并通过血管内皮细胞特异性抗原第Ⅷ因子免疫染色来对膀胱癌血管形成进行研究，以探讨VEGF在膀胱癌发生发展及其血管生成中的意义。
资料与方法
1.组织标本：68例原发性膀胱移行细胞癌标本取自北京医科大学泌尿外科研究所1987～1998年间行手术切除的肿瘤标本。标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，石蜡标本连续切片，厚5 μm备染。全部标本中，男性60例，女性8例。年龄35～82岁，平均61.7岁。按WHO分级标准：G1级17例，G2级26例，G3级25例。临床分期按UICC标准：Tis～T1为28例，T2～T4为40例。另取7例正常膀胱组织作对照，亦作5 μm切片备染。
, 百拇医药
2.主要试剂：鼠抗人VEGF单抗由中国预防医学科学院病毒研究所基因实验室提供，兔抗人第Ⅷ因子多克隆抗体为Zymed公司产品，生物素标记羊抗鼠IgG及生物素标记羊抗兔IgG均购自中山生物公司，SP试剂盒为中山生物公司产品。
3.免疫组化染色(SP法)：所有标本均在同一条件下用SP法进行免疫组化染色。一抗稀释度为1∶100，各步间均以PBS替代一抗作为染色阴性对照。VEGF染色结果判定：以肿瘤细胞胞浆内含有棕黄颗粒者计为染色阳性细胞，依据切片内阳性细胞数比值将其分为3个程度：低度表达(阳性细胞数<50%)，中度表达(阳性细胞数50%～80%)，高度表达(阳性细胞数>80%)。血管形成定量以微血管密度(MVD)表示：在低倍镜(100×)下确定肿瘤内5个新生血管密集区，再在高倍镜(200×)下计数每个密集区中一个视野内的微血管数，以5个区域微血管数的均值表示肿瘤的微血管密度。
4.统计学处理：对取得的数据进行χ2检验、t检验和方差分析。
, http://www.100md.com
结 果
1.VEGF在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达：68例膀胱癌中VEGF低表达24例(35.3%)，中度表达12例(17.6%)，高表达32例(47.1%)。在癌组织中，VEGF主要表达于肿瘤细胞浆，尤以位于浸润前缘的肿瘤细胞染色较强。癌旁组织周围的微血管内皮细胞亦有轻度着色。正常膀胱组织移行上皮细胞VEGF表达极弱或不表达。
2.膀胱癌组织中MVD的测定：膀胱癌组织中毛细血管、小静脉、小动脉内皮细胞均为第Ⅷ因子染色阳性，而阳性血管分布呈现异质性，在癌组织浸润周围的微血管较癌内部密集。40例侵润性膀胱癌组织的MVD为(78.6±14.8)个。
3.VEGF表达及MVD与病理分级和临床分期的关系：VEGF表达与病理分级和临床分期的关系见表1。G3级的VEGF表达程度较G1级明显增高(P<0.05)，G1级与G2级之间及G2级与G3级之间VEGF表达程度无显著性差异(P>0.05)；T2～T4期的VEGF表达程度较Tis～T1期明显增高(P<0.05)。
, http://www.100md.com
40例侵润性膀胱癌的MVD与病理分级和临床分期的关系见表2。G2级的MVD值明显低于G3级(P<0.05);T2期的MVD值明显低于T3～T4期(P<0.05)。可见随着膀胱癌病理分级和临床分期的提高，其相应的MVD值也明显增高。
4.VEGF表达与MVD间的关系：VEGF表达与MVD间关系见表3。40例浸润性膀胱癌中，VEGF低度表达者和中度表达者的MVD均值明显低于VEGF高度表达者(P<0.05)，虽然VEGF中度表达者的MVD均值与低度表达者相比无显著性差异(P>0.05)，但是随着VEGF表达程度增加，MVD呈增加趋势。
表1 VEGF表达与膀胱癌病理分级和临床分期的关系(例)
项目
例数
, 百拇医药
VEGF表达
低度
中度
高度
病理分级
G1*△
17
11
2
4
G2△
26
, http://www.100md.com
8
7
11
G3
25
5
3
17
临床分期
Tis～T1**
28
15
8
, http://www.100md.com
5
T2～T4
40
9
4
27
注：*病理分级G1组与G3组之间的VEGF表达程度比较P<0.05;△G1组与G2组、G2组与G3组之间的VEGF表达程度比较P>0.05;**临床分期Tis～T1组与T2～T4组间的VEGF表达程度比较P<0.05表2 MVD值与膀胱癌分级分期的关系
, http://www.100md.com
项 目
例数
MVD值(x±s，个)
病理分级
G2
15
72.5±12.3*
G3
25
82.4±15.2
临床分期
T2
, 百拇医药
21
73.2±16.4**
T3～T4
19
84.6±10.1
注：*病理分级G1组与G2组比较，P<0.05；**临床分期T2组与T3～T4组比较，P<0.05表3 膀胱癌VEGF表达与MVD值间关系
VEGF表达
例数
, http://www.100md.com MVD值(x±s，个)
低度
9
61.6±12.9*△
中度
4
71.3±10.6*
高度
27
85.5±10.3
注：*sVEGF低度表达组的MVD值与高度表达组比较P<0.05；中度表达组的MVD值与高度表达组比较P<0.05；△低度表达组的MVD值与中度表达组比较P>0.05讨 论
, 百拇医药
VEGF又称血管通透因子(VPF)，是同源二聚体糖蛋白。它可以特异性地作用于血管内皮细胞，促使其分裂和产生趋化作用，并增加微血管的通透性，从而促进内皮细胞的增殖和迁移，而这又有利于肿瘤的血管新生。血管新生是指从业已存在的血管网上生长出新的血管的过程，它包括以下一系列过程：内皮细胞的增殖和迁移，血管基底膜的降解，新生内皮细胞的重排及吻合[3]。研究表明血管新生是肿瘤生长和转移的先决条件，因此，对血管新生的研究将有助于阐明肿瘤的生物学行为。
迄今为止，VEGF被认为是肿瘤组织中促血管生长的最主要的血管生长因子之一。它高表达于多种恶性肿瘤，如胶质瘤、肺癌、乳腺癌和肾癌等[4]。有报道VEGF高表达于膀胱癌组织。膀胱癌患者尿液中VEGF含量明显增高，且尿液中VEGF的定量测定有助于预测膀胱癌的复发[5]。本研究结果显示：VEGF蛋白在膀胱癌组织中呈高表达，而在正常尿路上皮中低表达或不表达。膀胱癌是富血管性恶性肿瘤，VEGF高表达将有助于膀胱肿瘤的血管新生。随着膀胱癌分期分级的提高，VEGF蛋白免疫染色明显增强，这表明VEGF可能与膀胱肿瘤的生长和侵润密切相关，其表达愈强，膀胱癌的恶性度愈高，提示VEGF可作为反应膀胱癌生物学行为的一个重要指标。另外，本研究免疫组化结果显示：浸润性膀胱癌组织附近的血管内皮呈VEGF阳性，正常组织切片中则很少见到。血管内皮着色阳性是由于VEGF与血管内皮细胞上的VEGF受体结合后而呈阳性，血管内皮细胞并不表达VEGF[6]。
, 百拇医药
自本世纪七十年代初Folkman提出可以通过抑制肿瘤的营养血管而减缓肿瘤的生长这一假说以来，大量的研究表明血管新生是肿瘤生长和转移的先决条件。肿瘤微血管密度(MVD)是对肿瘤血管最密集部位所进行的微小血管计数。前列腺癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌等的MVD与肿瘤的浸润生长、转移及预后密切相关[7]。本研究显示，MVD在浸润性膀胱癌中随着病理分级和临床分期的提高亦显著增加。这提示膀胱肿瘤的生长和发展依赖于血管形成，而血管生成亦是膀胱癌的恶性表型之一。测定膀胱肿瘤的MVD值可能会成为判断膀胱癌患者预后的一项有用的指标。
肿瘤从静止状态发展到伴随肿瘤血管新生的浸润状态，其关键环节在于血管形成诱导因子与抑制因子间的平衡状态的改变[8]。在健康成人组织中，高水平的血管形成抑制因子使血管内皮保持在静息状态，而在肿瘤组织中这种状态受到破坏，诱发了血管新生，新生血管的形成便构成肿瘤发生、发展的病理基础。VEGF为目前已知的敏感性强、特异性又高的血管形成诱导因子之一。本研究证实：在浸润性膀胱癌组织中，随着VEGF蛋白染色增强其MVD值呈上升趋势，进一步提示膀胱癌中VEGF表达与血管形成有密切关系，VEGF可能是膀胱癌发生发展过程中最重要的血管形成诱导因子之一。
, http://www.100md.com
作者单位：王 嵩 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
夏同礼 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
张智清 中国预防医学科学院病毒研究所
孔祥田 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
曾 荔 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
宓 培 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
薛兆英 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
参考文献
[1]Campbell SC, Volpert OV, Ivanovich M, et al. Molecular mediators of angiogenesis in bladder cancer. Cancer Res，1998,58:1298-1304.
, 百拇医药
[2]Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. Eur J Cancer， 1996, 32A: 2413-2422.
[3]Liotta LA, Stetler-Stevenson WG. Tumor invasion and metastasis: an imbalance of positive and negative regulation. Cancer Res， 1991,51:5054-5059.
[4]Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability and angiogenesis. Am J Pathol，1995, 146:1029-1039.
, 百拇医药
[5]Crew JP, Obrien T, Bicknell R, et al. Urinary vascular endothelial growth factor and its correlation with bladder cancer recurrence rate. J Urol， 1999, 161: 799-804.
[6]Dvorak HF, Sioussat TM, Brown LF, et al. Distribution of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) in tumors: concentration in tumor blood vessels. J Exp Med, 1991, 174: 1275-1278.
[7]Fidler IJ, Ellis LM. The implication of angiogenesis to the biology and therapy of cancer metastasis. Cell, 1994, 79:185-188.
[8]Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenesis switch during tumorigenesis. Cell, 1996, 86:353-364., 百拇医药
王嵩 夏同礼 张智清 孔祥田 曾荔 宓培 薛兆英
摘 要：目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)在原发性膀胱移行细胞癌中的表达及其与膀胱癌血管生成之间的关系。方法 应用免疫组织化学技术检测68例原发性膀胱移行细胞癌和7例正常膀胱组织中血管内皮生长因子的表达，测定40例浸润性膀胱癌的微血管密度(microvessel density, MVD)，并分析VEGF和MVD间以及它们与膀胱癌病理分级和临床分期间的关系。结果 VEGF在正常膀胱组织中不表达或低表达，而在膀胱癌组织表达较强(中度以上表达占64.7%)；VEGF表达及MVD值均与肿瘤的病理分级和临床分期密切相关，并且VEGF高表达者的MVD均值显著高于VEGF低表达者(P<0.05)。结论 VEGF与膀胱癌的生长、浸润密切相关，是膀胱癌主要的血管新生诱导因子之一，可促进膀胱癌的血管生成。对膀胱癌组织中VEGF的测定将可能成为膀胱癌预后的一个有用指标，以用于识别高危转移和预后不佳者。
, 百拇医药
关键词：膀胱肿瘤 癌 血管生成因子
肿瘤相关的血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件。与大多数实体的恶性肿瘤一样，膀胱癌的发生发展依赖于血管生成[1]。目前已知有多种细胞因子可以诱导血管形成，血管内皮生长因子(VEGF)是其中作用较强而特异性又很高的一种血管生长因子[2]。我们采用免疫组织化学技术检测VEGF在膀胱移行细胞癌中的表达，并通过血管内皮细胞特异性抗原第Ⅷ因子免疫染色来对膀胱癌血管形成进行研究，以探讨VEGF在膀胱癌发生发展及其血管生成中的意义。
资料与方法
1.组织标本：68例原发性膀胱移行细胞癌标本取自北京医科大学泌尿外科研究所1987～1998年间行手术切除的肿瘤标本。标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，石蜡标本连续切片，厚5 μm备染。全部标本中，男性60例，女性8例。年龄35～82岁，平均61.7岁。按WHO分级标准：G1级17例，G2级26例，G3级25例。临床分期按UICC标准：Tis～T1为28例，T2～T4为40例。另取7例正常膀胱组织作对照，亦作5 μm切片备染。
, 百拇医药
2.主要试剂：鼠抗人VEGF单抗由中国预防医学科学院病毒研究所基因实验室提供，兔抗人第Ⅷ因子多克隆抗体为Zymed公司产品，生物素标记羊抗鼠IgG及生物素标记羊抗兔IgG均购自中山生物公司，SP试剂盒为中山生物公司产品。
3.免疫组化染色(SP法)：所有标本均在同一条件下用SP法进行免疫组化染色。一抗稀释度为1∶100，各步间均以PBS替代一抗作为染色阴性对照。VEGF染色结果判定：以肿瘤细胞胞浆内含有棕黄颗粒者计为染色阳性细胞，依据切片内阳性细胞数比值将其分为3个程度：低度表达(阳性细胞数<50%)，中度表达(阳性细胞数50%～80%)，高度表达(阳性细胞数>80%)。血管形成定量以微血管密度(MVD)表示：在低倍镜(100×)下确定肿瘤内5个新生血管密集区，再在高倍镜(200×)下计数每个密集区中一个视野内的微血管数，以5个区域微血管数的均值表示肿瘤的微血管密度。
4.统计学处理：对取得的数据进行χ2检验、t检验和方差分析。
, http://www.100md.com
结 果
1.VEGF在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达：68例膀胱癌中VEGF低表达24例(35.3%)，中度表达12例(17.6%)，高表达32例(47.1%)。在癌组织中，VEGF主要表达于肿瘤细胞浆，尤以位于浸润前缘的肿瘤细胞染色较强。癌旁组织周围的微血管内皮细胞亦有轻度着色。正常膀胱组织移行上皮细胞VEGF表达极弱或不表达。
2.膀胱癌组织中MVD的测定：膀胱癌组织中毛细血管、小静脉、小动脉内皮细胞均为第Ⅷ因子染色阳性，而阳性血管分布呈现异质性，在癌组织浸润周围的微血管较癌内部密集。40例侵润性膀胱癌组织的MVD为(78.6±14.8)个。
3.VEGF表达及MVD与病理分级和临床分期的关系：VEGF表达与病理分级和临床分期的关系见表1。G3级的VEGF表达程度较G1级明显增高(P<0.05)，G1级与G2级之间及G2级与G3级之间VEGF表达程度无显著性差异(P>0.05)；T2～T4期的VEGF表达程度较Tis～T1期明显增高(P<0.05)。
, http://www.100md.com
40例侵润性膀胱癌的MVD与病理分级和临床分期的关系见表2。G2级的MVD值明显低于G3级(P<0.05);T2期的MVD值明显低于T3～T4期(P<0.05)。可见随着膀胱癌病理分级和临床分期的提高，其相应的MVD值也明显增高。
4.VEGF表达与MVD间的关系：VEGF表达与MVD间关系见表3。40例浸润性膀胱癌中，VEGF低度表达者和中度表达者的MVD均值明显低于VEGF高度表达者(P<0.05)，虽然VEGF中度表达者的MVD均值与低度表达者相比无显著性差异(P>0.05)，但是随着VEGF表达程度增加，MVD呈增加趋势。
表1 VEGF表达与膀胱癌病理分级和临床分期的关系(例)
项目
例数
, 百拇医药
VEGF表达
低度
中度
高度
病理分级
G1*△
17
11
2
4
G2△
26
, http://www.100md.com
8
7
11
G3
25
5
3
17
临床分期
Tis～T1**
28
15
8
, http://www.100md.com
5
T2～T4
40
9
4
27
注：*病理分级G1组与G3组之间的VEGF表达程度比较P<0.05;△G1组与G2组、G2组与G3组之间的VEGF表达程度比较P>0.05;**临床分期Tis～T1组与T2～T4组间的VEGF表达程度比较P<0.05表2 MVD值与膀胱癌分级分期的关系
, http://www.100md.com
项 目
例数
MVD值(x±s，个)
病理分级
G2
15
72.5±12.3*
G3
25
82.4±15.2
临床分期
T2
, 百拇医药
21
73.2±16.4**
T3～T4
19
84.6±10.1
注：*病理分级G1组与G2组比较，P<0.05；**临床分期T2组与T3～T4组比较，P<0.05表3 膀胱癌VEGF表达与MVD值间关系
VEGF表达
例数
, http://www.100md.com MVD值(x±s，个)
低度
9
61.6±12.9*△
中度
4
71.3±10.6*
高度
27
85.5±10.3
注：*sVEGF低度表达组的MVD值与高度表达组比较P<0.05；中度表达组的MVD值与高度表达组比较P<0.05；△低度表达组的MVD值与中度表达组比较P>0.05讨 论
, 百拇医药
VEGF又称血管通透因子(VPF)，是同源二聚体糖蛋白。它可以特异性地作用于血管内皮细胞，促使其分裂和产生趋化作用，并增加微血管的通透性，从而促进内皮细胞的增殖和迁移，而这又有利于肿瘤的血管新生。血管新生是指从业已存在的血管网上生长出新的血管的过程，它包括以下一系列过程：内皮细胞的增殖和迁移，血管基底膜的降解，新生内皮细胞的重排及吻合[3]。研究表明血管新生是肿瘤生长和转移的先决条件，因此，对血管新生的研究将有助于阐明肿瘤的生物学行为。
迄今为止，VEGF被认为是肿瘤组织中促血管生长的最主要的血管生长因子之一。它高表达于多种恶性肿瘤，如胶质瘤、肺癌、乳腺癌和肾癌等[4]。有报道VEGF高表达于膀胱癌组织。膀胱癌患者尿液中VEGF含量明显增高，且尿液中VEGF的定量测定有助于预测膀胱癌的复发[5]。本研究结果显示：VEGF蛋白在膀胱癌组织中呈高表达，而在正常尿路上皮中低表达或不表达。膀胱癌是富血管性恶性肿瘤，VEGF高表达将有助于膀胱肿瘤的血管新生。随着膀胱癌分期分级的提高，VEGF蛋白免疫染色明显增强，这表明VEGF可能与膀胱肿瘤的生长和侵润密切相关，其表达愈强，膀胱癌的恶性度愈高，提示VEGF可作为反应膀胱癌生物学行为的一个重要指标。另外，本研究免疫组化结果显示：浸润性膀胱癌组织附近的血管内皮呈VEGF阳性，正常组织切片中则很少见到。血管内皮着色阳性是由于VEGF与血管内皮细胞上的VEGF受体结合后而呈阳性，血管内皮细胞并不表达VEGF[6]。
, 百拇医药
自本世纪七十年代初Folkman提出可以通过抑制肿瘤的营养血管而减缓肿瘤的生长这一假说以来，大量的研究表明血管新生是肿瘤生长和转移的先决条件。肿瘤微血管密度(MVD)是对肿瘤血管最密集部位所进行的微小血管计数。前列腺癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌等的MVD与肿瘤的浸润生长、转移及预后密切相关[7]。本研究显示，MVD在浸润性膀胱癌中随着病理分级和临床分期的提高亦显著增加。这提示膀胱肿瘤的生长和发展依赖于血管形成，而血管生成亦是膀胱癌的恶性表型之一。测定膀胱肿瘤的MVD值可能会成为判断膀胱癌患者预后的一项有用的指标。
肿瘤从静止状态发展到伴随肿瘤血管新生的浸润状态，其关键环节在于血管形成诱导因子与抑制因子间的平衡状态的改变[8]。在健康成人组织中，高水平的血管形成抑制因子使血管内皮保持在静息状态，而在肿瘤组织中这种状态受到破坏，诱发了血管新生，新生血管的形成便构成肿瘤发生、发展的病理基础。VEGF为目前已知的敏感性强、特异性又高的血管形成诱导因子之一。本研究证实：在浸润性膀胱癌组织中，随着VEGF蛋白染色增强其MVD值呈上升趋势，进一步提示膀胱癌中VEGF表达与血管形成有密切关系，VEGF可能是膀胱癌发生发展过程中最重要的血管形成诱导因子之一。
, http://www.100md.com
作者单位：王 嵩 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
夏同礼 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
张智清 中国预防医学科学院病毒研究所
孔祥田 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
曾 荔 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
宓 培 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
薛兆英 100034 北京医科大学泌尿外科研究所
参考文献
[1]Campbell SC, Volpert OV, Ivanovich M, et al. Molecular mediators of angiogenesis in bladder cancer. Cancer Res，1998,58:1298-1304.
, 百拇医药
[2]Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. Eur J Cancer， 1996, 32A: 2413-2422.
[3]Liotta LA, Stetler-Stevenson WG. Tumor invasion and metastasis: an imbalance of positive and negative regulation. Cancer Res， 1991,51:5054-5059.
[4]Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability and angiogenesis. Am J Pathol，1995, 146:1029-1039.
, 百拇医药
[5]Crew JP, Obrien T, Bicknell R, et al. Urinary vascular endothelial growth factor and its correlation with bladder cancer recurrence rate. J Urol， 1999, 161: 799-804.
[6]Dvorak HF, Sioussat TM, Brown LF, et al. Distribution of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) in tumors: concentration in tumor blood vessels. J Exp Med, 1991, 174: 1275-1278.
[7]Fidler IJ, Ellis LM. The implication of angiogenesis to the biology and therapy of cancer metastasis. Cell, 1994, 79:185-188.
[8]Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenesis switch during tumorigenesis. Cell, 1996, 86:353-364., 百拇医药