云南蝙蝠血液乙型脑炎病毒分离物的研究
黄文丽 张海林 龚鹤琴 张云智 米竹青 王静林
摘 要 目的：进一步探索蝙蝠在乙脑病毒贮存宿主方面的作用。方法：病毒分离、微量血凝抑制试验(HI)、间接免疫荧光试验(IFAT)、电镜和病理检查。结果：从蝙蝠血中分离到两株乙脑病毒。结论：蝙蝠在乙脑病毒在自然界中的贮存和扩散方面具有重要的流行病学意义。
关键词：乙脑病毒 蝙蝠 血清 贮存宿主
日本乙型脑炎(简称乙脑)是由黄病毒科的乙脑病毒引起的一种以中枢神经系统感染为主要症状的自然疫源性疾病。其主要传播媒介为三带喙库蚊，主要扩散宿主为猪，其长期贮存宿主方面虽然进行了一些研究，但还不十分清楚。本文为进一步研究蝙蝠在乙脑病毒贮存宿主方面的作用进行了研究。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 蝙蝠 1993年8月捕自云南省河口县城镇居民房屋顶棚，分类鉴定后，股动脉放血，分离血清，液氮保存，带回实验室进行病毒分离。
1.2 乙脑病毒中山株和豚鼠免疫血清 由中国药品生物制品检定所惠赠。
1.3 乙脑病毒单克隆抗体 特异性乙脑单抗2H4株和2F2株，由第四军医大学微生物教研室馈赠。
1.4 细胞、动物 金黄地鼠肾传代细胞(BHK-21)，来源于中国药品生物制品检定所；昆明种小白鼠，由本所实验室提供。
1.5 病毒分离 用蝙蝠血清接种BHK-21和3d龄小白鼠〔1〕。
1.6 病毒鉴定
, 百拇医药
1.6.1 血凝和血凝抑制试验 血凝素用蔗糖-丙酮法自制〔2〕; 血凝和血凝抑制试验采用微量法〔3〕。
1.6.2 间接免疫荧光试验 按文献〔4〕进行。
1.6.3 电镜试验 取感染新分离病毒的乳小白鼠发病频死前的脑组织,固定后作超薄切片,透射电镜观察。
1.6.4 病理检查 取感染新分离病毒的乳小白鼠发病濒死前的脑、心、肺、肝、肾、胃、肠和肌肉,作常规病理检查。
2 结果
2.1 病毒分离 对136份蝙蝠血清作病毒分离，从2只棕果蝠(Rousettus leschenauli)血清中分离到2株病原体(HB49、HB97)。用其EK板滤液接种3d龄乳小白鼠，经3～4d潜伏期，出现规律发病和死亡，发病表现为行走不稳、后肢瘫痪；接种BHK-21细胞，约4d后可见细胞病变(CPE)， 表现为圆缩、堆聚、脱落。与乙脑中山株的CPE相比，HB49和HB97株的CPE出现晚1～2d，且冻融后其毒力明显下降。
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2.2 病毒鉴定
2.2.1 毒力测定 HB49、HB97对BHK-21细胞的TCID50分别为5.33和4.50，对3d龄乳小白鼠的LD50分别为3.5和3.67。
2.2.2 血凝特性(HA)和血凝抑制试验(HI) HB49和HB97对鸽血球的血凝pH 范围为5.76～6.8，最适pH为6.4，血凝素滴度为1∶256。HB49和HB97与乙脑多价血清、单克隆抗体2H4、2F2的HI结果见表1。
2.2.3 间接免疫荧光试验(IFAT) HB49、HB97与乙脑单克隆抗体2H4、2F2 的IFAT结果见表1。
表1 HB49和HB97株的HI、IFAT试验结果
抗原
, 百拇医药
HI检测(1∶ )
IFAT检测
JEAb
2H4
2F2
阴性对照
JEAb
2H4
2F2
阴性对照
HB49
640
2560
, http://www.100md.com
1280
ND
+++～#
++～+++
+～++
-
HB97
5120
10240
10240
-
+++～#
++～+++
, http://www.100md.com
+～++
-
注：ND: 未做 2.2.4 电镜检测 HB49和HB97感染鼠脑标本超薄切片透射电镜观察发现：神经细胞核常染色质丰富，核仁明显且多，部分神经细胞质内粗面内质网增多，部分细胞质内见电子密度高的不规则的较小的病毒包含体(图1)。 粗面内质网腔内及胞质内见电子密度高的、直径约45nm的病毒颗粒和许多葡萄样聚集的、大小不等的微泡和微管结构(图2)，部分细胞高尔基体扁平膜囊内见少数病毒颗粒， 在神经突起间隙内见少数病毒颗粒(图3)。
图1 HB49,神经细胞胞质内粗面内质网增多,部分细胞质内见病毒包含体(26 000×)
, 百拇医药
图2 HB97,神经细胞胞质内见45nm病毒颗粒
(26 000×)
图3 HB49,病毒颗粒(33 000×)
2.2.5 病理检查 HB49和HB97 感染乳小白鼠发病后，各器官组织病理检查结果如下：脑：软膜下轻度充血，大脑实质灶状出血，神经细胞普遍肿胀变性，尼氏体结构不清，核仁不清，少部分核浓缩，病变以大脑实质为显，蛛网膜下腔有出血病变。未见明显的筛网状软化灶。心肌细胞颗粒变性，部分胞浆呈空泡样变，间质、心外膜充血。部分肝细胞明显肿胀增大，胞浆疏松化，少数肝细胞脂肪变性。肾近曲小管上皮细胞普遍颗粒样变性。肺组织明显出血，胃肠有出血病变。其它脏器组织未见病理改变。
, 百拇医药
3 讨论
本次试验从蝙蝠血中分离到2株病原体，经滤过试验及与乙脑复合血清、 单克隆抗体的交叉HI和IFAT试验结果表明为乙脑病毒。电镜和病理检查结果表明HB49 和HB97病毒能在小白鼠脑组织内繁殖，并可致神经细胞变性坏死，符合乙脑病毒的嗜神经性。
我室、日本和我国台湾学者都曾从野外捕获的蝙蝠脑内分离到乙脑病毒〔5-7〕。我省蝙蝠血清乙脑抗体阳性率高达59.58%，低达13.73%〔5〕。 日本学者发现用皮下接种、带毒蚊叮咬和经口感染都可使蝙蝠感染乙脑病毒〔6〕。 蝙蝠与蚊虫之间传播乙脑很容易建立，且蝙蝠以双翅目昆虫为主食，受染的机会增多。感染的蝙蝠多产生病毒血症，且不显任何症状。温度对蝙蝠体内的病毒有明显影响，5～10℃时， 血内病毒滴度很低甚至不能检出；当移至24℃时，血内病毒量迅速升高；再转到8℃， 则又下降；并且在低温血中未查到中和抗体。有的蝙蝠甚至在室内放置2～3年，还可再产生病毒血症或再感染乙脑病毒〔8-9〕。感染的孕蝙蝠还可垂直传播给子蝙蝠〔10〕。以上资料表明，蝙蝠本身具备保存病毒的条件。但在自然界中乙脑病毒在蝙蝠体内是如何感染、保存和传播的还不清楚。本文从蝙蝠血中分离到乙脑病毒，再次证明蝙蝠能自然感染乙脑病毒，且形成病毒血症，具有扩散和传播病毒的条件。棕果蝠广泛分布在我省，群居于房屋顶棚和洞穴，与人接触的机会较多，因此作为乙脑病毒在自然界中的贮存和扩散宿主的流行病学意义显得尤为重要。
, 百拇医药
本次分离到的2株乙脑病毒毒力较低，血凝pH范围较宽5.75～6.8，最适pH为6.4。冻融后毒力明显下降。这一特殊生物学性状是否与感染蝙蝠这一特殊物种相关，有待进一步研究。
第一作者简介：女，1963年生，汉族，毕业于昆明医学院预防医学系，医学学士，主管医师
作者单位：黄文丽(云南省流行病防治研究所 大理671000)
张海林(云南省流行病防治研究所 大理671000)
龚鹤琴(云南省流行病防治研究所 大理671000)
张云智(云南省流行病防治研究所 大理671000)
米竹青(云南省流行病防治研究所 大理671000)
, 百拇医药
王静林(云南省流行病防治研究所 大理671000)
参考文献
1，自登云,陈伯权,俞永新主编.虫媒病毒与虫媒病毒病.昆明：云南科技出版社,1995,376-383.
2，戴华生.新实验病毒学.北京:中国学术出版社,1983,672.
3，同〔1〕∶388-395.
4，同〔1〕∶418-423.
5，张海林,施华芳,米竹青，等.蝙蝠自然感染乙脑病毒的研究.病毒学报,1990,6(3)∶269-271.
6，Motte LC, JR Japanese. B Encephalitis in Bats During Simulated Hibernetion. Am J Hyg, 1958，67(1)∶101-108.
, 百拇医药
7，Sulkin SE, Allen R, Miura T, et al. Studies of Arthropod-Brorne Virus Infections in Chiroptera. Am J Trop Med Hyg,1970,19(1)∶77-87.
8，Sulkin SE, Allen R, Sims R, et al. Studies of Arthropod-Borne Virus Infections in Chiroptera. Am J Trop Med Hyg,1966,15(3)∶406- 417.
9，Sulkin SE, Allen R, Sims R, et al. Studies of Arthropod-Borne Virus Infections in Chiroptera. Am J Trop Med Hyg,1966,15(3)∶418-427.
10，Sulkin SE, Sims R, Allen R, et al. Studies of Arthropod-Borne Virus Infections in Chiroptera. Am J Trop Med Hyg,1964,13(3)∶475-481., 百拇医药
摘 要 目的：进一步探索蝙蝠在乙脑病毒贮存宿主方面的作用。方法：病毒分离、微量血凝抑制试验(HI)、间接免疫荧光试验(IFAT)、电镜和病理检查。结果：从蝙蝠血中分离到两株乙脑病毒。结论：蝙蝠在乙脑病毒在自然界中的贮存和扩散方面具有重要的流行病学意义。
关键词：乙脑病毒 蝙蝠 血清 贮存宿主
日本乙型脑炎(简称乙脑)是由黄病毒科的乙脑病毒引起的一种以中枢神经系统感染为主要症状的自然疫源性疾病。其主要传播媒介为三带喙库蚊，主要扩散宿主为猪，其长期贮存宿主方面虽然进行了一些研究，但还不十分清楚。本文为进一步研究蝙蝠在乙脑病毒贮存宿主方面的作用进行了研究。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 蝙蝠 1993年8月捕自云南省河口县城镇居民房屋顶棚，分类鉴定后，股动脉放血，分离血清，液氮保存，带回实验室进行病毒分离。
1.2 乙脑病毒中山株和豚鼠免疫血清 由中国药品生物制品检定所惠赠。
1.3 乙脑病毒单克隆抗体 特异性乙脑单抗2H4株和2F2株，由第四军医大学微生物教研室馈赠。
1.4 细胞、动物 金黄地鼠肾传代细胞(BHK-21)，来源于中国药品生物制品检定所；昆明种小白鼠，由本所实验室提供。
1.5 病毒分离 用蝙蝠血清接种BHK-21和3d龄小白鼠〔1〕。
1.6 病毒鉴定
, 百拇医药
1.6.1 血凝和血凝抑制试验 血凝素用蔗糖-丙酮法自制〔2〕; 血凝和血凝抑制试验采用微量法〔3〕。
1.6.2 间接免疫荧光试验 按文献〔4〕进行。
1.6.3 电镜试验 取感染新分离病毒的乳小白鼠发病频死前的脑组织,固定后作超薄切片,透射电镜观察。
1.6.4 病理检查 取感染新分离病毒的乳小白鼠发病濒死前的脑、心、肺、肝、肾、胃、肠和肌肉,作常规病理检查。
2 结果
2.1 病毒分离 对136份蝙蝠血清作病毒分离，从2只棕果蝠(Rousettus leschenauli)血清中分离到2株病原体(HB49、HB97)。用其EK板滤液接种3d龄乳小白鼠，经3～4d潜伏期，出现规律发病和死亡，发病表现为行走不稳、后肢瘫痪；接种BHK-21细胞，约4d后可见细胞病变(CPE)， 表现为圆缩、堆聚、脱落。与乙脑中山株的CPE相比，HB49和HB97株的CPE出现晚1～2d，且冻融后其毒力明显下降。
, http://www.100md.com
2.2 病毒鉴定
2.2.1 毒力测定 HB49、HB97对BHK-21细胞的TCID50分别为5.33和4.50，对3d龄乳小白鼠的LD50分别为3.5和3.67。
2.2.2 血凝特性(HA)和血凝抑制试验(HI) HB49和HB97对鸽血球的血凝pH 范围为5.76～6.8，最适pH为6.4，血凝素滴度为1∶256。HB49和HB97与乙脑多价血清、单克隆抗体2H4、2F2的HI结果见表1。
2.2.3 间接免疫荧光试验(IFAT) HB49、HB97与乙脑单克隆抗体2H4、2F2 的IFAT结果见表1。
表1 HB49和HB97株的HI、IFAT试验结果
抗原
, 百拇医药
HI检测(1∶ )
IFAT检测
JEAb
2H4
2F2
阴性对照
JEAb
2H4
2F2
阴性对照
HB49
640
2560
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注：ND: 未做 2.2.4 电镜检测 HB49和HB97感染鼠脑标本超薄切片透射电镜观察发现：神经细胞核常染色质丰富，核仁明显且多，部分神经细胞质内粗面内质网增多，部分细胞质内见电子密度高的不规则的较小的病毒包含体(图1)。 粗面内质网腔内及胞质内见电子密度高的、直径约45nm的病毒颗粒和许多葡萄样聚集的、大小不等的微泡和微管结构(图2)，部分细胞高尔基体扁平膜囊内见少数病毒颗粒， 在神经突起间隙内见少数病毒颗粒(图3)。
图1 HB49,神经细胞胞质内粗面内质网增多,部分细胞质内见病毒包含体(26 000×)
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图2 HB97,神经细胞胞质内见45nm病毒颗粒
(26 000×)
图3 HB49,病毒颗粒(33 000×)
2.2.5 病理检查 HB49和HB97 感染乳小白鼠发病后，各器官组织病理检查结果如下：脑：软膜下轻度充血，大脑实质灶状出血，神经细胞普遍肿胀变性，尼氏体结构不清，核仁不清，少部分核浓缩，病变以大脑实质为显，蛛网膜下腔有出血病变。未见明显的筛网状软化灶。心肌细胞颗粒变性，部分胞浆呈空泡样变，间质、心外膜充血。部分肝细胞明显肿胀增大，胞浆疏松化，少数肝细胞脂肪变性。肾近曲小管上皮细胞普遍颗粒样变性。肺组织明显出血，胃肠有出血病变。其它脏器组织未见病理改变。
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3 讨论
本次试验从蝙蝠血中分离到2株病原体，经滤过试验及与乙脑复合血清、 单克隆抗体的交叉HI和IFAT试验结果表明为乙脑病毒。电镜和病理检查结果表明HB49 和HB97病毒能在小白鼠脑组织内繁殖，并可致神经细胞变性坏死，符合乙脑病毒的嗜神经性。
我室、日本和我国台湾学者都曾从野外捕获的蝙蝠脑内分离到乙脑病毒〔5-7〕。我省蝙蝠血清乙脑抗体阳性率高达59.58%，低达13.73%〔5〕。 日本学者发现用皮下接种、带毒蚊叮咬和经口感染都可使蝙蝠感染乙脑病毒〔6〕。 蝙蝠与蚊虫之间传播乙脑很容易建立，且蝙蝠以双翅目昆虫为主食，受染的机会增多。感染的蝙蝠多产生病毒血症，且不显任何症状。温度对蝙蝠体内的病毒有明显影响，5～10℃时， 血内病毒滴度很低甚至不能检出；当移至24℃时，血内病毒量迅速升高；再转到8℃， 则又下降；并且在低温血中未查到中和抗体。有的蝙蝠甚至在室内放置2～3年，还可再产生病毒血症或再感染乙脑病毒〔8-9〕。感染的孕蝙蝠还可垂直传播给子蝙蝠〔10〕。以上资料表明，蝙蝠本身具备保存病毒的条件。但在自然界中乙脑病毒在蝙蝠体内是如何感染、保存和传播的还不清楚。本文从蝙蝠血中分离到乙脑病毒，再次证明蝙蝠能自然感染乙脑病毒，且形成病毒血症，具有扩散和传播病毒的条件。棕果蝠广泛分布在我省，群居于房屋顶棚和洞穴，与人接触的机会较多，因此作为乙脑病毒在自然界中的贮存和扩散宿主的流行病学意义显得尤为重要。
, 百拇医药
本次分离到的2株乙脑病毒毒力较低，血凝pH范围较宽5.75～6.8，最适pH为6.4。冻融后毒力明显下降。这一特殊生物学性状是否与感染蝙蝠这一特殊物种相关，有待进一步研究。
第一作者简介：女，1963年生，汉族，毕业于昆明医学院预防医学系，医学学士，主管医师
作者单位：黄文丽(云南省流行病防治研究所 大理671000)
张海林(云南省流行病防治研究所 大理671000)
龚鹤琴(云南省流行病防治研究所 大理671000)
张云智(云南省流行病防治研究所 大理671000)
米竹青(云南省流行病防治研究所 大理671000)
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王静林(云南省流行病防治研究所 大理671000)
参考文献
1，自登云,陈伯权,俞永新主编.虫媒病毒与虫媒病毒病.昆明：云南科技出版社,1995,376-383.
2，戴华生.新实验病毒学.北京:中国学术出版社,1983,672.
3，同〔1〕∶388-395.
4，同〔1〕∶418-423.
5，张海林,施华芳,米竹青，等.蝙蝠自然感染乙脑病毒的研究.病毒学报,1990,6(3)∶269-271.
6，Motte LC, JR Japanese. B Encephalitis in Bats During Simulated Hibernetion. Am J Hyg, 1958，67(1)∶101-108.
, 百拇医药
7，Sulkin SE, Allen R, Miura T, et al. Studies of Arthropod-Brorne Virus Infections in Chiroptera. Am J Trop Med Hyg,1970,19(1)∶77-87.
8，Sulkin SE, Allen R, Sims R, et al. Studies of Arthropod-Borne Virus Infections in Chiroptera. Am J Trop Med Hyg,1966,15(3)∶406- 417.
9，Sulkin SE, Allen R, Sims R, et al. Studies of Arthropod-Borne Virus Infections in Chiroptera. Am J Trop Med Hyg,1966,15(3)∶418-427.
10，Sulkin SE, Sims R, Allen R, et al. Studies of Arthropod-Borne Virus Infections in Chiroptera. Am J Trop Med Hyg,1964,13(3)∶475-481., 百拇医药