氧自由基在肝脏保存再灌注损伤中的作用及丹参的保护作用
赵浩亮 武小勇 李士骏 陈孝平 裘法祖
摘 要 目的 探讨氧自由基在肝脏保存再灌注损伤(hepatic preservation reperfusion injury,HPRI)中的作用及丹参的保护作用。方法 建立大鼠肝脏保存再灌注模型，分别检测肝脏保存0、8、16、24、32 h组在不同灌注时间点组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和灌注液谷草转氨酸(AST)的变化，并观察肝细胞形态学的改变。结果 与正常组(保存0 h组)比较，保存16、24、32 h组不同再灌注时点SOD显著降低(P<0.05)，而MDA和AST均明显升高(P<0.05)，肝细胞形态也发生异常改变；应用丹参组，SOD则明显升高，MDA和AST明显下降，与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。结论 氧自由基是导致HPRI的重要因素，丹参能清除氧自由基，可以减轻HPRI。
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关键词：氧自由基 肝脏 保存再灌注损伤 丹参
肝脏保存再灌注损伤(hepatic preservation reperfusion injury, HPRI)是影响肝移植效果的重要因素，氧自由基损伤可能是HPRI的重要机制之一。我们采用离体大鼠肝脏保存再灌注模型，观察肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的变化，并观察肝功能和肝细胞形态学变化，了解丹参对上述指标的影响，探讨丹参抗HPRI的机理。 材料和方法
1.动物模型及分组：健康Wistar雄性大鼠54只(购自北京医科大学动物中心)。体重200～250 g，随机分组，每组6只。动物禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg体重施行麻醉，“十”字切口进腹，分离切断肝脏周围韧带，解剖肝门，经下腔静脉注入肝素50 U，游离门静脉、胆总管和肝上下腔静脉，分别插管，右肾静脉平面上结扎切断肝下下腔静脉，经门静脉原位灌注1 ℃乳酸林格液20 ml，灌注压为18 cm H2O (1 cm H2O=0.098 kPa)，迅速切除肝脏。(1)正常组：(保存0 h组，6只)，切除肝脏后不保存，采用Clavien等[1]的方法，立即与灌注系统连接，行离体鼠肝循环再灌注(IPRL)，灌注液为自制KH平衡液，加入新鲜洗涤人红细胞(红细胞比容为15%)，充100%纯氧，灌注速度为1 ml.min-1.g-1，压力为18～20 cm H2O，灌注温度控制为37 ℃，灌注时间为60 min。(2)对照组：(Belzer UW液保存组，各6只)。Belzer UW保存液购自美国Dupont pharma公司。切除肝脏后置入4 ℃ UW液中保存8、16、24和32 h，保存结束后行IPRL。灌注方法同正常组。(3)实验组：切除肝脏后置入含丹参(15 g/L)的4 ℃ UW液中保存8、16、24和32 h(各6只)，保存结束后用含丹参(7.5 g/L)的KH液行IPRL，灌注方法同正常组(丹参购自上海第一制药厂，批号980702)。各组分别于再灌注10、30和60 min，采集灌注流出液2 ml，备好用于肝功能测定，IPRL结束后取肝左叶组织100 mg制成匀浆，测定氧自由基，另取少许肝左中叶组织行光镜电镜观察。
, 百拇医药
2.观测指标与方法：(1)肝灌注流出液谷草转氨酶(AST)测定：采用赖氏法。(2)肝组织SOD测定：采用黄嘌呤氧化酶法。(3)肝组织MDA测定：采用改良的八木国夫法。(4)肝组织光镜与电镜观察。
3.统计学处理：数据均以均数±标准差(X±s)表示，采用t检验判断差异显著性。
结 果
1.不同保存灌注时间下各组灌流液AST含量变化：见表1。
表1 各组大鼠肝灌流液AST含量变化(U/L,X±s)
组别
10 min
30 min
60 min
, 百拇医药
正常组(保存0 h)
24.88±
3.45
29.01±
3.35
31.17±
3.88
保存8 h组
对照组
27.06±
3.96
28.95±
4.17
, 百拇医药
32.09±
3.60
实验组
24.13±
4.56
26.66±
3.91
28.62±
4.61
保存16 h组
对照组
79.02±
3.97Δ
, http://www.100md.com
89.84±
2.73Δ
109.73±
4.31Δ
实验组
35.26±
2.95Δ*
74.24±
2.96Δ*
91.69±
2.88Δ*
, http://www.100md.com
保存24 h组
对照组
94.29±
3.34Δ
140.34±
3.30Δ
180.74±
3.22Δ
实验组
70.63±
2.39Δ *
, 百拇医药 91.79±
2.96Δ *
109.37±
2.44Δ *
保存32 h组
对照组
105.38±
4.60Δ
164.03±
8.59Δ
201.04±
, http://www.100md.com 9.01Δ
实验组
74.36±
5.67Δ *
95.27±
3.80Δ *
110.83±
3.96Δ *
注：与正常组比较，ΔP<0.05；与对照组相同时间点比较，*P<0.05
2.不同保存灌注时间下各组肝组织SOD和MDA含量的变化：见表2。
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3.肝细胞形态学改变：光镜下可见：正常组和保存8 h组肝细胞形态基本正常，对照组保存16 h组肝细胞出现肿胀、脂肪变性、空泡变性及点状坏死，而且随肝保存时间延长，肝细胞肿胀、变性和坏死的程度和范围加重。应用丹参组则表现散在肝细胞肿胀、变性及点状坏死，其程度和范围均明显轻于对照组。电镜下可见正常组和保存8 h组肝细胞超微结构基本正常，对照组保存16 h组出现线粒体和内质网肿胀，毛细胆管内微绒毛变少，随肝保存时间延长，微绒毛形态异常，数量稀少，线粒体和内质网肿胀加重。应用丹参组毛细胆管的微绒毛形态和数量基本正常，线粒体和内质网肿胀程度和范围均显著轻于对照组。
表2 各组大鼠肝组织SOD和MDA含量的变化(X±s)
组 别
SOD(U/g)
MDA(μmol/g)
, 百拇医药
对照组(保存0 h)
12.638±0.434
0.496±0.019
保存8 h组
对照组
10.625±1.433
0.587±0.074
实验组
11.743±1.679
0.424±0.064
保存16 h组
对照组
, 百拇医药
7.521±1.699Δ
0.892±0.056Δ
实验组
9.680±1.032Δ*
0.618±0.059Δ*
保存24 h组
对照组
3.759±0.668Δ
1.076±0.038Δ
实验组
, 百拇医药
5.613±0.774Δ *
0.978±0.130Δ *
保存32 h组
对照组
1.344±0.332Δ
3.257±0.025Δ
实验组
2.877±0.504Δ *
2.314±0.489Δ *
注：与正常组比较，ΔP<0.05；与对照组相同时间点比较，*P<0.05讨 论
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本实验结果显示，随肝脏保存和再灌注时间延长，肝组织SOD活性显著下降，MDA水平明显增高，同时伴随肝灌流液中AST含量的进行性增高及肝组织学和超微结构的异常变化。这些都表明肝保存再灌注时氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，氧自由基大量生成而清除减少，体内氧自由基水平升高，从而引起脂质过氧化反应，进一步导致HPRI。丹参对肝脏低温保存再灌注的影响，报道较少，本实验结果显示，在肝脏保存再灌注液中加入丹参，能使肝组织SOD活性明显升高，而MDA含量显著下降，同时伴有AST含量下降和肝细胞形态异常程度的减轻，提示丹参有明显的抗HPRI的作用，其作用机制为增加内源性SOD活性，有效清除氧自由基，减低肝组织脂质过氧化反应。
作者单位：赵浩亮(030001太原，山西医科大学第一医院外科)
武小勇(030001太原，山西医科大学第一医院外科)
李士骏(030001太原，山西医科大学第一医院外科)
陈孝平(同济医科大学附属同济医院外科)
裘法祖(同济医科大学附属同济医院外科)
参考文献
[1]Clavien PA, Harvey PRC, Sanabria JR, et al. Lymphocyte adherence in the reperfused rat liver allograft mechanisms and effects. Hepatology, 1993,17:131-142., 百拇医药
摘 要 目的 探讨氧自由基在肝脏保存再灌注损伤(hepatic preservation reperfusion injury,HPRI)中的作用及丹参的保护作用。方法 建立大鼠肝脏保存再灌注模型，分别检测肝脏保存0、8、16、24、32 h组在不同灌注时间点组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和灌注液谷草转氨酸(AST)的变化，并观察肝细胞形态学的改变。结果 与正常组(保存0 h组)比较，保存16、24、32 h组不同再灌注时点SOD显著降低(P<0.05)，而MDA和AST均明显升高(P<0.05)，肝细胞形态也发生异常改变；应用丹参组，SOD则明显升高，MDA和AST明显下降，与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。结论 氧自由基是导致HPRI的重要因素，丹参能清除氧自由基，可以减轻HPRI。
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关键词：氧自由基 肝脏 保存再灌注损伤 丹参
肝脏保存再灌注损伤(hepatic preservation reperfusion injury, HPRI)是影响肝移植效果的重要因素，氧自由基损伤可能是HPRI的重要机制之一。我们采用离体大鼠肝脏保存再灌注模型，观察肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的变化，并观察肝功能和肝细胞形态学变化，了解丹参对上述指标的影响，探讨丹参抗HPRI的机理。 材料和方法
1.动物模型及分组：健康Wistar雄性大鼠54只(购自北京医科大学动物中心)。体重200～250 g，随机分组，每组6只。动物禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg体重施行麻醉，“十”字切口进腹，分离切断肝脏周围韧带，解剖肝门，经下腔静脉注入肝素50 U，游离门静脉、胆总管和肝上下腔静脉，分别插管，右肾静脉平面上结扎切断肝下下腔静脉，经门静脉原位灌注1 ℃乳酸林格液20 ml，灌注压为18 cm H2O (1 cm H2O=0.098 kPa)，迅速切除肝脏。(1)正常组：(保存0 h组，6只)，切除肝脏后不保存，采用Clavien等[1]的方法，立即与灌注系统连接，行离体鼠肝循环再灌注(IPRL)，灌注液为自制KH平衡液，加入新鲜洗涤人红细胞(红细胞比容为15%)，充100%纯氧，灌注速度为1 ml.min-1.g-1，压力为18～20 cm H2O，灌注温度控制为37 ℃，灌注时间为60 min。(2)对照组：(Belzer UW液保存组，各6只)。Belzer UW保存液购自美国Dupont pharma公司。切除肝脏后置入4 ℃ UW液中保存8、16、24和32 h，保存结束后行IPRL。灌注方法同正常组。(3)实验组：切除肝脏后置入含丹参(15 g/L)的4 ℃ UW液中保存8、16、24和32 h(各6只)，保存结束后用含丹参(7.5 g/L)的KH液行IPRL，灌注方法同正常组(丹参购自上海第一制药厂，批号980702)。各组分别于再灌注10、30和60 min，采集灌注流出液2 ml，备好用于肝功能测定，IPRL结束后取肝左叶组织100 mg制成匀浆，测定氧自由基，另取少许肝左中叶组织行光镜电镜观察。
, 百拇医药
2.观测指标与方法：(1)肝灌注流出液谷草转氨酶(AST)测定：采用赖氏法。(2)肝组织SOD测定：采用黄嘌呤氧化酶法。(3)肝组织MDA测定：采用改良的八木国夫法。(4)肝组织光镜与电镜观察。
3.统计学处理：数据均以均数±标准差(X±s)表示，采用t检验判断差异显著性。
结 果
1.不同保存灌注时间下各组灌流液AST含量变化：见表1。
表1 各组大鼠肝灌流液AST含量变化(U/L,X±s)
组别
10 min
30 min
60 min
, 百拇医药
正常组(保存0 h)
24.88±
3.45
29.01±
3.35
31.17±
3.88
保存8 h组
对照组
27.06±
3.96
28.95±
4.17
, 百拇医药
32.09±
3.60
实验组
24.13±
4.56
26.66±
3.91
28.62±
4.61
保存16 h组
对照组
79.02±
3.97Δ
, http://www.100md.com
89.84±
2.73Δ
109.73±
4.31Δ
实验组
35.26±
2.95Δ*
74.24±
2.96Δ*
91.69±
2.88Δ*
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保存24 h组
对照组
94.29±
3.34Δ
140.34±
3.30Δ
180.74±
3.22Δ
实验组
70.63±
2.39Δ *
, 百拇医药 91.79±
2.96Δ *
109.37±
2.44Δ *
保存32 h组
对照组
105.38±
4.60Δ
164.03±
8.59Δ
201.04±
, http://www.100md.com 9.01Δ
实验组
74.36±
5.67Δ *
95.27±
3.80Δ *
110.83±
3.96Δ *
注：与正常组比较，ΔP<0.05；与对照组相同时间点比较，*P<0.05
2.不同保存灌注时间下各组肝组织SOD和MDA含量的变化：见表2。
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3.肝细胞形态学改变：光镜下可见：正常组和保存8 h组肝细胞形态基本正常，对照组保存16 h组肝细胞出现肿胀、脂肪变性、空泡变性及点状坏死，而且随肝保存时间延长，肝细胞肿胀、变性和坏死的程度和范围加重。应用丹参组则表现散在肝细胞肿胀、变性及点状坏死，其程度和范围均明显轻于对照组。电镜下可见正常组和保存8 h组肝细胞超微结构基本正常，对照组保存16 h组出现线粒体和内质网肿胀，毛细胆管内微绒毛变少，随肝保存时间延长，微绒毛形态异常，数量稀少，线粒体和内质网肿胀加重。应用丹参组毛细胆管的微绒毛形态和数量基本正常，线粒体和内质网肿胀程度和范围均显著轻于对照组。
表2 各组大鼠肝组织SOD和MDA含量的变化(X±s)
组 别
SOD(U/g)
MDA(μmol/g)
, 百拇医药
对照组(保存0 h)
12.638±0.434
0.496±0.019
保存8 h组
对照组
10.625±1.433
0.587±0.074
实验组
11.743±1.679
0.424±0.064
保存16 h组
对照组
, 百拇医药
7.521±1.699Δ
0.892±0.056Δ
实验组
9.680±1.032Δ*
0.618±0.059Δ*
保存24 h组
对照组
3.759±0.668Δ
1.076±0.038Δ
实验组
, 百拇医药
5.613±0.774Δ *
0.978±0.130Δ *
保存32 h组
对照组
1.344±0.332Δ
3.257±0.025Δ
实验组
2.877±0.504Δ *
2.314±0.489Δ *
注：与正常组比较，ΔP<0.05；与对照组相同时间点比较，*P<0.05讨 论
, http://www.100md.com
本实验结果显示，随肝脏保存和再灌注时间延长，肝组织SOD活性显著下降，MDA水平明显增高，同时伴随肝灌流液中AST含量的进行性增高及肝组织学和超微结构的异常变化。这些都表明肝保存再灌注时氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，氧自由基大量生成而清除减少，体内氧自由基水平升高，从而引起脂质过氧化反应，进一步导致HPRI。丹参对肝脏低温保存再灌注的影响，报道较少，本实验结果显示，在肝脏保存再灌注液中加入丹参，能使肝组织SOD活性明显升高，而MDA含量显著下降，同时伴有AST含量下降和肝细胞形态异常程度的减轻，提示丹参有明显的抗HPRI的作用，其作用机制为增加内源性SOD活性，有效清除氧自由基，减低肝组织脂质过氧化反应。
作者单位：赵浩亮(030001太原，山西医科大学第一医院外科)
武小勇(030001太原，山西医科大学第一医院外科)
李士骏(030001太原，山西医科大学第一医院外科)
陈孝平(同济医科大学附属同济医院外科)
裘法祖(同济医科大学附属同济医院外科)
参考文献
[1]Clavien PA, Harvey PRC, Sanabria JR, et al. Lymphocyte adherence in the reperfused rat liver allograft mechanisms and effects. Hepatology, 1993,17:131-142., 百拇医药