Ⅱ型糖尿病患者血小板膜糖蛋白及纤维蛋白原的改变
韩悦 王兆钺 耿美菊 陈黎 蔡鑫元 阮长耿
摘要 目的：观察Ⅱ型糖尿病患者血小板膜糖蛋白及纤维蛋白原结合的变化，确定其对判断血小板活化及血管并发症的价值。方法：用流式细胞术观察85例Ⅱ型糖尿病患者(有血管病变者47例，无血管病变者38例)及30例健康人血小板膜上P-选择素、糖蛋白(GP)Ⅱb-Ⅲa复合物、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa表达及纤维蛋白原结合的改变。结果：血小板膜P-选择素、纤维蛋白原结合及GPⅡb-Ⅲa的表达在糖尿病患者伴血管病变者明显高于无血管病变者及正常对照；GPⅠb在血管病变组低于无血管病变组与对照组；GPⅡb、GPⅢa在3组间比较差异均无显著性；所有指标在无血管病变组与正常组无明显差别。结论：血小板膜GPⅠb、GPⅡb-Ⅲa复合物、纤维蛋白原结合及P-选择素对判断糖尿病病人的血小板活化以及血管病变有重要价值。
, 百拇医药
关键词：糖尿病,非胰岛素依赖型 血小板膜糖蛋白类
糖尿病(DM)易并发慢性特异性微血管病变和大血管病变是影响预后的主要原因。糖尿病血管病变的发病机制甚为复杂，血小板活化与内皮细胞损伤起着重要作用[1]。当血小板活化时，α颗粒膜与血小板质膜融合，使P-选择素暴露于质膜表面成为血小板活化的分子标志，同时血小板构型发生改变，糖蛋白(GP)Ⅱb -Ⅲa的纤维蛋白原受体暴露，引起纤维蛋白原与血小板的结合[2]。而GPⅠb及GPⅡb -Ⅲa则通过开放管道系统(OCS)发生膜内外的转位，使血小板膜糖蛋白出现一系列改变[3]。近年来，流式细胞仪(FCM)在临床上已得到广泛的应用，并已成为研究血小板结构与功能的一个新的手段。我们利用FCM分析Ⅱ型糖尿病患者血小板膜糖蛋白的表达及纤维蛋白原的结合，探讨其在糖尿病病人的血小板活化以及血管病变诊断中的价值。
病例和方法
, 百拇医药
一、研究对象
85例Ⅱ型糖尿病患者均为内分泌科住院病人，符合WHO在1985年制定的糖尿病诊断标准。伴血管病变者47例，无血管病变者38例。糖尿病伴血管病变包括肾脏病变、视网膜病变、心脏病变及脑血管病变，符合下列条件之一者即可诊断：(1)24 h尿放射免疫法测定α2-微球蛋白、白蛋白、IgA、IgG和尿糖蛋白5项中有3项异常,且排除泌尿系统自身病变者[4]；(2)按1985年国内第三届眼科学术会议规定标准，确诊有糖尿病视网膜病和眼底检查在Ⅱ级或Ⅱ级以上者；(3)按Minnesota标准，以往有过肯定的心肌梗死或有典型的心绞痛伴心电图缺血表现；(4)经CT证实的缺血性或出血性脑血管病。其中男20例，女27例，年龄44～77岁，平均63岁，血清总胆固醇(TCh)为(5.93±2.01) mmol/L。无血管病变组38例，男17例，女21例，年龄41～72岁，平均58岁，血TCh为(4.62±1.43) mmol/L。正常对照组为30例健康自愿者，年龄、性别与病例组匹配，血TCh为(4.56±1.39) mmol/L。所有受检者外周血血小板数均大于50×109/L，检查前10 d内未服用阿司匹林、潘生丁、肝素等影响血小板功能的药物。
, 百拇医药
二、测定方法
1.标本采集: 空腹采血2 ml，以3.8%枸橼酸三钠(内置适量阿司匹林，前列腺素E1)抗凝。抗凝全血即以10倍PBS(含阿司匹林及前列腺素E1)稀释。
2.血小板膜糖蛋白测定[5]: 将50 μl稀释全血分别加入事先置有单抗SZ2(抗GPⅠb)、SZ21(抗GPⅢa)、SZ22(抗GPⅡb )、SZ51(抗P-选择素)及C7E3(抗GPⅡb -Ⅲa复合物)的塑料管内(其中SZ2、SZ21、SZ22与SZ51为苏州医学院血栓研究室研制，C7E3为比利时Coller博士馈赠)，对照管为等量PBS。室温反应30 min，再加入FITC-羊抗鼠IgG(武汉生物公司产品)避光温育，固定，洗涤两遍后PBS悬浮，待测。
3.血小板膜纤维蛋白原结合反应[6]: 50 μl稀释全血加入含抗纤维蛋白原单抗SZ65(苏州医学院血栓研究室产品)的塑料管中，对照管为等量PBS，反应后加二抗温育，具体步骤同上。
, 百拇医药
4.血小板的FCM检测: 用Coulter公司的Epics-XL型流式细胞仪检测，选择488 nm的氩离子激发波长，测定5 000～10 000个血小板的荧光阳性百分率及平均荧光强度(MFI)。
三、统计学处理
采用SPSS统计软件包，结果以均数±标准差表示，样品均数间行t检验。
结果
Ⅱ型糖尿病伴血管病变者血小板膜P-选择素、GPⅡb -Ⅲa复合物的表达及纤维蛋白原结合的荧光阳性血小板百分率与MFI都明显高于正常者及无血管病变组，无血管病变者较正常组有增高趋势，但差异无显著性。相反，GPⅠb在血管病变组低于无血管病变组与对照组，后两组间无明显差异。而GPⅡb 及GPⅢa在3组间差别均无显著性 (表1)。
讨论
, 百拇医药
血小板膜糖蛋白在血小板黏附、聚集和释放反应中起着重要作用。正常血液中，血小板处于“静息”状态。当血小板受到一定的刺激时被活化、伸出伪足，细胞骨架发生重组，产生血小板膜糖蛋白的改变。其中α颗粒膜与质膜融合，P-选择素暴露于血小板质膜表面，成为血小板活化的重要标志[2]。而在粘附聚集过程中同样起重要作用的GPⅠb与GPⅡb -Ⅲa则在血小板活化过程中由开放管道系统(OCS)实现膜内外的相互转位，GPⅠb从膜外移向膜内，另一部分GPⅡb -Ⅲa复合物则由OCS及α颗粒膜释放转向膜外[3]。同时血小板空间构型发生改变，GPⅡb -Ⅲa复合物上纤维蛋白原受体暴露，促进纤维蛋白原与GPⅡb -Ⅲa的相互识别、结合，血小板聚集[2，6]。这些变化均可成为血小板活化的指标。
表1 Ⅱ型糖尿病患者血小板膜糖蛋白及纤维蛋白原结合的改变(%,x±s)
组别
, 百拇医药
例数
P-选择素
GPⅡb -Ⅲa
GPⅠb
GPⅡb
GPⅢa
纤维蛋白原结合
对照组
30
4.23±1.73
87.98±6.80
95.77±4.19
, 百拇医药 91.71±7.24
96.13±3.73
5.12±5.44
(0.36±0.10)
(1.83±0.23)
(2.88±0.56)
(2.45±0.68)
(2.95±0.47)
(0.47±0.13)
Ⅱ型糖尿病组
无血管病变
38
, 百拇医药
4.79±2.38
89.14±5.16
94.22±4.59
91.51±9.89
94.53±4.94
17.88±4.28
(0.38±0.10)
(1.86±0.26)
(2.57±0.48)
(2.30±0.57)
(2.99±0.65)
, 百拇医药
(0.49±0.13)
有血管病变
47
13.23±5.11△
94.31±2.75▲
89.78±6.96*
94.19±8.23
96.45±2.87
32.68±9.41△
(0.61±0.16)△
, http://www.100md.com
(2.14±0.37)*
(2.27±0.62)*
(2.48±0.60)
(3.26±0.61)
(1.0±0.28)△
注:括号内为平均荧光强度 与对照组比较，△P<0.001；▲P<0.01；*P<0.05 糖尿病患者糖与脂质代谢的异常使血小板活化，动脉粥样硬化发生率增高，血管病变易于发生。我们在实验中发现糖尿病有血管病变者血小板膜表面P-选择素、纤维蛋白原的结合及GPⅡb -Ⅲa的表达均明显高于正常人，GPⅠb则在血管病变组低于正常人，证实在糖尿病血管病变的发生过程中血小板活化 起着重要作用，这对判断糖尿病的病情有一定的临床意义。其中P-选择素与纤维蛋白原结合的改变最为明显，可能成为评估血小板活化程度的灵敏指标。GPⅡb 与GPⅢa改变不明显，这可能是由于血小板表面在静息状态时已存在大量的GPⅡb -Ⅲa(GPⅡb -Ⅲa分子数50 000)，膜内外转位的糖蛋白对GPⅡb 与Ⅲa在膜表面表达的总的影响不大。但GPⅡb -Ⅲa复合物的构型已有改变，这种改变可被特异性识别GPⅡb -Ⅲa复合物的单抗C7 E3检测。另一方面，无血管性疾病合并症的糖尿病病人的血小板膜糖蛋白均无明显改变，这也说明血小板活化在血管病变形成中的作用和血管病变促进了血小板活化。同时，从标本来源可以发现糖尿病有血管病变患者血胆固醇明显高于正常人，无血管病变者改变不明显，表明糖尿病血管病变过程中脂质代谢的异常与血糖的异常对血小板活化有协同作用。
, 百拇医药
FCM作为新型的血小板检测技术，可灵敏而特异地对各种血小板膜成分进行分析，方法简便、快速并避免了核素的接触。这可能为临床上糖尿病血管病变患者及其他血栓病疾病的诊断与预后判断提供新的依据。
作者单位：韩 悦(江苏省苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 215006)
王兆钺(江苏省苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 215006)
阮长耿(江苏省苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 215006)
蔡鑫元(内分泌科)
耿美菊(苏州医学院重点实验室)
陈 黎(苏州医学院重点实验室)
参考文献
, 百拇医药
1 Tschoepe D. The activated megakaryocyte-platelet-system in vascular disease: focus on diabetes. Semin Thromb Hemost, 1995, 21: 152-160.
2 阮长耿，主编. 血栓与止血——现代理论与临床实践. 南京:江苏科技出版社, 1994. 42-67.
3 Nurden P. Bidirectional trafficking of membrane glycoproteins following platelet activation in suspension. Thromb Haemost, 1997, 78: 1305-1315.
4 黄葆钧,余斌杰. 糖尿病肾病的诊断与症治. 中华医学杂志, 1984, 64: 160-163.
, 百拇医药
5 Shattil SJ, Cunningham M, Hoxie JA. Detection of activated platelets in whole blood using activation-dependent monoclonal antibodies and flow cytometry. Blood, 1987, 70: 307-315.
6 Warkentin TE, Powling MJ, Hardisty RM. Measurement of fibrinogen binding to platelets in whole blood by flow cytometry: a micromethod for the detection of platelet activation. Br J Haematol, 1990, 76: 387-394., http://www.100md.com
摘要 目的：观察Ⅱ型糖尿病患者血小板膜糖蛋白及纤维蛋白原结合的变化，确定其对判断血小板活化及血管并发症的价值。方法：用流式细胞术观察85例Ⅱ型糖尿病患者(有血管病变者47例，无血管病变者38例)及30例健康人血小板膜上P-选择素、糖蛋白(GP)Ⅱb-Ⅲa复合物、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa表达及纤维蛋白原结合的改变。结果：血小板膜P-选择素、纤维蛋白原结合及GPⅡb-Ⅲa的表达在糖尿病患者伴血管病变者明显高于无血管病变者及正常对照；GPⅠb在血管病变组低于无血管病变组与对照组；GPⅡb、GPⅢa在3组间比较差异均无显著性；所有指标在无血管病变组与正常组无明显差别。结论：血小板膜GPⅠb、GPⅡb-Ⅲa复合物、纤维蛋白原结合及P-选择素对判断糖尿病病人的血小板活化以及血管病变有重要价值。
, 百拇医药
关键词：糖尿病,非胰岛素依赖型 血小板膜糖蛋白类
糖尿病(DM)易并发慢性特异性微血管病变和大血管病变是影响预后的主要原因。糖尿病血管病变的发病机制甚为复杂，血小板活化与内皮细胞损伤起着重要作用[1]。当血小板活化时，α颗粒膜与血小板质膜融合，使P-选择素暴露于质膜表面成为血小板活化的分子标志，同时血小板构型发生改变，糖蛋白(GP)Ⅱb -Ⅲa的纤维蛋白原受体暴露，引起纤维蛋白原与血小板的结合[2]。而GPⅠb及GPⅡb -Ⅲa则通过开放管道系统(OCS)发生膜内外的转位，使血小板膜糖蛋白出现一系列改变[3]。近年来，流式细胞仪(FCM)在临床上已得到广泛的应用，并已成为研究血小板结构与功能的一个新的手段。我们利用FCM分析Ⅱ型糖尿病患者血小板膜糖蛋白的表达及纤维蛋白原的结合，探讨其在糖尿病病人的血小板活化以及血管病变诊断中的价值。
病例和方法
, 百拇医药
一、研究对象
85例Ⅱ型糖尿病患者均为内分泌科住院病人，符合WHO在1985年制定的糖尿病诊断标准。伴血管病变者47例，无血管病变者38例。糖尿病伴血管病变包括肾脏病变、视网膜病变、心脏病变及脑血管病变，符合下列条件之一者即可诊断：(1)24 h尿放射免疫法测定α2-微球蛋白、白蛋白、IgA、IgG和尿糖蛋白5项中有3项异常,且排除泌尿系统自身病变者[4]；(2)按1985年国内第三届眼科学术会议规定标准，确诊有糖尿病视网膜病和眼底检查在Ⅱ级或Ⅱ级以上者；(3)按Minnesota标准，以往有过肯定的心肌梗死或有典型的心绞痛伴心电图缺血表现；(4)经CT证实的缺血性或出血性脑血管病。其中男20例，女27例，年龄44～77岁，平均63岁，血清总胆固醇(TCh)为(5.93±2.01) mmol/L。无血管病变组38例，男17例，女21例，年龄41～72岁，平均58岁，血TCh为(4.62±1.43) mmol/L。正常对照组为30例健康自愿者，年龄、性别与病例组匹配，血TCh为(4.56±1.39) mmol/L。所有受检者外周血血小板数均大于50×109/L，检查前10 d内未服用阿司匹林、潘生丁、肝素等影响血小板功能的药物。
, 百拇医药
二、测定方法
1.标本采集: 空腹采血2 ml，以3.8%枸橼酸三钠(内置适量阿司匹林，前列腺素E1)抗凝。抗凝全血即以10倍PBS(含阿司匹林及前列腺素E1)稀释。
2.血小板膜糖蛋白测定[5]: 将50 μl稀释全血分别加入事先置有单抗SZ2(抗GPⅠb)、SZ21(抗GPⅢa)、SZ22(抗GPⅡb )、SZ51(抗P-选择素)及C7E3(抗GPⅡb -Ⅲa复合物)的塑料管内(其中SZ2、SZ21、SZ22与SZ51为苏州医学院血栓研究室研制，C7E3为比利时Coller博士馈赠)，对照管为等量PBS。室温反应30 min，再加入FITC-羊抗鼠IgG(武汉生物公司产品)避光温育，固定，洗涤两遍后PBS悬浮，待测。
3.血小板膜纤维蛋白原结合反应[6]: 50 μl稀释全血加入含抗纤维蛋白原单抗SZ65(苏州医学院血栓研究室产品)的塑料管中，对照管为等量PBS，反应后加二抗温育，具体步骤同上。
, 百拇医药
4.血小板的FCM检测: 用Coulter公司的Epics-XL型流式细胞仪检测，选择488 nm的氩离子激发波长，测定5 000～10 000个血小板的荧光阳性百分率及平均荧光强度(MFI)。
三、统计学处理
采用SPSS统计软件包，结果以均数±标准差表示，样品均数间行t检验。
结果
Ⅱ型糖尿病伴血管病变者血小板膜P-选择素、GPⅡb -Ⅲa复合物的表达及纤维蛋白原结合的荧光阳性血小板百分率与MFI都明显高于正常者及无血管病变组，无血管病变者较正常组有增高趋势，但差异无显著性。相反，GPⅠb在血管病变组低于无血管病变组与对照组，后两组间无明显差异。而GPⅡb 及GPⅢa在3组间差别均无显著性 (表1)。
讨论
, 百拇医药
血小板膜糖蛋白在血小板黏附、聚集和释放反应中起着重要作用。正常血液中，血小板处于“静息”状态。当血小板受到一定的刺激时被活化、伸出伪足，细胞骨架发生重组，产生血小板膜糖蛋白的改变。其中α颗粒膜与质膜融合，P-选择素暴露于血小板质膜表面，成为血小板活化的重要标志[2]。而在粘附聚集过程中同样起重要作用的GPⅠb与GPⅡb -Ⅲa则在血小板活化过程中由开放管道系统(OCS)实现膜内外的相互转位，GPⅠb从膜外移向膜内，另一部分GPⅡb -Ⅲa复合物则由OCS及α颗粒膜释放转向膜外[3]。同时血小板空间构型发生改变，GPⅡb -Ⅲa复合物上纤维蛋白原受体暴露，促进纤维蛋白原与GPⅡb -Ⅲa的相互识别、结合，血小板聚集[2，6]。这些变化均可成为血小板活化的指标。
表1 Ⅱ型糖尿病患者血小板膜糖蛋白及纤维蛋白原结合的改变(%,x±s)
组别
, 百拇医药
例数
P-选择素
GPⅡb -Ⅲa
GPⅠb
GPⅡb
GPⅢa
纤维蛋白原结合
对照组
30
4.23±1.73
87.98±6.80
95.77±4.19
, 百拇医药 91.71±7.24
96.13±3.73
5.12±5.44
(0.36±0.10)
(1.83±0.23)
(2.88±0.56)
(2.45±0.68)
(2.95±0.47)
(0.47±0.13)
Ⅱ型糖尿病组
无血管病变
38
, 百拇医药
4.79±2.38
89.14±5.16
94.22±4.59
91.51±9.89
94.53±4.94
17.88±4.28
(0.38±0.10)
(1.86±0.26)
(2.57±0.48)
(2.30±0.57)
(2.99±0.65)
, 百拇医药
(0.49±0.13)
有血管病变
47
13.23±5.11△
94.31±2.75▲
89.78±6.96*
94.19±8.23
96.45±2.87
32.68±9.41△
(0.61±0.16)△
, http://www.100md.com
(2.14±0.37)*
(2.27±0.62)*
(2.48±0.60)
(3.26±0.61)
(1.0±0.28)△
注:括号内为平均荧光强度 与对照组比较，△P<0.001；▲P<0.01；*P<0.05 糖尿病患者糖与脂质代谢的异常使血小板活化，动脉粥样硬化发生率增高，血管病变易于发生。我们在实验中发现糖尿病有血管病变者血小板膜表面P-选择素、纤维蛋白原的结合及GPⅡb -Ⅲa的表达均明显高于正常人，GPⅠb则在血管病变组低于正常人，证实在糖尿病血管病变的发生过程中血小板活化 起着重要作用，这对判断糖尿病的病情有一定的临床意义。其中P-选择素与纤维蛋白原结合的改变最为明显，可能成为评估血小板活化程度的灵敏指标。GPⅡb 与GPⅢa改变不明显，这可能是由于血小板表面在静息状态时已存在大量的GPⅡb -Ⅲa(GPⅡb -Ⅲa分子数50 000)，膜内外转位的糖蛋白对GPⅡb 与Ⅲa在膜表面表达的总的影响不大。但GPⅡb -Ⅲa复合物的构型已有改变，这种改变可被特异性识别GPⅡb -Ⅲa复合物的单抗C7 E3检测。另一方面，无血管性疾病合并症的糖尿病病人的血小板膜糖蛋白均无明显改变，这也说明血小板活化在血管病变形成中的作用和血管病变促进了血小板活化。同时，从标本来源可以发现糖尿病有血管病变患者血胆固醇明显高于正常人，无血管病变者改变不明显，表明糖尿病血管病变过程中脂质代谢的异常与血糖的异常对血小板活化有协同作用。
, 百拇医药
FCM作为新型的血小板检测技术，可灵敏而特异地对各种血小板膜成分进行分析，方法简便、快速并避免了核素的接触。这可能为临床上糖尿病血管病变患者及其他血栓病疾病的诊断与预后判断提供新的依据。
作者单位：韩 悦(江苏省苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 215006)
王兆钺(江苏省苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 215006)
阮长耿(江苏省苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 215006)
蔡鑫元(内分泌科)
耿美菊(苏州医学院重点实验室)
陈 黎(苏州医学院重点实验室)
参考文献
, 百拇医药
1 Tschoepe D. The activated megakaryocyte-platelet-system in vascular disease: focus on diabetes. Semin Thromb Hemost, 1995, 21: 152-160.
2 阮长耿，主编. 血栓与止血——现代理论与临床实践. 南京:江苏科技出版社, 1994. 42-67.
3 Nurden P. Bidirectional trafficking of membrane glycoproteins following platelet activation in suspension. Thromb Haemost, 1997, 78: 1305-1315.
4 黄葆钧,余斌杰. 糖尿病肾病的诊断与症治. 中华医学杂志, 1984, 64: 160-163.
, 百拇医药
5 Shattil SJ, Cunningham M, Hoxie JA. Detection of activated platelets in whole blood using activation-dependent monoclonal antibodies and flow cytometry. Blood, 1987, 70: 307-315.
6 Warkentin TE, Powling MJ, Hardisty RM. Measurement of fibrinogen binding to platelets in whole blood by flow cytometry: a micromethod for the detection of platelet activation. Br J Haematol, 1990, 76: 387-394., http://www.100md.com