妊娠高血压综合征患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与血浆中同型半胱氨酸水平测定
妊娠高血压综合征患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与血浆中同型半胱氨酸水平测定
李克深 孙延芝 陈黎明 张贵寅 李璞
摘要 目的：探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C 677T多态性及血浆同型半胱氨酸水平与妊娠高血压综合征(妊高征)的关系。 方法：采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态分析法对62例妊高征患者(妊高征组)及90例正常孕妇(对照组)进行MTHFR基因C677T等位基因检测，并同时用高效液相色谱法测量两组孕妇血浆中的同型半胱氨酸水平。 结果：妊高征组纯合变异型T 677/T 677频率为0.27，T 677等位基因频率为0.52，明显高于对照组的0.13与0.31(P<0.05，P<0.01)，妊高征组同型半胱氨酸水平为(9.62±2.11) μmol/L，也明显高于对照组的(6.85±1.98) μmol/L(P<0.01)。结论：MTHFR基因C 677T多态是妊高征发病的遗传危险因素之一，它可以导致孕妇血液中同型半胱氨水平升高而引发妊高征。
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关键词：胺氧化还原酶类 半胱氨酸 妊娠并发症，心血管 高血压
近年来，运用分子生物学方法寻找妊娠高血压综合征(妊高征)易感基因成为研究该病病因的热点[1]，国外的研究发现，亚甲基四氢叶酸还原酶(meth- ylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因与妊高征发病关系密切[2]。MTHFR基因位于染色体1p36.3[3]。文献报道，如果MTHFR基因677位碱基C被T置换，则丙氨酸(Ala)被缬氨酸(Val)替换，MTHFR酶活性降低，易造成同型半胱氨酸(homo- cysteine, Hcy)血症，导致血管内皮细胞损伤，从而引起妊高征[4]。我们的研究旨在探讨妊高征患者MTHFR基因C 677T多态频率及血液中的同型半胱氨酸水平变化，为寻找妊高征的病因及防治方法提供依据。
资料与方法
, 百拇医药
一、研究对象
妊高征组共62例，年龄22～38岁，平均(27.8±3.4)岁，孕周35～41周，平均(38.4±2.4)周。均按乐杰主编的《妇产科学》(第4版)提出的标准[5]筛选。对照组共90例，均为随机选取的与妊高征组同期分娩的正常健康孕妇，平均年龄(26.8±1.8)岁，平均孕周(39.2±1.4)周。
二、方法
1.MTHFR等位基因检测：(1)人基因组DNA的抽提：抽取孕妇外周静脉血3～5 ml，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝，用常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。(2)聚合酶链反应(PCR)扩增：PCR引物：P1：5′-GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3′ P2：5′-CCCATGTCGGTGCATGCCTT-3′。反应体系为30 μl，包括模板DNA 200 ng，P1和P2各1 μl(6 pmol/L)，4×dNTP1.5 μl(2.5 mol/L)，10倍缓冲液3 μl，Taq DNA聚合酶1.5 U。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。(3)酶切及电泳：酶切体系20 μl，其中包括PCR产物10 μl，Taq I内切酶0.2 μl(10 U/μl)，10×酶切缓冲液2 μl，H2O 7.8 μl，65℃温育12 h。消化产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶上150V电泳3 h，银染照相，根据PCR产物酶切后的长度变化读取基因型。
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2.血液中同型半胱氨酸水平测定：取受试者静脉血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝，置于冰浴上，30 min内2 500 r/min离心10 min，用一支吸管小心吸取上层血清，-80℃冻存，直至检测。Hcy浓度的检测采用高效液相色谱(LC-6A，日本岛津公司产品)结合荧光检测法进行测量，D、L同型半胱氨酸标准品购于美国Sigma公司。
三、统计学处理
Hcy测定结果用(x±s)表示，采用t检验，等位基因分型结果采用χ2检验。
结果
一、MTHFR等位基因分型结果
妊高征组中T677/T677基因型为17例，C677/T677基因型为31例，C677/C677基因型为14例；而对照组中T677/T677基因型为12例，C677/T677基因型为32例，C677/C677基因型为46例。妊高征组T677/T677基因型频率(0.27)显著高于对照组(0.13)(P<0.05)。妊高征组中T677等位基因频率(0.52)，也显著高于对照组(0.31)(P<0.01)。见表1。
, 百拇医药
表1 两组孕妇MTHFR基因型与等位基因频率
组
别
总
例
数
基因型
等位基因
T677/T677
T677/C677
C677/C677
T
C
, 百拇医药
例数
频率
(%)
例数
频率
(%)
例数
频率
(%)
个数
频率
(%)
个数
频率
, 百拇医药
(%)
妊高征组
62
17
27
31
50
14
23
65
52
59
48
对照组
, http://www.100md.com
90
12
13
32
36
46
51
56
31
124
69
二、同型半胱氨酸水平测定
妊高征组Hcy平均值为(9.6±2.1) μmol/L，而对照组Hcy平均值为(6.9±2.0) μmol/L，两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。妊高征组MTHFR基因无论是纯合子突变型还是杂合子基因型血浆Hcy水平，均显著高于正常纯合子基因型；对照组中只有纯合子突变型的Hcy水平显著高于正常纯合子基因型，见表2。表2 不同MTHFR基因型孕妇血浆Hcy水平比较(μmol/L,x±s)
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组别
总
例数
基因型
T677/T677
T677/C677
C677/C677
妊高征组
62
12.8±3.3
9.4±2.1
6.2±2.3
对照组
, 百拇医药
90
9.8±2.1
7.0±1.8
6.0±2.7
讨论 一、MTHFR与Hcy代谢
导致血液中Hcy水平升高的原因有饮食及遗传两方面，饮食的原因主要是由于叶酸或维生素B12缺乏造成的；遗传的因素包括胱硫醚β合成酶缺乏或MTHFR活性降低。Hcy是一种含硫的氨基酸，由蛋氨酸通过蛋氨酸循环产生，产生后主要有两条去路，一条是在胱硫醚β合成酶的作用下生成α酮戊二酸退出蛋氨酸循环，如果胱硫醚β合成酶缺乏将会造成Hcy的堆积，但是已有的研究认为，这种情况并不多见；另一条去路是在甲基转移酶和维生素B12的作用下，由5-甲基四氢叶酸提供甲基，重新生成蛋氨酸。5-甲基四氢叶酸是由5，10-亚甲基四氢叶酸在MTHFR的作用下生成的，如果缺乏或活性降低也将造成Hcy的堆积。MTHFR基因由Goyette等[3]于1994年首次克隆成功，之后发现MTHFR基因的一个常见的多态C 677T，会导致MTHFR活性降低，使同型半胱氨酸向蛋氨酸的转化出现障碍，造成血液中同型半胱氨酸浓度上升[6]。高浓度的同型半胱氨酸将导致血管内皮细胞损伤[7]，可能是心血管疾病及妊高征的诱因之一。
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二、MTHFR基因多态与妊高征的关系
本研究结果显示，妊高征组T 677/T 677基因型频率及T 677等位基因频率均显著高于对照组，与日本学者Sohda等[2]所报道的数据相近，提示MTHFR基因C 677T多态可能是妊高征发病的一个遗传危险因素，但其并未对患者血液中的Hcy水平做具体检测。我们则在检测基因型的同时检测血中的Hcy水平，以具体观察MTHFR不同基因型对血液中Hcy水平的影响。Hcy的检测结果证实了我们的推测，妊高征组Hcy平均值明显高于对照组，而且MTHFR不同基因型对血浆Hcy水平有显著影响，两组中T677/T677基因型的Hcy水平均显著高于C677/C677基因型的Hcy水平，这说明MTHFR基因C677T多态使MTHFR活性降低，以至Hcy不能顺利转化为蛋氨酸，Hcy在血液中蓄积，使血液中的Hcy水平出现升高现象，同型半胱氨酸可在金属离子介导下自身氧化生成过氧化物及氧自由基，损伤内皮细胞的结构和功能[8]，血管内皮细胞损伤后，可使内皮素1分泌增加，血管内皮衍生松驰因子(EDRF)及前列环素分泌减少，导致患者血管舒、缩因子平衡紊乱，从而引发妊高征。
, 百拇医药
综上所述，携带有MTHFR基因C677T多态的孕妇易于发生同型半胱氨酸血症，进而导致妊高征，这一发现可能为寻找妊高征的病因和防治方法提供重要的生理、病理学线索。
作者单位：李克深(哈尔滨，解放军第二一一医院全军优生优育中心 150080)
孙延芝(哈尔滨，解放军第二一一医院全军优生优育中心 150080)
陈黎明(哈尔滨，解放军第二一一医院全军优生优育中心 150080)
张贵寅 李璞(哈尔滨医科大学医学遗传研究室)
参考文献
1，汪希鹏，林其德.妊高征的遗传学研究.中华妇产科杂志，1998，33：635-637.
, 百拇医药
2，Sohda S, Arinami T, Hamada H, et al. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and preeclampsia. J Med Genet, 1997, 34: 525-526.
3，Goyette P, Summer JS, Milos R, et al. Human methylenetetr- ahydrofolate reductase: isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat Genet, 1994, 7: 195-200.
4，林其德.妊高征病因学研究的进展.中华妇产科杂志，1997，32：3-4.
5，乐杰，主编.妇产科学.第4版.北京：人民卫生出版社，1996.113-119.
, 百拇医药
6，Goyette P, Frosst P, Darid SR, et al. Seven novel mutation in the MTHFR gene and genotype/phenotype correlations in severe methy- lenetetrahydrofolate reductase deficiency. Am J Hum Genet, 1995, 56: 1052-1059.
7，McCully KS. Homocysteine and vascular disease. Nat Med, 1996, 2: 386-389.
8，王玉芳.同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的机制.中国动脉硬化杂志，1998，6：259-263., 百拇医药
李克深 孙延芝 陈黎明 张贵寅 李璞
摘要 目的：探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C 677T多态性及血浆同型半胱氨酸水平与妊娠高血压综合征(妊高征)的关系。 方法：采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态分析法对62例妊高征患者(妊高征组)及90例正常孕妇(对照组)进行MTHFR基因C677T等位基因检测，并同时用高效液相色谱法测量两组孕妇血浆中的同型半胱氨酸水平。 结果：妊高征组纯合变异型T 677/T 677频率为0.27，T 677等位基因频率为0.52，明显高于对照组的0.13与0.31(P<0.05，P<0.01)，妊高征组同型半胱氨酸水平为(9.62±2.11) μmol/L，也明显高于对照组的(6.85±1.98) μmol/L(P<0.01)。结论：MTHFR基因C 677T多态是妊高征发病的遗传危险因素之一，它可以导致孕妇血液中同型半胱氨水平升高而引发妊高征。
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关键词：胺氧化还原酶类 半胱氨酸 妊娠并发症，心血管 高血压
近年来，运用分子生物学方法寻找妊娠高血压综合征(妊高征)易感基因成为研究该病病因的热点[1]，国外的研究发现，亚甲基四氢叶酸还原酶(meth- ylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因与妊高征发病关系密切[2]。MTHFR基因位于染色体1p36.3[3]。文献报道，如果MTHFR基因677位碱基C被T置换，则丙氨酸(Ala)被缬氨酸(Val)替换，MTHFR酶活性降低，易造成同型半胱氨酸(homo- cysteine, Hcy)血症，导致血管内皮细胞损伤，从而引起妊高征[4]。我们的研究旨在探讨妊高征患者MTHFR基因C 677T多态频率及血液中的同型半胱氨酸水平变化，为寻找妊高征的病因及防治方法提供依据。
资料与方法
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一、研究对象
妊高征组共62例，年龄22～38岁，平均(27.8±3.4)岁，孕周35～41周，平均(38.4±2.4)周。均按乐杰主编的《妇产科学》(第4版)提出的标准[5]筛选。对照组共90例，均为随机选取的与妊高征组同期分娩的正常健康孕妇，平均年龄(26.8±1.8)岁，平均孕周(39.2±1.4)周。
二、方法
1.MTHFR等位基因检测：(1)人基因组DNA的抽提：抽取孕妇外周静脉血3～5 ml，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝，用常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。(2)聚合酶链反应(PCR)扩增：PCR引物：P1：5′-GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3′ P2：5′-CCCATGTCGGTGCATGCCTT-3′。反应体系为30 μl，包括模板DNA 200 ng，P1和P2各1 μl(6 pmol/L)，4×dNTP1.5 μl(2.5 mol/L)，10倍缓冲液3 μl，Taq DNA聚合酶1.5 U。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。(3)酶切及电泳：酶切体系20 μl，其中包括PCR产物10 μl，Taq I内切酶0.2 μl(10 U/μl)，10×酶切缓冲液2 μl，H2O 7.8 μl，65℃温育12 h。消化产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶上150V电泳3 h，银染照相，根据PCR产物酶切后的长度变化读取基因型。
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2.血液中同型半胱氨酸水平测定：取受试者静脉血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝，置于冰浴上，30 min内2 500 r/min离心10 min，用一支吸管小心吸取上层血清，-80℃冻存，直至检测。Hcy浓度的检测采用高效液相色谱(LC-6A，日本岛津公司产品)结合荧光检测法进行测量，D、L同型半胱氨酸标准品购于美国Sigma公司。
三、统计学处理
Hcy测定结果用(x±s)表示，采用t检验，等位基因分型结果采用χ2检验。
结果
一、MTHFR等位基因分型结果
妊高征组中T677/T677基因型为17例，C677/T677基因型为31例，C677/C677基因型为14例；而对照组中T677/T677基因型为12例，C677/T677基因型为32例，C677/C677基因型为46例。妊高征组T677/T677基因型频率(0.27)显著高于对照组(0.13)(P<0.05)。妊高征组中T677等位基因频率(0.52)，也显著高于对照组(0.31)(P<0.01)。见表1。
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表1 两组孕妇MTHFR基因型与等位基因频率
组
别
总
例
数
基因型
等位基因
T677/T677
T677/C677
C677/C677
T
C
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例数
频率
(%)
例数
频率
(%)
例数
频率
(%)
个数
频率
(%)
个数
频率
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妊高征组
62
17
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对照组
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90
12
13
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36
46
51
56
31
124
69
二、同型半胱氨酸水平测定
妊高征组Hcy平均值为(9.6±2.1) μmol/L，而对照组Hcy平均值为(6.9±2.0) μmol/L，两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。妊高征组MTHFR基因无论是纯合子突变型还是杂合子基因型血浆Hcy水平，均显著高于正常纯合子基因型；对照组中只有纯合子突变型的Hcy水平显著高于正常纯合子基因型，见表2。表2 不同MTHFR基因型孕妇血浆Hcy水平比较(μmol/L,x±s)
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组别
总
例数
基因型
T677/T677
T677/C677
C677/C677
妊高征组
62
12.8±3.3
9.4±2.1
6.2±2.3
对照组
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90
9.8±2.1
7.0±1.8
6.0±2.7
讨论 一、MTHFR与Hcy代谢
导致血液中Hcy水平升高的原因有饮食及遗传两方面，饮食的原因主要是由于叶酸或维生素B12缺乏造成的；遗传的因素包括胱硫醚β合成酶缺乏或MTHFR活性降低。Hcy是一种含硫的氨基酸，由蛋氨酸通过蛋氨酸循环产生，产生后主要有两条去路，一条是在胱硫醚β合成酶的作用下生成α酮戊二酸退出蛋氨酸循环，如果胱硫醚β合成酶缺乏将会造成Hcy的堆积，但是已有的研究认为，这种情况并不多见；另一条去路是在甲基转移酶和维生素B12的作用下，由5-甲基四氢叶酸提供甲基，重新生成蛋氨酸。5-甲基四氢叶酸是由5，10-亚甲基四氢叶酸在MTHFR的作用下生成的，如果缺乏或活性降低也将造成Hcy的堆积。MTHFR基因由Goyette等[3]于1994年首次克隆成功，之后发现MTHFR基因的一个常见的多态C 677T，会导致MTHFR活性降低，使同型半胱氨酸向蛋氨酸的转化出现障碍，造成血液中同型半胱氨酸浓度上升[6]。高浓度的同型半胱氨酸将导致血管内皮细胞损伤[7]，可能是心血管疾病及妊高征的诱因之一。
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二、MTHFR基因多态与妊高征的关系
本研究结果显示，妊高征组T 677/T 677基因型频率及T 677等位基因频率均显著高于对照组，与日本学者Sohda等[2]所报道的数据相近，提示MTHFR基因C 677T多态可能是妊高征发病的一个遗传危险因素，但其并未对患者血液中的Hcy水平做具体检测。我们则在检测基因型的同时检测血中的Hcy水平，以具体观察MTHFR不同基因型对血液中Hcy水平的影响。Hcy的检测结果证实了我们的推测，妊高征组Hcy平均值明显高于对照组，而且MTHFR不同基因型对血浆Hcy水平有显著影响，两组中T677/T677基因型的Hcy水平均显著高于C677/C677基因型的Hcy水平，这说明MTHFR基因C677T多态使MTHFR活性降低，以至Hcy不能顺利转化为蛋氨酸，Hcy在血液中蓄积，使血液中的Hcy水平出现升高现象，同型半胱氨酸可在金属离子介导下自身氧化生成过氧化物及氧自由基，损伤内皮细胞的结构和功能[8]，血管内皮细胞损伤后，可使内皮素1分泌增加，血管内皮衍生松驰因子(EDRF)及前列环素分泌减少，导致患者血管舒、缩因子平衡紊乱，从而引发妊高征。
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综上所述，携带有MTHFR基因C677T多态的孕妇易于发生同型半胱氨酸血症，进而导致妊高征，这一发现可能为寻找妊高征的病因和防治方法提供重要的生理、病理学线索。
作者单位：李克深(哈尔滨，解放军第二一一医院全军优生优育中心 150080)
孙延芝(哈尔滨，解放军第二一一医院全军优生优育中心 150080)
陈黎明(哈尔滨，解放军第二一一医院全军优生优育中心 150080)
张贵寅 李璞(哈尔滨医科大学医学遗传研究室)
参考文献
1，汪希鹏，林其德.妊高征的遗传学研究.中华妇产科杂志，1998，33：635-637.
, 百拇医药
2，Sohda S, Arinami T, Hamada H, et al. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and preeclampsia. J Med Genet, 1997, 34: 525-526.
3，Goyette P, Summer JS, Milos R, et al. Human methylenetetr- ahydrofolate reductase: isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat Genet, 1994, 7: 195-200.
4，林其德.妊高征病因学研究的进展.中华妇产科杂志，1997，32：3-4.
5，乐杰，主编.妇产科学.第4版.北京：人民卫生出版社，1996.113-119.
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6，Goyette P, Frosst P, Darid SR, et al. Seven novel mutation in the MTHFR gene and genotype/phenotype correlations in severe methy- lenetetrahydrofolate reductase deficiency. Am J Hum Genet, 1995, 56: 1052-1059.
7，McCully KS. Homocysteine and vascular disease. Nat Med, 1996, 2: 386-389.
8，王玉芳.同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的机制.中国动脉硬化杂志，1998，6：259-263., 百拇医药