用激光扫描共聚焦显微镜观察吗啡成瘾对大鼠海马神经细胞内钙离子的影响
马光瑜 樊小力 徐小虎 韩太真
摘 要：目的 为了取得吗啡成瘾对神经细胞内钙离子([Ca2+]i)影响的直接证据，探索吗啡成瘾的神经生物学机制及对吗啡成瘾可能的治疗途径。方法 根据新型荧光探针Fluo-3能与活细胞内[Ca2+]i特异性结合后发出荧光的特性，将19只新生SD大鼠随机分成吗啡成瘾组和对照组，给吗啡成瘾组动物腹腔注射吗啡使其成瘾，用Fluo-3荧光探针对两组动物的海马神经细胞分别进行染色，利用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)技术对两组大鼠的海马神经细胞(主要是锥体细胞)内[Ca2+]i的变化进行了观察研究，并用图像分析技术进行处理。结果 吗啡成瘾大鼠海马锥体神经细胞内Ca2+浓度的平均荧光像素是对照组的3.7倍。结论 吗啡成瘾可能明显增高大鼠海马锥体神经细胞内Ca2+浓度。
, 百拇医药 关键词：激光扫描共聚焦显微镜 吗啡成瘾 海马锥体细胞钙离子
吗啡成瘾对神经细胞内钙离子([Ca2+]i)的影响一直是神经科学研究的热点问题之一。为了取得吗啡成瘾对神经细胞内[Ca2+]i影响的直接证据，探索吗啡成瘾的神经生物学机制及对吗啡成瘾可能的治疗途径，本研究根据新型荧光探针Fluo-3能与活细胞内[Ca2+]i特异性结合后发出荧光的特性，利用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)技术对吗啡成瘾新生大鼠的海马神经细胞(主要是锥体细胞)内[Ca2+]i的变化进行了观察研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂与仪器 本实验采用新生SD大鼠19只，雌雄不拘。实验动物由汕头大学医学院实验动物中心提供。盐酸吗啡注射液由沈阳第一制药厂生产，批号：911103。Fluo-3/AM:Molecular Probe, Inc.美国产ACAS Ultima-312型激光扫描共聚焦显微镜系统(Meridian Inc)。美国产WSZ-286-82解剖显微镜。上海产FA1604电子天平。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组及动物模型建立[1]：将19只新生SD大鼠随机分成2组，对照组9只，实验组(吗啡成瘾组)10只。给实验组动物从出生后第12 h起腹腔注射(ip)吗啡，剂量由5 mg/kg体重逐日增加到25 mg/kg体重，每天注射3次，连续注射5天，造成吗啡依赖。给形成吗啡依赖的大鼠ip纳洛酮4 mg/kg，约20～30 min后，动物出现跳跃、湿狗样震颤、躁动不安、躯体扭动、互相撕咬、刻板性晃头、尾巴在地上左右扫动、竖毛、牙齿打颤等；约2 h左右动物还出现眼睑下垂、流涎、腹泻、流泪、厌食、闭目、尾巴发紫、体重下降等症状。如未成瘾，则不出现上述症状。而对照组动物在此期间接受等剂量生理盐水(NS)注射。
1.2.2 海马神经细胞的快速分离：在最末次注射吗啡或生理盐水后1 h，将动物断头处死，迅速取出脑，在低温修块台上分离出双侧海马，用切片刀切成薄片。用口径为500 μm的玻璃吸管将这些脑组织移至4 mL含0.25%胰蛋白酶，并通有95% O2和5%CO2的混合气体的无钙人工脑脊液(NaCl 124 mM, KCl 3.4 mM，MgSO4 1.7 mM,KH2PO4 1.2 mM, NaHCO3 25 mM, Glucose 10mM)中，在32℃水浴中消化30 min。然后，用含Ca2+的人工脑脊液(CaCl2 2.4 mM)置换无钙人工脑脊液2～3次，使胰蛋白酶灭活。将经过消化的脑组织分别用端口直径为500 μm、200 μm、100 μm的玻璃吸管依次轻轻吹打，至组织呈粘稠状。然后在室温下静置10 min后，用移液管取75 μL悬浮液滴于涂有明胶的盖玻片上，再静置10～15 min使细胞贴壁。
, 百拇医药
1.2.3 神经细胞的Fluo-3/AM负载：用微量加样器向贴壁于盖玻片上的海马神经细胞悬浮液中滴加荧光探针Fluo-3(浓度为1000 mM) 1 μL(Fluo-3为Ca2+敏感荧光染料，以乙酰甲氧基,acetoxymethyl酯化形式扩散入细胞，用郗昕、姜泗长的方法[2]配制而成)和25% Pluronic F-127 1 μL，于37℃恒温培养箱中孵育45～60 min[9]，然后，用人工脑脊液轻轻冲洗2～3次后，再加入1滴人工脑脊液封片观察[3]。
1.2.4 激光扫描共聚焦显微镜检测：在检测海马神经细胞内[Ca2+]i浓度时，激发光选用488 nm，发射光为530 nm。将载有样品的玻片固定在显微镜载物台上，在40 x高倍镜下，在不同视野选择锥体细胞进行激光扫描。所有扫描图像存入计算机硬盘内，分析重新读出。
1.3 图像分析与数据处理
, 百拇医药
ACAS Ultima-312型激光扫描共聚焦显微镜系统含有图像处理系统。在进行数据处理时将荧光像素数以平均值±标准差(X±s)表示，用t检验法进行两组间均数的显著性检验。
2 结果
大鼠海马神经细胞内[Ca2+]i检测，对照组9只SD大鼠的21份海马神经细胞标本及10只吗啡成瘾组大鼠的19份海马神经细胞标本，在Fluo-3/AM染色之后用激光扫描共聚焦显微镜系统进行了观察，其中主要对海马的锥体神经细胞的荧光像素进行了检测。结果发现，吗啡成瘾组大鼠海马神经细胞的荧光像素数明显高于正常对照组(见表1，表中n代表每只成瘾动物镜下标本采样数，n′为每只对照组动物镜下标本采样数)，吗啡成瘾组动物平均每个神经细胞的荧光像素数为52733±20431，而对照组动物神经细胞的平均像素数14151±4454，两者有显著性差异(P<0.01)。说明吗啡成瘾大鼠海马神经细胞内的Ca2+浓度明显高于正常大鼠组神经细胞内Ca2+浓度(见图1)。
, 百拇医药
Fig.1 Visualization of the man fluorescence pixels of in the pyamidal neurons of morphine dependent SD rats and control group by LSCM (a.Morphine dependent b.Control)
图1 激光共聚焦显微镜技术显示的大鼠海马神经细胞内钙离子荧光象素比较.
(a.吗啡成瘾组 b.对照组)
表1 吗啡成瘾组与对照组大鼠海马神经细胞内钙离子平均荧光像素比较
荧光像素
标本1
标本2
, 百拇医药
标本3
标本4
标本5
标本6
标本7
标本8
标本9
标本10
n=10
n=9
n=11
n=8
n=9
, http://www.100md.com
n=10
n=9
n=10
n=9
n=10
成瘾组
77552±12113
58320±4536
54448±7637
76032±8246
77888±7962
40922±2800
, 百拇医药
31598±6908
36297±5794
19984±2578
54291±4690
n′=9
n′=9
n′=10
n′=9
n′=7
n′=8
n′=7
n′=9
, http://www.100md.com
n′=9
对照组
15776±2456
10240±1699
9023±479
9854±1690
18642±4710
20335±3791
18502±2799
15066±2066
9886±689
3 讨论
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细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i的变化对于细胞活动和功能有非常重要的作用。正常情况下，细胞内[Ca2+]i为50～150 nmol/L，细胞外[Ca2+]i为1.2～1.3 nmol/L,相差达10000倍[3]。因此，细胞内[Ca2+]i过高，将引起细胞的一系列病理损伤。有关吗啡对神经细胞内[Ca2+]i的影响，日本学者Yamamoto于1973年就认为，长期使用吗啡，可以使脑细胞内[Ca2+]i增高；以后，许多学者又陆续发现吗啡成瘾与Ca2+拮抗剂之间有着密切的关系[4,5]。1988年，Ramkumar和El-Fakahany等人研究发现，阿片类药物能改变细胞内[Ca2+]i动态平衡，慢性使用吗啡可以使脑内Ca2+通道数目增加[4]，而且使突触体对Ca2+的摄入增加[6，7]。1993年，Anne Stiene-Martin等人用荧光光度计检测的方法发现，阿片类药物可以选择性地增加培养的I型星状胶质细胞(type-1 astrocyte)内Ca2+浓度[8]。但迄今为止，用激光扫描共聚焦显微镜技术检测吗啡成瘾大鼠海马快速分离细胞内的[Ca2+]i变化尚未见报道。为了取得吗啡成瘾对神经细胞内[Ca2+]i影响的更直接精确的证据，本实验利用新一代荧光钙离子指示剂Fluo-3及目前国内最新型的激光扫描共聚焦微镜及图像分析技术，对吗啡成瘾大鼠海马锥体神经细胞内的[Ca2+]i变化与正常大鼠进行了比较。结果发现，吗啡依赖大鼠其海马锥体神经细胞的荧光强度比正常对照组动物高出3.7倍。由于Fluo-3及Fluo-3/AM本身无荧光，只有Fluo-3/AM与Ca2+结合后才能发现强荧光，因此，荧光的强弱可以反映出细胞内Ca2+的浓度。检测结果证明，吗啡成瘾大鼠的海马神经细胞内[Ca2+]i明显高于正常大鼠细胞神经内[Ca2+]i，说明在吗啡成瘾过程中，细胞内[Ca2+]i发生了明显变化。这与Hauser等人用其他方法在培养的神经细胞中使用吗啡后所观察到的结果是相似的[8，9]。
, http://www.100md.com
由于神经细胞内[Ca2+]i与神经递质的释放有密切关系，所以，吗啡依赖或者戒断时，神经细胞内[Ca2+]i的剧烈变化，引起神经突触传递增强，我们以前的电生理研究至少证明了吗啡成瘾大鼠的海马神经突触的传递是增强的(结果待发表)；另外，吗啡成瘾时，神经突触对ACh\,NE、DA等递质的释放量明显增加[10]，动物会出现戒断综合征。因此，对神经细胞内[Ca2+]i检测，除对阿片类药物的作用机制有研究意义外，还可了解吗啡依赖治疗药物的疗效，并为研究利用Ca2+阻断剂治疗吗啡依赖及戒断症状提供可能途径，我们的系统研究证实Ca2+阻断剂对大鼠的吗啡戒断症状有明显治疗作用(结果待公开发表)。
本研究还观察到，处于生长发育期的吗啡成瘾幼鼠的海马锥体神经细胞，其体积较正常对照组为大。Hauser等人认为，细胞内[Ca2+]i增加，有促进星形胶质细胞质合成的作用[8，9]。这提示吗啡成瘾很可能与神经细胞分化成熟有密切关系。可见，研究吗啡成瘾与神经细胞内[Ca2+]i的关系，将为研究内啡肽及阿片受体在神经细胞乃至神经系统的发育过程中的作用提供重要线索和启发。吗啡成瘾可能明显增高大鼠海马锥体神经细胞内Ca2+浓度。
, 百拇医药
(致谢：在本实验过程中，汕头大学医学院中心实验室陈耀文、林珏龙老师及山西医科大学博士研究生叶岚同学给予了热情帮助，特此致谢。)
(本文图见扉页)
马光瑜(汕头大学医学院法医学研究所与精神卫生中心 515031)
樊小力(西安医科大学生理学教研室)
徐小虎(汕头大学医学院法医学研究所与精神卫生中心 515031)
韩太真(西安医科大学生理学教研室)
参考文献
1.Barrios M, Baeyens JM. Differential effects of L-type calcium channel blockers and stimulants on naloxone-precipitated withdrawal in mice acutely dependent on morphine. Psychopharmacology Berl, 1991, 104(3):397
, http://www.100md.com
2.郗 昕， 姜泗长. 用共聚焦显微镜观察ACh及ATP对豚鼠耳蜗外毛细胞Ca2+的调控. 生理学报，1995， 47(2)：105
3.李 楠，尹 岭，苏振伦. 激光扫描共聚焦显微术. 北京：人民军医出版社，1997. 26～72
4.Ramkumar V, el-Fakahany EE. Prolonged morphine treatment increases rat brain dihydropyridine binding site:Possible involvement in development of morphine dependence. Eur J Pharmacol, 1988, 146(1):73
5.Barrios M, Baeyens JM. Differential effect of L-type calcium channel blockers and stimulants on naloxone precipitated in mice acutely dependent on morphine. Psychopharmacology, 1991, 104(3):379
, http://www.100md.com
6.Welch SP, Olson KG. Opiate tolerance-induced modulation of free intracellular calcium in synaptosomes. Life Sci, 1991, 48(19):1853
7.Chapman DB， Way EL. Modification of endorphine/enkephalin analgesia and stress induced anagesia by divalent cations, a cation chelator and an ionophore. Br J Pharmacol, 1982, 75(2):289
8.Stiene Martin A, Mattson MP, Hauser KF. Opiates selectively increase intracellular calcium in developing type-1 astrocytes:role of calcium in morphine-induced morphologic differentiation. Brain-Res-Dev.-Brain-Res, 1993, 76(2):189
, 百拇医药
9.Hauser KF, Stiene MA, Mattson PM,et al.μ-opioid receptor-induced Ca2+ mobilization and astroglial development:morphine inhibits DNA synthesis and stimulates cellular hypertrophy through a Ca2+-dependent mechanism. Brain Res, 1996, 720(1-2):191
10.Spanagel R, Hwrz A, Shippenberg TS, et al.Opposing tonically active endogenous opioid systems modulate the mesolimbic dopaminergic pathway. Proc Nat Sci, 1992, 89(6):2046, 百拇医药
摘 要：目的 为了取得吗啡成瘾对神经细胞内钙离子([Ca2+]i)影响的直接证据，探索吗啡成瘾的神经生物学机制及对吗啡成瘾可能的治疗途径。方法 根据新型荧光探针Fluo-3能与活细胞内[Ca2+]i特异性结合后发出荧光的特性，将19只新生SD大鼠随机分成吗啡成瘾组和对照组，给吗啡成瘾组动物腹腔注射吗啡使其成瘾，用Fluo-3荧光探针对两组动物的海马神经细胞分别进行染色，利用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)技术对两组大鼠的海马神经细胞(主要是锥体细胞)内[Ca2+]i的变化进行了观察研究，并用图像分析技术进行处理。结果 吗啡成瘾大鼠海马锥体神经细胞内Ca2+浓度的平均荧光像素是对照组的3.7倍。结论 吗啡成瘾可能明显增高大鼠海马锥体神经细胞内Ca2+浓度。
, 百拇医药 关键词：激光扫描共聚焦显微镜 吗啡成瘾 海马锥体细胞钙离子
吗啡成瘾对神经细胞内钙离子([Ca2+]i)的影响一直是神经科学研究的热点问题之一。为了取得吗啡成瘾对神经细胞内[Ca2+]i影响的直接证据，探索吗啡成瘾的神经生物学机制及对吗啡成瘾可能的治疗途径，本研究根据新型荧光探针Fluo-3能与活细胞内[Ca2+]i特异性结合后发出荧光的特性，利用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)技术对吗啡成瘾新生大鼠的海马神经细胞(主要是锥体细胞)内[Ca2+]i的变化进行了观察研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂与仪器 本实验采用新生SD大鼠19只，雌雄不拘。实验动物由汕头大学医学院实验动物中心提供。盐酸吗啡注射液由沈阳第一制药厂生产，批号：911103。Fluo-3/AM:Molecular Probe, Inc.美国产ACAS Ultima-312型激光扫描共聚焦显微镜系统(Meridian Inc)。美国产WSZ-286-82解剖显微镜。上海产FA1604电子天平。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组及动物模型建立[1]：将19只新生SD大鼠随机分成2组，对照组9只，实验组(吗啡成瘾组)10只。给实验组动物从出生后第12 h起腹腔注射(ip)吗啡，剂量由5 mg/kg体重逐日增加到25 mg/kg体重，每天注射3次，连续注射5天，造成吗啡依赖。给形成吗啡依赖的大鼠ip纳洛酮4 mg/kg，约20～30 min后，动物出现跳跃、湿狗样震颤、躁动不安、躯体扭动、互相撕咬、刻板性晃头、尾巴在地上左右扫动、竖毛、牙齿打颤等；约2 h左右动物还出现眼睑下垂、流涎、腹泻、流泪、厌食、闭目、尾巴发紫、体重下降等症状。如未成瘾，则不出现上述症状。而对照组动物在此期间接受等剂量生理盐水(NS)注射。
1.2.2 海马神经细胞的快速分离：在最末次注射吗啡或生理盐水后1 h，将动物断头处死，迅速取出脑，在低温修块台上分离出双侧海马，用切片刀切成薄片。用口径为500 μm的玻璃吸管将这些脑组织移至4 mL含0.25%胰蛋白酶，并通有95% O2和5%CO2的混合气体的无钙人工脑脊液(NaCl 124 mM, KCl 3.4 mM，MgSO4 1.7 mM,KH2PO4 1.2 mM, NaHCO3 25 mM, Glucose 10mM)中，在32℃水浴中消化30 min。然后，用含Ca2+的人工脑脊液(CaCl2 2.4 mM)置换无钙人工脑脊液2～3次，使胰蛋白酶灭活。将经过消化的脑组织分别用端口直径为500 μm、200 μm、100 μm的玻璃吸管依次轻轻吹打，至组织呈粘稠状。然后在室温下静置10 min后，用移液管取75 μL悬浮液滴于涂有明胶的盖玻片上，再静置10～15 min使细胞贴壁。
, 百拇医药
1.2.3 神经细胞的Fluo-3/AM负载：用微量加样器向贴壁于盖玻片上的海马神经细胞悬浮液中滴加荧光探针Fluo-3(浓度为1000 mM) 1 μL(Fluo-3为Ca2+敏感荧光染料，以乙酰甲氧基,acetoxymethyl酯化形式扩散入细胞，用郗昕、姜泗长的方法[2]配制而成)和25% Pluronic F-127 1 μL，于37℃恒温培养箱中孵育45～60 min[9]，然后，用人工脑脊液轻轻冲洗2～3次后，再加入1滴人工脑脊液封片观察[3]。
1.2.4 激光扫描共聚焦显微镜检测：在检测海马神经细胞内[Ca2+]i浓度时，激发光选用488 nm，发射光为530 nm。将载有样品的玻片固定在显微镜载物台上，在40 x高倍镜下，在不同视野选择锥体细胞进行激光扫描。所有扫描图像存入计算机硬盘内，分析重新读出。
1.3 图像分析与数据处理
, 百拇医药
ACAS Ultima-312型激光扫描共聚焦显微镜系统含有图像处理系统。在进行数据处理时将荧光像素数以平均值±标准差(X±s)表示，用t检验法进行两组间均数的显著性检验。
2 结果
大鼠海马神经细胞内[Ca2+]i检测，对照组9只SD大鼠的21份海马神经细胞标本及10只吗啡成瘾组大鼠的19份海马神经细胞标本，在Fluo-3/AM染色之后用激光扫描共聚焦显微镜系统进行了观察，其中主要对海马的锥体神经细胞的荧光像素进行了检测。结果发现，吗啡成瘾组大鼠海马神经细胞的荧光像素数明显高于正常对照组(见表1，表中n代表每只成瘾动物镜下标本采样数，n′为每只对照组动物镜下标本采样数)，吗啡成瘾组动物平均每个神经细胞的荧光像素数为52733±20431，而对照组动物神经细胞的平均像素数14151±4454，两者有显著性差异(P<0.01)。说明吗啡成瘾大鼠海马神经细胞内的Ca2+浓度明显高于正常大鼠组神经细胞内Ca2+浓度(见图1)。
, 百拇医药
Fig.1 Visualization of the man fluorescence pixels of in the pyamidal neurons of morphine dependent SD rats and control group by LSCM (a.Morphine dependent b.Control)
图1 激光共聚焦显微镜技术显示的大鼠海马神经细胞内钙离子荧光象素比较.
(a.吗啡成瘾组 b.对照组)
表1 吗啡成瘾组与对照组大鼠海马神经细胞内钙离子平均荧光像素比较
荧光像素
标本1
标本2
, 百拇医药
标本3
标本4
标本5
标本6
标本7
标本8
标本9
标本10
n=10
n=9
n=11
n=8
n=9
, http://www.100md.com
n=10
n=9
n=10
n=9
n=10
成瘾组
77552±12113
58320±4536
54448±7637
76032±8246
77888±7962
40922±2800
, 百拇医药
31598±6908
36297±5794
19984±2578
54291±4690
n′=9
n′=9
n′=10
n′=9
n′=7
n′=8
n′=7
n′=9
, http://www.100md.com
n′=9
对照组
15776±2456
10240±1699
9023±479
9854±1690
18642±4710
20335±3791
18502±2799
15066±2066
9886±689
3 讨论
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细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i的变化对于细胞活动和功能有非常重要的作用。正常情况下，细胞内[Ca2+]i为50～150 nmol/L，细胞外[Ca2+]i为1.2～1.3 nmol/L,相差达10000倍[3]。因此，细胞内[Ca2+]i过高，将引起细胞的一系列病理损伤。有关吗啡对神经细胞内[Ca2+]i的影响，日本学者Yamamoto于1973年就认为，长期使用吗啡，可以使脑细胞内[Ca2+]i增高；以后，许多学者又陆续发现吗啡成瘾与Ca2+拮抗剂之间有着密切的关系[4,5]。1988年，Ramkumar和El-Fakahany等人研究发现，阿片类药物能改变细胞内[Ca2+]i动态平衡，慢性使用吗啡可以使脑内Ca2+通道数目增加[4]，而且使突触体对Ca2+的摄入增加[6，7]。1993年，Anne Stiene-Martin等人用荧光光度计检测的方法发现，阿片类药物可以选择性地增加培养的I型星状胶质细胞(type-1 astrocyte)内Ca2+浓度[8]。但迄今为止，用激光扫描共聚焦显微镜技术检测吗啡成瘾大鼠海马快速分离细胞内的[Ca2+]i变化尚未见报道。为了取得吗啡成瘾对神经细胞内[Ca2+]i影响的更直接精确的证据，本实验利用新一代荧光钙离子指示剂Fluo-3及目前国内最新型的激光扫描共聚焦微镜及图像分析技术，对吗啡成瘾大鼠海马锥体神经细胞内的[Ca2+]i变化与正常大鼠进行了比较。结果发现，吗啡依赖大鼠其海马锥体神经细胞的荧光强度比正常对照组动物高出3.7倍。由于Fluo-3及Fluo-3/AM本身无荧光，只有Fluo-3/AM与Ca2+结合后才能发现强荧光，因此，荧光的强弱可以反映出细胞内Ca2+的浓度。检测结果证明，吗啡成瘾大鼠的海马神经细胞内[Ca2+]i明显高于正常大鼠细胞神经内[Ca2+]i，说明在吗啡成瘾过程中，细胞内[Ca2+]i发生了明显变化。这与Hauser等人用其他方法在培养的神经细胞中使用吗啡后所观察到的结果是相似的[8，9]。
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由于神经细胞内[Ca2+]i与神经递质的释放有密切关系，所以，吗啡依赖或者戒断时，神经细胞内[Ca2+]i的剧烈变化，引起神经突触传递增强，我们以前的电生理研究至少证明了吗啡成瘾大鼠的海马神经突触的传递是增强的(结果待发表)；另外，吗啡成瘾时，神经突触对ACh\,NE、DA等递质的释放量明显增加[10]，动物会出现戒断综合征。因此，对神经细胞内[Ca2+]i检测，除对阿片类药物的作用机制有研究意义外，还可了解吗啡依赖治疗药物的疗效，并为研究利用Ca2+阻断剂治疗吗啡依赖及戒断症状提供可能途径，我们的系统研究证实Ca2+阻断剂对大鼠的吗啡戒断症状有明显治疗作用(结果待公开发表)。
本研究还观察到，处于生长发育期的吗啡成瘾幼鼠的海马锥体神经细胞，其体积较正常对照组为大。Hauser等人认为，细胞内[Ca2+]i增加，有促进星形胶质细胞质合成的作用[8，9]。这提示吗啡成瘾很可能与神经细胞分化成熟有密切关系。可见，研究吗啡成瘾与神经细胞内[Ca2+]i的关系，将为研究内啡肽及阿片受体在神经细胞乃至神经系统的发育过程中的作用提供重要线索和启发。吗啡成瘾可能明显增高大鼠海马锥体神经细胞内Ca2+浓度。
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(致谢：在本实验过程中，汕头大学医学院中心实验室陈耀文、林珏龙老师及山西医科大学博士研究生叶岚同学给予了热情帮助，特此致谢。)
(本文图见扉页)
马光瑜(汕头大学医学院法医学研究所与精神卫生中心 515031)
樊小力(西安医科大学生理学教研室)
徐小虎(汕头大学医学院法医学研究所与精神卫生中心 515031)
韩太真(西安医科大学生理学教研室)
参考文献
1.Barrios M, Baeyens JM. Differential effects of L-type calcium channel blockers and stimulants on naloxone-precipitated withdrawal in mice acutely dependent on morphine. Psychopharmacology Berl, 1991, 104(3):397
, http://www.100md.com
2.郗 昕， 姜泗长. 用共聚焦显微镜观察ACh及ATP对豚鼠耳蜗外毛细胞Ca2+的调控. 生理学报，1995， 47(2)：105
3.李 楠，尹 岭，苏振伦. 激光扫描共聚焦显微术. 北京：人民军医出版社，1997. 26～72
4.Ramkumar V, el-Fakahany EE. Prolonged morphine treatment increases rat brain dihydropyridine binding site:Possible involvement in development of morphine dependence. Eur J Pharmacol, 1988, 146(1):73
5.Barrios M, Baeyens JM. Differential effect of L-type calcium channel blockers and stimulants on naloxone precipitated in mice acutely dependent on morphine. Psychopharmacology, 1991, 104(3):379
, http://www.100md.com
6.Welch SP, Olson KG. Opiate tolerance-induced modulation of free intracellular calcium in synaptosomes. Life Sci, 1991, 48(19):1853
7.Chapman DB， Way EL. Modification of endorphine/enkephalin analgesia and stress induced anagesia by divalent cations, a cation chelator and an ionophore. Br J Pharmacol, 1982, 75(2):289
8.Stiene Martin A, Mattson MP, Hauser KF. Opiates selectively increase intracellular calcium in developing type-1 astrocytes:role of calcium in morphine-induced morphologic differentiation. Brain-Res-Dev.-Brain-Res, 1993, 76(2):189
, 百拇医药
9.Hauser KF, Stiene MA, Mattson PM,et al.μ-opioid receptor-induced Ca2+ mobilization and astroglial development:morphine inhibits DNA synthesis and stimulates cellular hypertrophy through a Ca2+-dependent mechanism. Brain Res, 1996, 720(1-2):191
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