牛血红蛋白用于兔离体心脏延时保存的研究
康云帆 蔡振杰 胡军
摘 要 目的 研究牛血红蛋白对兔离体心脏保存时限的作用。方法 在StThomasⅡ液中加入无机质游离牛血红蛋白(SFBHB)，用该液常温灌注离体兔心6h作为实验组，用单纯StThomasⅡ液低温保存离体兔心作为对照组。每组大白兔均为12只。结果 左室发展压(LVDP)、冠状动脉流量恢复率(CFR)，实验组均显著高于对照组，P<0.001；兔心保存4h后，心肌组织ATP含量两组差异显著(P<0.05)；心脏复跳30min后，心肌组织内的丙二醛(MDA)含量及冠状静脉窦引流液中的心肌磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量实验组明显低于对照组，两组比较差异有极显著性(P<0.01)。结论 在StThomasⅡ液中加入SFBHB，可以显著提高离体兔心的保存效果。
关键词：牛血红蛋白 保存液 心脏
目前心脏移植多采用StThomasⅡ液或Collins液单纯低温保存供心，保存期间供心处于缺氧状态；临床供心安全保存时限仅3～4h[1]，无法满足临床心脏移植快速发展的需要。本实验在StThomasⅡ液中加入无机质游离牛血红蛋白(SFBHB)作为载氧体，常温持续灌流离体兔心6h，取得满意效果。报道如下。
, 百拇医药
材料和方法
1.StThomasⅡ液中加入64g/LSFBHB作为实验组离体兔心保存液，对照组离体兔心灌流的StThomasⅡ液中加入与SFBHB同当量数的牛血清白蛋白(BSA)68g/L，使其胶体渗透压与保存液相同；在Krebs-Hensleit液中加入SFBHB64g/L作为工作液。
2.离体灌注心脏模型：健康雄性大白兔24只，体重2～2.5kg，随机分成两组。采用戊巴比妥钠30mg/kg耳静脉注射麻醉，正中切口开胸，显露兔心，经下腔静脉注入肝素纳(3mg/kg)。从主动脉插入灌注针头，注入4℃StThomasⅡ液30～50ml，待心脏停搏后切下心脏。经离体兔心二尖瓣口置入一容量约为2ml的乳胶球囊，球囊内充入生理盐水使左室舒张末压保持在10mmHg[2]，球囊经一内径为1mm的硬塑胶管与压力传感器连接。迅速建立离体心脏Langendorff灌注模型。以工作液灌注离体兔心，灌注压80mmHg，心肌温度37℃。采用OXIMⅡ-6型膜式氧合器氧合，气源为体积浓度含5%CO2的纯净空气。电子起搏器(MEDTRQNIC5375型)起搏心率180次/min。灌注30min后，实验组采用保存液灌注，心脏停搏后保持灌注压30mmHg，心肌37℃持续灌流6h；对照组采用4℃StThomasⅡ液，首次灌注30～50ml使心脏停搏，其后每隔30min灌注30ml，心肌温度保持在4℃。保存6h后，对照组与实验组均用37℃工作液灌注使心脏复跳，灌注压80mmHg，起搏心率180次/min。复跳后观察30min，终止试验。
, 百拇医药
3.观察指标：每组随机选取7只动物测量：(1)左室发展压(LVDP)：分别于兔心停搏前及复跳后30min测量LVDP；(2)冠脉流量恢复率(CFR)：心脏复跳后30min与停搏前冠脉流量的百分比；(3)心肌磷酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率：收集复跳后15min的冠状静脉窦引流液，测定CPK及LDH浓度，计算CPK和LDH的漏出率；(4)心肌O2摄取量(O2uptake)：心脏复跳后30min取主动脉根部及冠状静脉窦引流液，i-STAT血气分析仪测定氧分压(PO2)及氧饱和度(SO2)，根据公式：O2摄取量=4×(CF)×(SaO2-SvO2)+0.00133×(CF)×(PaO2-PvO2)，计算心肌O2摄取量；(5)超微结构观察：心脏复跳30min后，于左室前壁相同部位取心内膜侧心肌，标本常规固定包埋，应用透射电镜观察、摄像；(6)心肌含水量(MWC)：实验完毕后，取左室全层心肌称湿重，然后置烤箱内105℃烘烤24h至衡重，再称干重。按下列公式计算：MWC=(心肌湿重-心肌干重)/心肌湿重×100%。
, 百拇医药
每组剩余5只动物测量：(1)心肌组织ATP含量：分别于心脏停搏的0、2、4、6h及复跳后30min取50～80mg左室前壁相同部位的心肌，采用Luciferase发光法(EF2200；PromegaCorporation,Madison,WI)测定心肌组织ATP含量；(2)心肌组织脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量：分别于心脏停搏前、复跳前及复跳后30min取左室前壁相同部位的心肌，测定MDA的含量。
实验数据以X±s表示，分别进行组内t检验和组间F-Q检验，P<0.05为差异有显著性。
结 果
1.LVDP、CFR、CPK、LDH、心肌O2摄取量、MWC的测量结果见表1。
表1 心肌延时保存各项实验指标观察结果(X±s)
, 百拇医药 组别
CPK
(IU.15min-1.g-1)
LDH
(IU.15min-1.g-1)
LVDP
(mmHg)
CFR
(%)
MWC
(%)
, 百拇医药
O2Uptake
(μmol.15min-1.g-1)
对照组
190.16±24.59
31.41±4.25
54.14±8.45
59.07±9.59
82.91±0.76
5.43±2.37
实验组
57.68±7.54**
, 百拇医药
13.55±3.58**
103.29±10.19**
92.8±5.16**
81.16±1.05*
32.24±7.44**
注：*与对照组比较，P<0.01；* *与对照组比较，P<0.001。
2.心肌组织内ATP含量在保存4h后两组比较，差异有显著性(P<0.05)，复灌30min后，实验组较对照组心肌组织的ATP含量明显升高，差异有极显著性(P<0.001)。见图1。
注：*与对照组相比P<0.05；* *与对照组相比P<0.001
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图1 心肌组织内ATP含量的变化
3.对照组与实验组心肌组织内MDA含量在复跳前无显著差异，复跳30min后，对照组心肌组织内MDA含量显著高于实验组。见图2。
注：*与对照组相比P>0.05；* *与对照组相比P<0.001
图2 心肌组织内MDA含量
4.心肌超微结构：实验组仅有少数线粒体肿胀，大致接近正常的心肌结构。对照组多数线粒体明显肿胀，可见嵴断裂、空泡化，核边聚现象明显，肌丝紊乱、模糊，有少量肌丝断裂。
讨 论
牛血红蛋白作为保存液中的载氧体用于保存离体肾脏及肠管已经取得良好的效果[3]，但是离体心脏的保存远较离体肾脏的保存复杂。因为心脏在缺血后再灌注时需要更多的能量支持，一方面使心脏立即进行搏动，同时还要偿还无氧保存期间的氧债；以冷晶体液保存的心肌恢复血液灌注后，缺氧再灌注损伤以及微循环无再流现象会严重降低心肌细胞获取氧及利用氧的能力；因此，在供心保存期间常温供氧维持其正常的代射状态，降低能量耗竭及氧债是提高供心保存效果的有效方法。为此，我们设计了以SFBHB为载氧体、常温持续灌注供心的保存方法。选择SFBHB作为载氧体有以下优点：(1)SFBHB与氧的结合力受Cl-调节，在37℃、pH值为7.4、Cl-浓度为128.1mmol/L时，P50约为30mmHg[4]，生理状态下可释放更多的氧。(2)SFBHB不含红细胞，长时间转流后保存液成分无变化。而以红细胞为载氧体的保存液在长时间转流后部分红细胞破碎，其膜内的氨基磷脂(PE、PS)、内毒素、红细胞血型糖蛋白、细胞内酶都可直接引起血管内皮及心肌细胞的损伤[5-6]。(3)SFBHB不含白细胞、血小板、补体C3等活性成分，长时间转流不会出现白细胞阻塞毛细血管，血小板、补体C3激活现象[7]。(4)含SFBHB的保存液经0.2μm滤膜过滤，转流期间4μm滤器过滤，大大减少了微拴拴塞。
, 百拇医药
实验结果表明：StThomasⅡ液中加入SFBHB明显提高了离体兔心的保存效果。其中实验组心肌组织的O2摄取率为(32.2±7.44)μmol.min-1.g-1，与VICTOR的报道结果[8]类似，说明SFBHB作为载氧体能够有效地为心肌供氧。而对照组由于CFR明显低于实验组(P<0.001)，心肌组织无法得到充分的含氧工作液的灌注；同时缺氧再灌注损伤导致细胞内线粒体结构损坏和功能下降(细胞超微结构的变化以及主动脉-冠状静脉窦工作液氧分压差减小说明了这一点)；以上两种原因导致了对照组的O2摄取率只有(5.43±2.37)μmol.min-1.g-1。对照组心肌组织内ATP的含量在复跳后不升反降，除了以上两种原因导致ATP合成减少以外，心脏搏动做功使ATP的消耗量增加也是一重要原因。由于实验组心肌组织在保存期间有效摄取氧，ATP含量基本稳定，因此心肌细胞损伤小，CPK、LDH释放少。实验组MDA含量在复跳后30min与复跳前相比，差异无显著性，说明保存液通过持续为心肌组织供氧，从而明显抑制了缺氧再灌注损伤。
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作者单位：康云帆(西安，第四军医大学西京医院心脏外科中心)
蔡振杰(西安，第四军医大学西京医院心脏外科中心)
胡军(西安，第四军医大学西京医院心脏外科中心)
参考文献
[1]Yew PS, Kahyfon HY, Raymon CM, et al. Prolonged hypothermic cardiac storage for transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg, 1992, 104:817-829.
[2]James C, Karen L, Robert M, et al. Prolonging myocardial preservation with a modified University of Wisconsin solution containing 2,3-butanedione monoxime and calcium. The Journal Thoracic Cardiovascular Surgery, 1994, 107:764-775.
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[3]Willinger CC, Schramek H, Pfaller K, et al. Ultrapure polymerized bovine hemoglobin improves structural and functional integrity of the isolated perfused rat kidney. Ren Physiol Biochem, 1995, 18:288-305.
[4]Fronticelli C, Bucci E, Orth C. Solvent regulation of oxygen affinity in hemoglobin. Sensitivity of bovine hemoglobin to chloride ions. J Biol Chem, 1984, 259:10841-10844.
[5]Pristoupil TI, Kramlov M, Marik T, et al. Hydrodynamic instability of “stroma-free” hemoglobin. Biomat Art Cells Art Org, 1989, 17:335-339.
, http://www.100md.com
[6]Feola M, Simoni J, Tran R, et al. Mechanisms of toxicity of hemoglobin solutions. Biomat Art Cells Art Org, 1988, 16:217-226.
[7]Pearl JM, Drinkwater DC, Laks H, et al. Leukocyte-Depleted reperfusion of transplanted human hearts prevent ultrastructural evidence of reperfusion injury. Journal Surgical Reserch , 1992, 52:298-308.
[8]Mac Donald VW, Winslow RM. Oxygen delivery and myocardial function in rabbit hearts perfused with cell-free hemoglobin. J Appl Physiol, 1992, 72:476-483., 百拇医药
摘 要 目的 研究牛血红蛋白对兔离体心脏保存时限的作用。方法 在StThomasⅡ液中加入无机质游离牛血红蛋白(SFBHB)，用该液常温灌注离体兔心6h作为实验组，用单纯StThomasⅡ液低温保存离体兔心作为对照组。每组大白兔均为12只。结果 左室发展压(LVDP)、冠状动脉流量恢复率(CFR)，实验组均显著高于对照组，P<0.001；兔心保存4h后，心肌组织ATP含量两组差异显著(P<0.05)；心脏复跳30min后，心肌组织内的丙二醛(MDA)含量及冠状静脉窦引流液中的心肌磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量实验组明显低于对照组，两组比较差异有极显著性(P<0.01)。结论 在StThomasⅡ液中加入SFBHB，可以显著提高离体兔心的保存效果。
关键词：牛血红蛋白 保存液 心脏
目前心脏移植多采用StThomasⅡ液或Collins液单纯低温保存供心，保存期间供心处于缺氧状态；临床供心安全保存时限仅3～4h[1]，无法满足临床心脏移植快速发展的需要。本实验在StThomasⅡ液中加入无机质游离牛血红蛋白(SFBHB)作为载氧体，常温持续灌流离体兔心6h，取得满意效果。报道如下。
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材料和方法
1.StThomasⅡ液中加入64g/LSFBHB作为实验组离体兔心保存液，对照组离体兔心灌流的StThomasⅡ液中加入与SFBHB同当量数的牛血清白蛋白(BSA)68g/L，使其胶体渗透压与保存液相同；在Krebs-Hensleit液中加入SFBHB64g/L作为工作液。
2.离体灌注心脏模型：健康雄性大白兔24只，体重2～2.5kg，随机分成两组。采用戊巴比妥钠30mg/kg耳静脉注射麻醉，正中切口开胸，显露兔心，经下腔静脉注入肝素纳(3mg/kg)。从主动脉插入灌注针头，注入4℃StThomasⅡ液30～50ml，待心脏停搏后切下心脏。经离体兔心二尖瓣口置入一容量约为2ml的乳胶球囊，球囊内充入生理盐水使左室舒张末压保持在10mmHg[2]，球囊经一内径为1mm的硬塑胶管与压力传感器连接。迅速建立离体心脏Langendorff灌注模型。以工作液灌注离体兔心，灌注压80mmHg，心肌温度37℃。采用OXIMⅡ-6型膜式氧合器氧合，气源为体积浓度含5%CO2的纯净空气。电子起搏器(MEDTRQNIC5375型)起搏心率180次/min。灌注30min后，实验组采用保存液灌注，心脏停搏后保持灌注压30mmHg，心肌37℃持续灌流6h；对照组采用4℃StThomasⅡ液，首次灌注30～50ml使心脏停搏，其后每隔30min灌注30ml，心肌温度保持在4℃。保存6h后，对照组与实验组均用37℃工作液灌注使心脏复跳，灌注压80mmHg，起搏心率180次/min。复跳后观察30min，终止试验。
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3.观察指标：每组随机选取7只动物测量：(1)左室发展压(LVDP)：分别于兔心停搏前及复跳后30min测量LVDP；(2)冠脉流量恢复率(CFR)：心脏复跳后30min与停搏前冠脉流量的百分比；(3)心肌磷酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率：收集复跳后15min的冠状静脉窦引流液，测定CPK及LDH浓度，计算CPK和LDH的漏出率；(4)心肌O2摄取量(O2uptake)：心脏复跳后30min取主动脉根部及冠状静脉窦引流液，i-STAT血气分析仪测定氧分压(PO2)及氧饱和度(SO2)，根据公式：O2摄取量=4×(CF)×(SaO2-SvO2)+0.00133×(CF)×(PaO2-PvO2)，计算心肌O2摄取量；(5)超微结构观察：心脏复跳30min后，于左室前壁相同部位取心内膜侧心肌，标本常规固定包埋，应用透射电镜观察、摄像；(6)心肌含水量(MWC)：实验完毕后，取左室全层心肌称湿重，然后置烤箱内105℃烘烤24h至衡重，再称干重。按下列公式计算：MWC=(心肌湿重-心肌干重)/心肌湿重×100%。
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每组剩余5只动物测量：(1)心肌组织ATP含量：分别于心脏停搏的0、2、4、6h及复跳后30min取50～80mg左室前壁相同部位的心肌，采用Luciferase发光法(EF2200；PromegaCorporation,Madison,WI)测定心肌组织ATP含量；(2)心肌组织脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量：分别于心脏停搏前、复跳前及复跳后30min取左室前壁相同部位的心肌，测定MDA的含量。
实验数据以X±s表示，分别进行组内t检验和组间F-Q检验，P<0.05为差异有显著性。
结 果
1.LVDP、CFR、CPK、LDH、心肌O2摄取量、MWC的测量结果见表1。
表1 心肌延时保存各项实验指标观察结果(X±s)
, 百拇医药 组别
CPK
(IU.15min-1.g-1)
LDH
(IU.15min-1.g-1)
LVDP
(mmHg)
CFR
(%)
MWC
(%)
, 百拇医药
O2Uptake
(μmol.15min-1.g-1)
对照组
190.16±24.59
31.41±4.25
54.14±8.45
59.07±9.59
82.91±0.76
5.43±2.37
实验组
57.68±7.54**
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13.55±3.58**
103.29±10.19**
92.8±5.16**
81.16±1.05*
32.24±7.44**
注：*与对照组比较，P<0.01；* *与对照组比较，P<0.001。
2.心肌组织内ATP含量在保存4h后两组比较，差异有显著性(P<0.05)，复灌30min后，实验组较对照组心肌组织的ATP含量明显升高，差异有极显著性(P<0.001)。见图1。
注：*与对照组相比P<0.05；* *与对照组相比P<0.001
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图1 心肌组织内ATP含量的变化
3.对照组与实验组心肌组织内MDA含量在复跳前无显著差异，复跳30min后，对照组心肌组织内MDA含量显著高于实验组。见图2。
注：*与对照组相比P>0.05；* *与对照组相比P<0.001
图2 心肌组织内MDA含量
4.心肌超微结构：实验组仅有少数线粒体肿胀，大致接近正常的心肌结构。对照组多数线粒体明显肿胀，可见嵴断裂、空泡化，核边聚现象明显，肌丝紊乱、模糊，有少量肌丝断裂。
讨 论
牛血红蛋白作为保存液中的载氧体用于保存离体肾脏及肠管已经取得良好的效果[3]，但是离体心脏的保存远较离体肾脏的保存复杂。因为心脏在缺血后再灌注时需要更多的能量支持，一方面使心脏立即进行搏动，同时还要偿还无氧保存期间的氧债；以冷晶体液保存的心肌恢复血液灌注后，缺氧再灌注损伤以及微循环无再流现象会严重降低心肌细胞获取氧及利用氧的能力；因此，在供心保存期间常温供氧维持其正常的代射状态，降低能量耗竭及氧债是提高供心保存效果的有效方法。为此，我们设计了以SFBHB为载氧体、常温持续灌注供心的保存方法。选择SFBHB作为载氧体有以下优点：(1)SFBHB与氧的结合力受Cl-调节，在37℃、pH值为7.4、Cl-浓度为128.1mmol/L时，P50约为30mmHg[4]，生理状态下可释放更多的氧。(2)SFBHB不含红细胞，长时间转流后保存液成分无变化。而以红细胞为载氧体的保存液在长时间转流后部分红细胞破碎，其膜内的氨基磷脂(PE、PS)、内毒素、红细胞血型糖蛋白、细胞内酶都可直接引起血管内皮及心肌细胞的损伤[5-6]。(3)SFBHB不含白细胞、血小板、补体C3等活性成分，长时间转流不会出现白细胞阻塞毛细血管，血小板、补体C3激活现象[7]。(4)含SFBHB的保存液经0.2μm滤膜过滤，转流期间4μm滤器过滤，大大减少了微拴拴塞。
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实验结果表明：StThomasⅡ液中加入SFBHB明显提高了离体兔心的保存效果。其中实验组心肌组织的O2摄取率为(32.2±7.44)μmol.min-1.g-1，与VICTOR的报道结果[8]类似，说明SFBHB作为载氧体能够有效地为心肌供氧。而对照组由于CFR明显低于实验组(P<0.001)，心肌组织无法得到充分的含氧工作液的灌注；同时缺氧再灌注损伤导致细胞内线粒体结构损坏和功能下降(细胞超微结构的变化以及主动脉-冠状静脉窦工作液氧分压差减小说明了这一点)；以上两种原因导致了对照组的O2摄取率只有(5.43±2.37)μmol.min-1.g-1。对照组心肌组织内ATP的含量在复跳后不升反降，除了以上两种原因导致ATP合成减少以外，心脏搏动做功使ATP的消耗量增加也是一重要原因。由于实验组心肌组织在保存期间有效摄取氧，ATP含量基本稳定，因此心肌细胞损伤小，CPK、LDH释放少。实验组MDA含量在复跳后30min与复跳前相比，差异无显著性，说明保存液通过持续为心肌组织供氧，从而明显抑制了缺氧再灌注损伤。
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作者单位：康云帆(西安，第四军医大学西京医院心脏外科中心)
蔡振杰(西安，第四军医大学西京医院心脏外科中心)
胡军(西安，第四军医大学西京医院心脏外科中心)
参考文献
[1]Yew PS, Kahyfon HY, Raymon CM, et al. Prolonged hypothermic cardiac storage for transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg, 1992, 104:817-829.
[2]James C, Karen L, Robert M, et al. Prolonging myocardial preservation with a modified University of Wisconsin solution containing 2,3-butanedione monoxime and calcium. The Journal Thoracic Cardiovascular Surgery, 1994, 107:764-775.
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[3]Willinger CC, Schramek H, Pfaller K, et al. Ultrapure polymerized bovine hemoglobin improves structural and functional integrity of the isolated perfused rat kidney. Ren Physiol Biochem, 1995, 18:288-305.
[4]Fronticelli C, Bucci E, Orth C. Solvent regulation of oxygen affinity in hemoglobin. Sensitivity of bovine hemoglobin to chloride ions. J Biol Chem, 1984, 259:10841-10844.
[5]Pristoupil TI, Kramlov M, Marik T, et al. Hydrodynamic instability of “stroma-free” hemoglobin. Biomat Art Cells Art Org, 1989, 17:335-339.
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[6]Feola M, Simoni J, Tran R, et al. Mechanisms of toxicity of hemoglobin solutions. Biomat Art Cells Art Org, 1988, 16:217-226.
[7]Pearl JM, Drinkwater DC, Laks H, et al. Leukocyte-Depleted reperfusion of transplanted human hearts prevent ultrastructural evidence of reperfusion injury. Journal Surgical Reserch , 1992, 52:298-308.
[8]Mac Donald VW, Winslow RM. Oxygen delivery and myocardial function in rabbit hearts perfused with cell-free hemoglobin. J Appl Physiol, 1992, 72:476-483., 百拇医药