丙肝病毒基因在肝门部胆管癌组织中的表达及其意义
陈汝福 邹声泉 赵西平
摘 要 目的 探讨丙肝病毒核糖核酸(HCV RNA)及蛋白在肝门部胆管癌组织中的表达及其生物学意义。方法 应用套式逆转录-多聚酶链反应(nested RT-PCR)和免疫组织化学技术检测36例肝门部胆管癌患者癌组织和癌旁组织中HCV RNA、非结构蛋白(NS5)蛋白水平的表达。结果 36例肝门部胆管癌患者癌组织和癌旁组织中HCV RNA和NS5蛋白阳性表达率为83.3%(30/36)、47.2%(17/36)，2种组织间的差异有非常显著性(P<0.01)。癌组织和癌旁组织中NS5蛋白阳性表达率分别为36.1%(13/36)、22.2%(8/36)，2种组织间差异无显著性(P>0.05)。HCV RNA阳性表达与肝门部胆管癌的发生部位、病理类型、分化程度、有无转移、丙氨酸转移酶(ALT)高低以及有无输血史、乙型肝炎表面抗原阳性[HBsAg(+)]、肝硬化、黄疸等无关(P>0.05)，仅与是否伴有血清抗HCV阳性有关(P<0.05)。结论 肝门部胆管癌组织中有HCV基因及其产物的高表达，HCV感染与肝门部胆管癌发生有关。
, http://www.100md.com
关键词：肝门部胆管癌 丙肝病毒RNA NS5蛋白 套式逆转录-多聚酶链反应
为了探讨丙肝病毒(HCV)对肝门部胆管癌发生发展中的作用，我们对36例肝门部胆管癌组织中的丙肝病毒核糖核酸(HCV RNA)及非结构蛋白(NS5蛋白)进行了检测，现报道如下。 材料与方法
1.病例及组织标本：收集同济医院、山东省肿瘤医院、桂林医学院附属医院1996年9月～1998年12月收治的肝门部胆管癌患者36例，其中男26例，女10例，年龄38～73岁。Bismuth分型为Ⅰ型14例，Ⅱ型10例，Ⅲ型8例，Ⅳ型4例；≥2 cm 26例，<2 cm 10例。组织学检查：管状腺癌16例，乳头状腺癌12例，未分化癌6例，粘液癌2例；分化程度：高分化15例，中分化8例，低分化13例。有淋巴结转移占55.6%(20/36)，有输血史者占83.3%(30/36)，血清抗-HCV(+)占38.9%(14/36)，HBsAg(+)者占27.9%(10/36)，合并肝硬化占25.0%(9/36)，合并丙氨酸转氨酶(ALT)升高者占33.3%(12/36)，黄疸者41.8%(15/36)。术后切除的标本分成两部分，一部分肿瘤和癌旁组织立即投入液氮中，-80 ℃保存备用；另一部分行福马林固定，石蜡包埋后制成4 μm厚连续切片，备检。
, 百拇医药
2.HCV RNA的检测：用异硫氰酸胍一步法抽提组织中总RNA，总RNA经紫外线分光光度定量，琼脂糖凝胶电泳鉴定。逆转录酶、RNasin、三磷酸脱氧核苷混合物(dNTPs)及Taq脱氧核糖核酸聚合酶购自Promega公司，引物由上海生物工程公司合成。HCV引物序列C1：5′-ACTCCACCATAGATCACCC-3′;C2：5′-AACACTACTCGGCTAGCAGT-3′；C3：5′-TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3′；C4:5′-GTTGATCCAAGAAAGGACCC-3′。C1、C2为外引物，C3、C4为内引物。取3 μg RNA用于逆转录。20 μl反应体系包括：C1、C2各0.5 mol/L，dNTPs 0.5 μmol/L, AMV 5 U,RNasin 5 U,核酸10 U，buffer 4 μl，42 ℃ 1 h, 95 ℃ 5 min。第1次聚合酶链反应(PCR)，逆转录产物10 μl，总体积50 μl，94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，30个循环。第2次PCR包括第1次PCR产物5 μl，总体积50 μl，程序同上。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线检测仪观察出现145 bp DNA扩增带HCV RNA阳性。
, http://www.100md.com
3.HCV NS5抗原检测：双过氧化物酶-抗过氧化物酶(双PAP)法检测肝门部胆管癌组织中的HCV NS5蛋白的表达。鼠抗-HCV NS5单克隆由北京医科大学肝病研究所制备。细胞浆中出现棕黄色颗粒为HCV NS5阳性。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)分别代替一抗和二抗。
4.统计学方法：χ2检验和精确概率法。
结 果
1.HCV RNA在肝门部胆管癌组织及癌旁组织中的表达：36例肝门部胆管癌患者癌组织中HCV RNA阳性表达率为83.3%(30/36)，癌旁组织中HCV RNA阳性表达率为47.2%(17/36)，2种组织间的差异有非常显著性(P<0.01)。
2.HCV NS5在肝门部胆管癌组织及癌旁组织中的表达及分布：16例肝门部胆管癌NS5蛋白阳性标本中，阳性细胞可呈散在、弥漫状分布于部分癌巢和(或)癌旁组织中。其中8例只存在于癌细胞中，3例只于癌旁组织中检出，另5例癌旁及癌组织中均呈阳性。NS5在癌组织和癌旁组织间的表达差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3.HCV RNA表达与肝门部胆管癌血清中抗-HCV的关系：36例肝门部胆管癌患者癌组织中HCV RNA阳性表达率为83.3%(30/36)，而血清中抗-HCV(+)仅为38.89%(14/36)，HCV RNA表达与胆管癌血清中抗-HCV(+)密切相关(P<0.05)。
4.HCV RNA表达与肝门部胆管癌临床病理类型关系：HCV RNA表达与肝门部胆管癌临床分期、病理类型、分化程度、有无转移、有无伴发黄疸、ALT升高、有无输血史、HBsAg(+)、肝硬化等均无关(P>0.05)。
讨 论
我们采用nested RT-PCR先后用2种引物对5′端非编码区进行扩增，结果显示肝门部胆管癌组织中HCV RNA阳性表达率为83.3%，提示HCV在肝门部胆管细胞也有很高的感染率，同时该方法对确定有无活动性感染也有较大价值，是确定有无HCV感染比较敏感的方法之一。本研究结果表明，HCV在肝门部胆管细胞也有很高的感染率。虽然难以完全排除HCV感染发生在胆管细胞转化之后，但在本研究中，肝门部胆管癌组织中HCV NS5阳性率为36.1%，其周围癌旁组织中也有HCV NS5表达，提示持久的病毒表达在胆管细胞转化的发生中起一定的作用。王春杰等[1]研究发现，HCV核心抗原在肝内胆管癌胞浆胞核中阳性率为87.8%，认为HCV核心抗原可能通过影响细胞基因组的表达调控进而影响细胞增殖。但是肝门部胆管癌是否与肝细胞癌或肝内胆管细胞癌发病机理相同，目前难以定论。本组研究结果表明，HCV RNA表达与肝门部胆管癌分化程度、转移以及有无输血史等无关，间接提示HCV感染仅与肝门部胆管癌的发生有关。此外，本实验结果显示，肝门部胆管癌患者癌组织中HCV RNA阳性率明显高于血清中抗-HCV(+)，HCV RNA表达与胆管癌血清中抗-HCV(+)密切相关，但与患者有无输血史无关，这表明循环中的HCV病毒颗粒主要是从肝门部胆管癌组织中释放入血液中。因此，肝门部胆管组织中HCV基因的含量和表达率高于血液中，但从本研究难以判断HCV的感染途径。HCV导致肝门部胆管癌具体机制和意义有待进一步研究。
作者单位：陈汝福(430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科)
邹声泉(430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科)
赵西平(临床免疫室)
参考文献
[1]王春杰，王文亮，王伯云.丙型肝炎病毒C33c抗原、核心抗原和HBxAg在人原发性肝内胆管细胞癌中的分布及意义.第四军医大学学报，1996，17：241-244., http://www.100md.com
摘 要 目的 探讨丙肝病毒核糖核酸(HCV RNA)及蛋白在肝门部胆管癌组织中的表达及其生物学意义。方法 应用套式逆转录-多聚酶链反应(nested RT-PCR)和免疫组织化学技术检测36例肝门部胆管癌患者癌组织和癌旁组织中HCV RNA、非结构蛋白(NS5)蛋白水平的表达。结果 36例肝门部胆管癌患者癌组织和癌旁组织中HCV RNA和NS5蛋白阳性表达率为83.3%(30/36)、47.2%(17/36)，2种组织间的差异有非常显著性(P<0.01)。癌组织和癌旁组织中NS5蛋白阳性表达率分别为36.1%(13/36)、22.2%(8/36)，2种组织间差异无显著性(P>0.05)。HCV RNA阳性表达与肝门部胆管癌的发生部位、病理类型、分化程度、有无转移、丙氨酸转移酶(ALT)高低以及有无输血史、乙型肝炎表面抗原阳性[HBsAg(+)]、肝硬化、黄疸等无关(P>0.05)，仅与是否伴有血清抗HCV阳性有关(P<0.05)。结论 肝门部胆管癌组织中有HCV基因及其产物的高表达，HCV感染与肝门部胆管癌发生有关。
, http://www.100md.com
关键词：肝门部胆管癌 丙肝病毒RNA NS5蛋白 套式逆转录-多聚酶链反应
为了探讨丙肝病毒(HCV)对肝门部胆管癌发生发展中的作用，我们对36例肝门部胆管癌组织中的丙肝病毒核糖核酸(HCV RNA)及非结构蛋白(NS5蛋白)进行了检测，现报道如下。 材料与方法
1.病例及组织标本：收集同济医院、山东省肿瘤医院、桂林医学院附属医院1996年9月～1998年12月收治的肝门部胆管癌患者36例，其中男26例，女10例，年龄38～73岁。Bismuth分型为Ⅰ型14例，Ⅱ型10例，Ⅲ型8例，Ⅳ型4例；≥2 cm 26例，<2 cm 10例。组织学检查：管状腺癌16例，乳头状腺癌12例，未分化癌6例，粘液癌2例；分化程度：高分化15例，中分化8例，低分化13例。有淋巴结转移占55.6%(20/36)，有输血史者占83.3%(30/36)，血清抗-HCV(+)占38.9%(14/36)，HBsAg(+)者占27.9%(10/36)，合并肝硬化占25.0%(9/36)，合并丙氨酸转氨酶(ALT)升高者占33.3%(12/36)，黄疸者41.8%(15/36)。术后切除的标本分成两部分，一部分肿瘤和癌旁组织立即投入液氮中，-80 ℃保存备用；另一部分行福马林固定，石蜡包埋后制成4 μm厚连续切片，备检。
, 百拇医药
2.HCV RNA的检测：用异硫氰酸胍一步法抽提组织中总RNA，总RNA经紫外线分光光度定量，琼脂糖凝胶电泳鉴定。逆转录酶、RNasin、三磷酸脱氧核苷混合物(dNTPs)及Taq脱氧核糖核酸聚合酶购自Promega公司，引物由上海生物工程公司合成。HCV引物序列C1：5′-ACTCCACCATAGATCACCC-3′;C2：5′-AACACTACTCGGCTAGCAGT-3′；C3：5′-TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3′；C4:5′-GTTGATCCAAGAAAGGACCC-3′。C1、C2为外引物，C3、C4为内引物。取3 μg RNA用于逆转录。20 μl反应体系包括：C1、C2各0.5 mol/L，dNTPs 0.5 μmol/L, AMV 5 U,RNasin 5 U,核酸10 U，buffer 4 μl，42 ℃ 1 h, 95 ℃ 5 min。第1次聚合酶链反应(PCR)，逆转录产物10 μl，总体积50 μl，94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，30个循环。第2次PCR包括第1次PCR产物5 μl，总体积50 μl，程序同上。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线检测仪观察出现145 bp DNA扩增带HCV RNA阳性。
, http://www.100md.com
3.HCV NS5抗原检测：双过氧化物酶-抗过氧化物酶(双PAP)法检测肝门部胆管癌组织中的HCV NS5蛋白的表达。鼠抗-HCV NS5单克隆由北京医科大学肝病研究所制备。细胞浆中出现棕黄色颗粒为HCV NS5阳性。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)分别代替一抗和二抗。
4.统计学方法：χ2检验和精确概率法。
结 果
1.HCV RNA在肝门部胆管癌组织及癌旁组织中的表达：36例肝门部胆管癌患者癌组织中HCV RNA阳性表达率为83.3%(30/36)，癌旁组织中HCV RNA阳性表达率为47.2%(17/36)，2种组织间的差异有非常显著性(P<0.01)。
2.HCV NS5在肝门部胆管癌组织及癌旁组织中的表达及分布：16例肝门部胆管癌NS5蛋白阳性标本中，阳性细胞可呈散在、弥漫状分布于部分癌巢和(或)癌旁组织中。其中8例只存在于癌细胞中，3例只于癌旁组织中检出，另5例癌旁及癌组织中均呈阳性。NS5在癌组织和癌旁组织间的表达差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3.HCV RNA表达与肝门部胆管癌血清中抗-HCV的关系：36例肝门部胆管癌患者癌组织中HCV RNA阳性表达率为83.3%(30/36)，而血清中抗-HCV(+)仅为38.89%(14/36)，HCV RNA表达与胆管癌血清中抗-HCV(+)密切相关(P<0.05)。
4.HCV RNA表达与肝门部胆管癌临床病理类型关系：HCV RNA表达与肝门部胆管癌临床分期、病理类型、分化程度、有无转移、有无伴发黄疸、ALT升高、有无输血史、HBsAg(+)、肝硬化等均无关(P>0.05)。
讨 论
我们采用nested RT-PCR先后用2种引物对5′端非编码区进行扩增，结果显示肝门部胆管癌组织中HCV RNA阳性表达率为83.3%，提示HCV在肝门部胆管细胞也有很高的感染率，同时该方法对确定有无活动性感染也有较大价值，是确定有无HCV感染比较敏感的方法之一。本研究结果表明，HCV在肝门部胆管细胞也有很高的感染率。虽然难以完全排除HCV感染发生在胆管细胞转化之后，但在本研究中，肝门部胆管癌组织中HCV NS5阳性率为36.1%，其周围癌旁组织中也有HCV NS5表达，提示持久的病毒表达在胆管细胞转化的发生中起一定的作用。王春杰等[1]研究发现，HCV核心抗原在肝内胆管癌胞浆胞核中阳性率为87.8%，认为HCV核心抗原可能通过影响细胞基因组的表达调控进而影响细胞增殖。但是肝门部胆管癌是否与肝细胞癌或肝内胆管细胞癌发病机理相同，目前难以定论。本组研究结果表明，HCV RNA表达与肝门部胆管癌分化程度、转移以及有无输血史等无关，间接提示HCV感染仅与肝门部胆管癌的发生有关。此外，本实验结果显示，肝门部胆管癌患者癌组织中HCV RNA阳性率明显高于血清中抗-HCV(+)，HCV RNA表达与胆管癌血清中抗-HCV(+)密切相关，但与患者有无输血史无关，这表明循环中的HCV病毒颗粒主要是从肝门部胆管癌组织中释放入血液中。因此，肝门部胆管组织中HCV基因的含量和表达率高于血液中，但从本研究难以判断HCV的感染途径。HCV导致肝门部胆管癌具体机制和意义有待进一步研究。
作者单位：陈汝福(430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科)
邹声泉(430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科)
赵西平(临床免疫室)
参考文献
[1]王春杰，王文亮，王伯云.丙型肝炎病毒C33c抗原、核心抗原和HBxAg在人原发性肝内胆管细胞癌中的分布及意义.第四军医大学学报，1996，17：241-244., http://www.100md.com