肾细胞癌中微血管密度与肿瘤细胞凋亡的关系
武玉东 董秀哲 魏金星 高建光 吴长利
摘 要 目的 探讨肾癌组织中微血管形成与肿瘤细胞凋亡的关系。方法 应用免疫组织化学方法对51例肾癌组织中血管内皮细胞的第Ⅷ因子抗原进行染色，并计数肿瘤的微血管；应用原位DNA片段末端标记法检测肾癌组织细胞凋亡状态。结果 肾细胞癌微血管密度在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤中分别为49.3±25.3、54.0±28.8、94.9±38.7；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中分别为45.2±21.2、68.5±32.6、99.5±43.7，其密度在肿瘤的临床分期及病理分级间差异具有显著性(P<0.05)。肾细胞癌微血管密度与肿瘤细胞的凋亡指数呈负相关(rs=-0.618，P<0.001)，但与肿瘤的Ki67标记指数无关(rs=0.096，P>0.05)。结论 在肾细胞癌发展过程中，微血管的形成可抑制肿瘤细胞的凋亡，而促进肿瘤的恶性进展。
, 百拇医药
关键词：肾肿瘤 癌 凋亡
最近有研究表明，肿瘤发展过程中微环境的改变可影响肿瘤细胞的凋亡状态[1]。为此，我们对肾细胞癌中微血管的形成与肿瘤细胞凋亡的关系进行研究，现将结果报道如下。材料与方法
1.标本来源：取来自本院及河南省平顶山市第一人民医院1994～1997年间经手术切除的肾癌组织标本51例，经病理证实为肾细胞癌。所有病例术前均未行化疗和放疗。标本经最佳切片温度溶液(OCT)包埋行4 μm厚连续冰冻切片。Furhman分级：Ⅰ级12例、Ⅱ级22例、Ⅲ级17例；Robson分期：Ⅰ期19例、Ⅱ期21例，Ⅲ期9例、Ⅳ期2例。
2.免疫组织化学染色：Ki67、第Ⅷ因子相关抗原(FⅧ-RAg)单克隆抗体均为Dako公司产品，ABC法免疫组织化学染色。切片加一抗FⅧ-RAg之前胰酶消化20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
3.Ki67标记指数(Ki67LI)和肿瘤微血管密度(IMVD)计数：为了保证肿瘤内IMVD计数的客观性和准确性，首先选取具有代表性的组织切片，排除肿瘤出血区及边缘反应区。低倍镜观察确定每例切片中3个血管密度最高区域，然后在高倍镜下，计数每个区域的IMVD，其平均值即为该例肿瘤的IMVD值。观察500个肿瘤细胞，记数其Ki67阳性细胞数，Ki67LI=Ki67阳性细胞数/观察肿瘤细胞数×100%。
4.原位DNA片段末端标记(TUNEL法)：原位细胞凋亡检测试剂盒为德国Boehringer Mannhein公司产品，具体操作按试剂盒说明书进行。细胞核中有蓝色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每例切片计数5～10个高倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(AI)。
5.统计学处理：肿瘤各期、各级间IMVD的比较采用方差分析；IMVD与Ki67及AI相关性分析采用Spearman秩和相关检验。
, 百拇医药
结 果
1.IMVD与肿瘤分期、分级的关系：第Ⅷ因子相关抗原单抗特异地与微血管内皮细胞内的抗原结合，表现为微血管内皮细胞浆着色，呈棕黄色。有时血管因肿瘤组织的挤压推移或切片与血管纵轴一致，表现为片状或条索状的棕黄色结构。IMVD随肿瘤病理分级及临床分期的增高而增多，差异具有显著性(P<0.05，表1)。
表1 患者IMVD与肿瘤分期、分级的关系(X±s)
项目
例数
IMVD
IMVD范围
P值
Furhman分级
, 百拇医药
Ⅰ级
12
49.3±25.3
9～115
Ⅱ级
22
54.0±28.8
8～165
<0.05
Ⅲ级
17
94.9±38.7
12～212
, http://www.100md.com
Robson分期
Ⅰ期
19
45.2±21.2
8～112
Ⅱ期
21
68.5±32.6
9～165
<0.05
Ⅲ～Ⅳ期
11
99.5±43.7
, http://www.100md.com
22～212
2.IMVD与AI及Ki67的关系：在92%的切片上均可见到处于不同分期的凋亡细胞。凋亡小体为深蓝色染色，而坏死区细胞显色为弥漫性且较淡，较易区别。51例肿瘤组织中凋亡细胞指数均值为(1.480±1.431)%，范围0～5.6%。Spearman秩和相关检验肾细胞癌中微血管密度与肿瘤细胞凋亡指数存在显著负相关(rs=-0.618，P<0.001)。Ki67的阳性染色为棕褐色颗粒状，定位于细胞核，每个肿瘤标本中均呈阳性表达，Ki67LI值在9.8%～86.1%，Ki67LI均值为(46.8±14.0)%。Spearman秩和相关检验未发现IMVD与Ki67LI之间存在明显相关性(rs=0.096,P>0.05)。讨 论
本实验旨在研究微血管密度与肾细胞癌进展的关系，结果显示随着肾细胞癌病理分级或临床分期的增高，微血管密度也相应增加，提示微血管的形成与肾细胞癌的恶性进展密切相关。
, 百拇医药
肿瘤的生长是通过肿瘤细胞的增殖与凋亡的平衡来调节，肿瘤细胞凋亡减少和(或)增殖活性增加均导致肿瘤的恶性进展，但多数情况下这一过程是通过细胞凋亡来调节[2]。我们在本实验中研究了肾细胞癌血管形成与肿瘤细胞凋亡及增殖活性的关系，发现肾细胞癌中微血管的形成与细胞凋亡之间存在一种明显的负相关，而与肿瘤的增殖活性无关，即随着肿瘤血管的形成，肿瘤细胞凋亡能力下降。本实验研究表明，实体瘤在血管形成前后其增殖活性差异无显著性，肿瘤的增长主要通过细胞凋亡来调节[2，3]。新生的实体瘤组织在形成血管前，快速增殖的肿瘤细胞始终处于缺氧的选择压力下，缺氧一方面可以诱导肿瘤细胞的凋亡，但另一方面还可以选择凋亡抗性细胞[3]。同时还可诱导血管内皮生长因子的表达及促进血管的形成[2]。一旦肿瘤血管形成，血管内皮细胞、巨噬细胞以及宿主的良性细胞产生的生长因子通过新生血管运至肿瘤细胞，导致肿瘤的快速增长，如去除这些生长因子，则可以诱导大量的肿瘤细胞凋亡。有实验研究证实，抑制肿瘤血管的形成可通过增加肿瘤细胞的凋亡而抑制原发及转移瘤的生长，但肿瘤的增殖活性并未改变[3]。
, 百拇医药
作者单位：武玉东(450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科)
魏金星(450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科)
高建光(450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科)
董秀哲(延边医学院附属医院泌尿外科)
吴长利(天津市泌尿外科研究所)
参考文献
[1]Graeber TG, Osmanian C, Jacks T, et al. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumors. Nature, 1996,379:88-97.
[2]Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell, 1996,86:353-457.
[3]O'Reilly MS, Holmgren L, Chen C, et al. Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nat Med, 1996,2:689-705., 百拇医药
摘 要 目的 探讨肾癌组织中微血管形成与肿瘤细胞凋亡的关系。方法 应用免疫组织化学方法对51例肾癌组织中血管内皮细胞的第Ⅷ因子抗原进行染色，并计数肿瘤的微血管；应用原位DNA片段末端标记法检测肾癌组织细胞凋亡状态。结果 肾细胞癌微血管密度在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤中分别为49.3±25.3、54.0±28.8、94.9±38.7；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中分别为45.2±21.2、68.5±32.6、99.5±43.7，其密度在肿瘤的临床分期及病理分级间差异具有显著性(P<0.05)。肾细胞癌微血管密度与肿瘤细胞的凋亡指数呈负相关(rs=-0.618，P<0.001)，但与肿瘤的Ki67标记指数无关(rs=0.096，P>0.05)。结论 在肾细胞癌发展过程中，微血管的形成可抑制肿瘤细胞的凋亡，而促进肿瘤的恶性进展。
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关键词：肾肿瘤 癌 凋亡
最近有研究表明，肿瘤发展过程中微环境的改变可影响肿瘤细胞的凋亡状态[1]。为此，我们对肾细胞癌中微血管的形成与肿瘤细胞凋亡的关系进行研究，现将结果报道如下。材料与方法
1.标本来源：取来自本院及河南省平顶山市第一人民医院1994～1997年间经手术切除的肾癌组织标本51例，经病理证实为肾细胞癌。所有病例术前均未行化疗和放疗。标本经最佳切片温度溶液(OCT)包埋行4 μm厚连续冰冻切片。Furhman分级：Ⅰ级12例、Ⅱ级22例、Ⅲ级17例；Robson分期：Ⅰ期19例、Ⅱ期21例，Ⅲ期9例、Ⅳ期2例。
2.免疫组织化学染色：Ki67、第Ⅷ因子相关抗原(FⅧ-RAg)单克隆抗体均为Dako公司产品，ABC法免疫组织化学染色。切片加一抗FⅧ-RAg之前胰酶消化20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。
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3.Ki67标记指数(Ki67LI)和肿瘤微血管密度(IMVD)计数：为了保证肿瘤内IMVD计数的客观性和准确性，首先选取具有代表性的组织切片，排除肿瘤出血区及边缘反应区。低倍镜观察确定每例切片中3个血管密度最高区域，然后在高倍镜下，计数每个区域的IMVD，其平均值即为该例肿瘤的IMVD值。观察500个肿瘤细胞，记数其Ki67阳性细胞数，Ki67LI=Ki67阳性细胞数/观察肿瘤细胞数×100%。
4.原位DNA片段末端标记(TUNEL法)：原位细胞凋亡检测试剂盒为德国Boehringer Mannhein公司产品，具体操作按试剂盒说明书进行。细胞核中有蓝色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每例切片计数5～10个高倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(AI)。
5.统计学处理：肿瘤各期、各级间IMVD的比较采用方差分析；IMVD与Ki67及AI相关性分析采用Spearman秩和相关检验。
, 百拇医药
结 果
1.IMVD与肿瘤分期、分级的关系：第Ⅷ因子相关抗原单抗特异地与微血管内皮细胞内的抗原结合，表现为微血管内皮细胞浆着色，呈棕黄色。有时血管因肿瘤组织的挤压推移或切片与血管纵轴一致，表现为片状或条索状的棕黄色结构。IMVD随肿瘤病理分级及临床分期的增高而增多，差异具有显著性(P<0.05，表1)。
表1 患者IMVD与肿瘤分期、分级的关系(X±s)
项目
例数
IMVD
IMVD范围
P值
Furhman分级
, 百拇医药
Ⅰ级
12
49.3±25.3
9～115
Ⅱ级
22
54.0±28.8
8～165
<0.05
Ⅲ级
17
94.9±38.7
12～212
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Robson分期
Ⅰ期
19
45.2±21.2
8～112
Ⅱ期
21
68.5±32.6
9～165
<0.05
Ⅲ～Ⅳ期
11
99.5±43.7
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22～212
2.IMVD与AI及Ki67的关系：在92%的切片上均可见到处于不同分期的凋亡细胞。凋亡小体为深蓝色染色，而坏死区细胞显色为弥漫性且较淡，较易区别。51例肿瘤组织中凋亡细胞指数均值为(1.480±1.431)%，范围0～5.6%。Spearman秩和相关检验肾细胞癌中微血管密度与肿瘤细胞凋亡指数存在显著负相关(rs=-0.618，P<0.001)。Ki67的阳性染色为棕褐色颗粒状，定位于细胞核，每个肿瘤标本中均呈阳性表达，Ki67LI值在9.8%～86.1%，Ki67LI均值为(46.8±14.0)%。Spearman秩和相关检验未发现IMVD与Ki67LI之间存在明显相关性(rs=0.096,P>0.05)。讨 论
本实验旨在研究微血管密度与肾细胞癌进展的关系，结果显示随着肾细胞癌病理分级或临床分期的增高，微血管密度也相应增加，提示微血管的形成与肾细胞癌的恶性进展密切相关。
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肿瘤的生长是通过肿瘤细胞的增殖与凋亡的平衡来调节，肿瘤细胞凋亡减少和(或)增殖活性增加均导致肿瘤的恶性进展，但多数情况下这一过程是通过细胞凋亡来调节[2]。我们在本实验中研究了肾细胞癌血管形成与肿瘤细胞凋亡及增殖活性的关系，发现肾细胞癌中微血管的形成与细胞凋亡之间存在一种明显的负相关，而与肿瘤的增殖活性无关，即随着肿瘤血管的形成，肿瘤细胞凋亡能力下降。本实验研究表明，实体瘤在血管形成前后其增殖活性差异无显著性，肿瘤的增长主要通过细胞凋亡来调节[2，3]。新生的实体瘤组织在形成血管前，快速增殖的肿瘤细胞始终处于缺氧的选择压力下，缺氧一方面可以诱导肿瘤细胞的凋亡，但另一方面还可以选择凋亡抗性细胞[3]。同时还可诱导血管内皮生长因子的表达及促进血管的形成[2]。一旦肿瘤血管形成，血管内皮细胞、巨噬细胞以及宿主的良性细胞产生的生长因子通过新生血管运至肿瘤细胞，导致肿瘤的快速增长，如去除这些生长因子，则可以诱导大量的肿瘤细胞凋亡。有实验研究证实，抑制肿瘤血管的形成可通过增加肿瘤细胞的凋亡而抑制原发及转移瘤的生长，但肿瘤的增殖活性并未改变[3]。
, 百拇医药
作者单位：武玉东(450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科)
魏金星(450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科)
高建光(450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科)
董秀哲(延边医学院附属医院泌尿外科)
吴长利(天津市泌尿外科研究所)
参考文献
[1]Graeber TG, Osmanian C, Jacks T, et al. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumors. Nature, 1996,379:88-97.
[2]Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell, 1996,86:353-457.
[3]O'Reilly MS, Holmgren L, Chen C, et al. Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nat Med, 1996,2:689-705., 百拇医药