乳宁合剂治疗乳腺增生病的药效研究
康丕顺 何凤慈 陈亮 何双梧 王殿富
摘要 目的：对本院中药制剂乳宁合剂(Rulinmixture,RLM)治疗乳腺增生病的药效学进行研究。方法：试品采用组方中药，制成合剂，制造动物模型，灌胃给药，观察功能学、组织细胞学变化和主要的毒理学特征。结果：乳宁合剂口服可以降低雌激素和提高孕酮在大鼠血清中的浓度水平，效果显著(P<0.01，0.05)；组织细胞学观察可见乳腺体积和腺泡腔缩小，乳腺小叶和腺泡数目减少，实验1组尤其显著(P<0.05)，对幼龄大鼠体重增长率、肝肾功能、肝肾系数、血象、血清蛋白浓度均无显著影响(P>0.05)。结论：RLM治疗乳腺增生病效果显著，毒性低微，安全。
关键词：最大非致死量 最大耐受量 雌二醇 孕酮 组织细胞学 肝肾功能 血象 血浆蛋白
乳腺增生病为妇女常见病，好发于(35±5)岁年龄段，与乳腺癌病变有一定关系。本试验以中西医结合形式造成模型，对功能学、组织细胞学以及毒性等几方面进行药效学研究、评价，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料
成年家兔：(350±50)g，大鼠Wistar品系(140±15)g，小鼠KM系(20±2)g，均由本研究所动物室提供。
血细胞自动分析仪sesmax-F820，自动生化分析仪BeckmamCX4，r免疫分析仪，光镜等各1台。
戊酸雌二醇注射液(上海第九药厂产品，批号880901-123)。
供试品：本院临床用非标中药制剂，名称乳宁合剂，由柴胡、白芍、当归、川芎、丹参、香附、延胡、橘核、夏枯草、全瓜蒌、王不留行、麦芽、甘草十三味组成，共计126g，合制100ml。药材均为市售品，实验品中药全部经市药检所鉴定认可为一、二级正品。制法：草本部分铡切粉碎，快速冷水喷洒洗去尘土，沸水投料，从沸腾开始计时，共煎煮3次，分别为40，30，20min，最后压榨取汁，合并煎煮液，过滤静置12h，倾取上清液，过滤浓缩到相对密度为1.091±
, http://www.100md.com
0.001，再过滤分装成500ml/瓶，密封、扎口，0.5kg热压消毒30min供临床暂用，存放日期，暂定半年(质量标准有另文发表)。
2 方法及结果
2.1 剂量设计 分为12，10.5和5.25ml/kg，分别称第1，2，3组。
2.2 最大非致死量(MNLD)的测定[1] 选取小鼠2只为1组经扩大因素试验，观察5d，最终得60ml/(kg.d)，重复1次，60ml/(kg.d)，分3次/12h口服给药，观察7d，第1组小鼠全部存活，据此认为MNLD为60ml/(kg.d)。
2.3 最大耐受量(MTD)的测定 选取大鼠10只，断食不断饮8h，以最大浓度最大体积原则，最终用试品70ml/(kg.d)，po，qid供食供饮观察7d，未见死亡发生，遂以同样条件补作6只，观察7d也无死亡，为此共作16只大鼠，因此认为MTD为70ml/(kg.d)，相当人用量的13.33倍,即人用量为MTD的7.5%。
, http://www.100md.com
2.4 选取成年雌性大鼠[2]18只，在2%普鲁卡因局麻下摘除卵巢，3d后随机分成3组，第1，2组各po12，5.25ml/(kg.d)试品,第3组po15ml/(kg.d)生理盐水。同时第1，2，3组肌注戊酸雌二醇0.3mg/(kg.d)，隔日1次，共20针，期满处死采血，放免法测定雌激素(E2)和孕激素(P)，结果见表1。
表1 乳宁合剂对模型大鼠血清雌激素及孕激素浓度水平的影响 (x±s)
组别
n
剂量(ml/kg)
雌激素(pg/ml)
孕激素(ng/ml)
, 百拇医药
1
6
12.00
11.58±1.28c
0.14±0.01c
2
6
5.25
14.42±2.87b
0.11±0.01a
3
6
, http://www.100md.com
盐水15
14.48±1.60
0.11±0.01
观察组与对照组比较，a：P>0.05，b:P<0.05，c:P<0.012.5 选雌性家兔24只[3]，在2%普鲁卡因局麻下，手术摘除双侧卵巢，3d后随机分成3组，第1，2组各po12及5.25ml/kg,qd，第3组灌生理盐水10ml/kg，qd,同时各组im0.3mg/kg戊酸雌二醇,隔日1次,共计20针,造成模型,40d期满处死家兔，摘取乳房浸泡于10%福尔马林中固定1月,经切片等处理,光镜观察结果见表2。
表2 乳宁合剂对家兔乳腺增生病模型组织细胞学变化的影响 (x±s)
组别
n
, 百拇医药
乳腺体积(cm3)
乳腺小叶数
乳腺腺泡数
乳腺腺泡腔
1
8
0.13±0.06b
6.90±1.79b
11.67±2.17b
87.23±3.94b
2
, 百拇医药
8
0.31±0.09a
8.99±1.89a
14.42±2.37b
181.30±10.79a
3
8
0.46±0.13
10.35±2.74
15.37±3.50
202.07±25.48
, 百拇医药
观察组与盐水组比较，a：P>0.05，b：P<0.05，c：P<0.012.6 选择(33±3)g幼龄大鼠40只，雌雄各半，随机均分成4组，第1，2，3组分别po12.0，10.5，5.25ml/(kg*d)供试品,第4组po0.5ml/只生理盐水,每日8∶00～9∶00给药,每周逐组、逐只称重1次,调整剂量,4周期满,体重增长率变化见表3。
表3 乳宁合剂对幼龄大鼠体重增长率的影响(0～4周)
1
2
3
4
∑
x
140.04
, http://www.100md.com
159.60
144.46
132.76
576.86
均值
700.20
798.00
722.30
663.80
2884.30
总计
5
5
, http://www.100md.com
5
5
20
倒数
102809.54
135597.84
111360.03
92171.28
441938.69
平方和
2.7 选大鼠24只,随机分成4组，第1，2，3组分别每日灌给试品12.0，10.5，5.25ml/kg，第4组灌给生理盐水10ml/kg，30d后，全部处死采血作肝肾功能测定，摘取肝脏、肾脏作肝肾系数测定。结果表明，观察组与对照组比较无显著差别，见表4。血象及血浆蛋白检查，结果见表5。
, 百拇医药
表4 表3的方差分析结果
变异来源
变异
自由度
均方
F值
P值
总变异
25979.37
19
组间变异
417830.35
3
, 百拇医药
957.01
0.3692
>0.05
组内变异
24108.29
16
1506.77
0.3962
F0.05(3,16)8.69>0.3962，组间均数差别无显著意义
表5 乳宁合剂对大鼠肝肾功能及肝肾系数的影响(x±s,n＝6)
组别
, 百拇医药
转氨酶
(u/L)
肌肝
(μmol/L)
尿素氮
(μmol/L)
肝系数
肾系数
1
65.50±14.87
101.0±19.8
7.70±1.66
0.089±0.007
, 百拇医药
0.007±0.002
2
64.70±18.00
110.1±18.4
7.15±1.48
0.045±0.013
0.002±0.002
3
63.00±15.12
107.0±17.1
7.14±1.43
0.032±0.001
, http://www.100md.com
0.006±0.001
表6 乳宁合剂对大白鼠血象及血浆蛋白的影响(x±s)
组别
n
白细胞
(×109/L)
红细胞
(×1012/L)
血色素
(g/L)
血小板
(×109/L)
, http://www.100md.com
总蛋白
(g/L)
白蛋白
(g/L)
球蛋白
(g/L)
1
6
15.35±1.75a
3.69±2.03
160.30±15.70
502.70±211.40
, 百拇医药
47.70±6.17
27.70±7.32
46.70±11.90
2
6
12.90±4.31
1.47±2.24
156.30±24.90
167.40±266.80
70.30±5.99
36.80±4.40
35.20±8.60
, 百拇医药
3
6
16.37±4.04
1.76±2.39
177.80±18.40
457.20±188.60
75.30±5.11
36.20±7.97
39.50±9.46
4
6
12.76±1.45
, http://www.100md.com
1.88±2.14
174.00±16.10
322.30±135.40
73.00±5.98
34.00±8.84
39.00±9.98
观察组与对照组比较对血象、血浆蛋白无显著影响；但观察1组白细胞有显著升高现象，a：P<0.05讨 论
西医理论认为乳腺增生是由于孕激素不足,雌激素相对或绝对过高而引起[3],而中医认为本病类似中医乳癖(mammaryaddiction)，发病机制皆因肝、胃、冲、任经络失调所至，肝胃不和，多因思虑伤脾，恼怒伤肝，肝气不舒，郁于胃内所致，乳房疼痛生包块，常随喜怒而消长；任主胞胎，冲为血海，隶属肝肾，肝气不舒，冲任失调，经水一行，肝气舒畅，所以乳房包块及疼痛，常随月经变化而变化。中医治疗原则是取疏肝解郁，理气止痛，活血化瘀，软坚散结，调理冲任为要。乳宁合剂组方正是根据这一理论及治病原则而设计的。柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，当归、川芎活血调经，丹参活血化瘀，香附理气解郁，调经止痛，延胡活血理气止痛，橘核理气散结止痛，夏枯草清肝软坚散结，全瓜蒌宽胸散结，王不留行活血消肿，通经下乳，麦芽回乳，甘草和中。表1结果表明：剂量宜大，给药时间宜长，否则不足以纠正激素紊乱失衡状况。临床研究取得了总有效率92.8%的成效[4]。
, 百拇医药
LD50测定在新药研究中价值十分重要，但本实验经多次预试而测不出LD50实验数据，本实验除了测得大鼠MTD之外，还引入了MNLD，这不仅给实验的剂量设计提供了重要参考，而且还为今后必要的长期毒性实验剂量设计和药品标准的制定都有重要的参考价值。
剂量设计12.0，10.5，5.25ml，分别为MNLD的20%，17.5%及人用剂量外推到动物上之剂量，给药30d，未见明显毒性表现，这对试品的安全性评价有重要意义。实验1组对白细胞有明显增高现象，这对于解释临床治疗中的消炎作用可能有意义。实验结果认为乳宁合剂在乳腺增生病模型上所表现出来的治疗效果显著，毒性低微，与临床研究中的治疗效果一致。
作者单位：第三军医大学大坪医院临床药理研究室，重庆400042
参考文献
, http://www.100md.com
1 Malmfors T,Teilina A.From the taxicology laboratories,AB Astra,sodertaje,Sweden.Acta Pharmacol Toxicol,1983，52(Suppl II)∶S229
2 孙跃平,田凯. 乳腺增生的雌激素测定. 中华妇产科杂志，1989，24(3)∶177
3 段泾云,张小莉,于利森,等.乳宁抑制家兔乳腺增生的实验研究.实用中西医结合 杂志，1994，7(1)∶42
4 何双梧,王殿富.中西医结合治疗乳腺增生症540例疗效观察.实用医学杂志，1990 ，6(5)∶36, 百拇医药
摘要 目的：对本院中药制剂乳宁合剂(Rulinmixture,RLM)治疗乳腺增生病的药效学进行研究。方法：试品采用组方中药，制成合剂，制造动物模型，灌胃给药，观察功能学、组织细胞学变化和主要的毒理学特征。结果：乳宁合剂口服可以降低雌激素和提高孕酮在大鼠血清中的浓度水平，效果显著(P<0.01，0.05)；组织细胞学观察可见乳腺体积和腺泡腔缩小，乳腺小叶和腺泡数目减少，实验1组尤其显著(P<0.05)，对幼龄大鼠体重增长率、肝肾功能、肝肾系数、血象、血清蛋白浓度均无显著影响(P>0.05)。结论：RLM治疗乳腺增生病效果显著，毒性低微，安全。
关键词：最大非致死量 最大耐受量 雌二醇 孕酮 组织细胞学 肝肾功能 血象 血浆蛋白
乳腺增生病为妇女常见病，好发于(35±5)岁年龄段，与乳腺癌病变有一定关系。本试验以中西医结合形式造成模型，对功能学、组织细胞学以及毒性等几方面进行药效学研究、评价，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料
成年家兔：(350±50)g，大鼠Wistar品系(140±15)g，小鼠KM系(20±2)g，均由本研究所动物室提供。
血细胞自动分析仪sesmax-F820，自动生化分析仪BeckmamCX4，r免疫分析仪，光镜等各1台。
戊酸雌二醇注射液(上海第九药厂产品，批号880901-123)。
供试品：本院临床用非标中药制剂，名称乳宁合剂，由柴胡、白芍、当归、川芎、丹参、香附、延胡、橘核、夏枯草、全瓜蒌、王不留行、麦芽、甘草十三味组成，共计126g，合制100ml。药材均为市售品，实验品中药全部经市药检所鉴定认可为一、二级正品。制法：草本部分铡切粉碎，快速冷水喷洒洗去尘土，沸水投料，从沸腾开始计时，共煎煮3次，分别为40，30，20min，最后压榨取汁，合并煎煮液，过滤静置12h，倾取上清液，过滤浓缩到相对密度为1.091±
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0.001，再过滤分装成500ml/瓶，密封、扎口，0.5kg热压消毒30min供临床暂用，存放日期，暂定半年(质量标准有另文发表)。
2 方法及结果
2.1 剂量设计 分为12，10.5和5.25ml/kg，分别称第1，2，3组。
2.2 最大非致死量(MNLD)的测定[1] 选取小鼠2只为1组经扩大因素试验，观察5d，最终得60ml/(kg.d)，重复1次，60ml/(kg.d)，分3次/12h口服给药，观察7d，第1组小鼠全部存活，据此认为MNLD为60ml/(kg.d)。
2.3 最大耐受量(MTD)的测定 选取大鼠10只，断食不断饮8h，以最大浓度最大体积原则，最终用试品70ml/(kg.d)，po，qid供食供饮观察7d，未见死亡发生，遂以同样条件补作6只，观察7d也无死亡，为此共作16只大鼠，因此认为MTD为70ml/(kg.d)，相当人用量的13.33倍,即人用量为MTD的7.5%。
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2.4 选取成年雌性大鼠[2]18只，在2%普鲁卡因局麻下摘除卵巢，3d后随机分成3组，第1，2组各po12，5.25ml/(kg.d)试品,第3组po15ml/(kg.d)生理盐水。同时第1，2，3组肌注戊酸雌二醇0.3mg/(kg.d)，隔日1次，共20针，期满处死采血，放免法测定雌激素(E2)和孕激素(P)，结果见表1。
表1 乳宁合剂对模型大鼠血清雌激素及孕激素浓度水平的影响 (x±s)
组别
n
剂量(ml/kg)
雌激素(pg/ml)
孕激素(ng/ml)
, 百拇医药
1
6
12.00
11.58±1.28c
0.14±0.01c
2
6
5.25
14.42±2.87b
0.11±0.01a
3
6
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盐水15
14.48±1.60
0.11±0.01
观察组与对照组比较，a：P>0.05，b:P<0.05，c:P<0.012.5 选雌性家兔24只[3]，在2%普鲁卡因局麻下，手术摘除双侧卵巢，3d后随机分成3组，第1，2组各po12及5.25ml/kg,qd，第3组灌生理盐水10ml/kg，qd,同时各组im0.3mg/kg戊酸雌二醇,隔日1次,共计20针,造成模型,40d期满处死家兔，摘取乳房浸泡于10%福尔马林中固定1月,经切片等处理,光镜观察结果见表2。
表2 乳宁合剂对家兔乳腺增生病模型组织细胞学变化的影响 (x±s)
组别
n
, 百拇医药
乳腺体积(cm3)
乳腺小叶数
乳腺腺泡数
乳腺腺泡腔
1
8
0.13±0.06b
6.90±1.79b
11.67±2.17b
87.23±3.94b
2
, 百拇医药
8
0.31±0.09a
8.99±1.89a
14.42±2.37b
181.30±10.79a
3
8
0.46±0.13
10.35±2.74
15.37±3.50
202.07±25.48
, 百拇医药
观察组与盐水组比较，a：P>0.05，b：P<0.05，c：P<0.012.6 选择(33±3)g幼龄大鼠40只，雌雄各半，随机均分成4组，第1，2，3组分别po12.0，10.5，5.25ml/(kg*d)供试品,第4组po0.5ml/只生理盐水,每日8∶00～9∶00给药,每周逐组、逐只称重1次,调整剂量,4周期满,体重增长率变化见表3。
表3 乳宁合剂对幼龄大鼠体重增长率的影响(0～4周)
1
2
3
4
∑
x
140.04
, http://www.100md.com
159.60
144.46
132.76
576.86
均值
700.20
798.00
722.30
663.80
2884.30
总计
5
5
, http://www.100md.com
5
5
20
倒数
102809.54
135597.84
111360.03
92171.28
441938.69
平方和
2.7 选大鼠24只,随机分成4组，第1，2，3组分别每日灌给试品12.0，10.5，5.25ml/kg，第4组灌给生理盐水10ml/kg，30d后，全部处死采血作肝肾功能测定，摘取肝脏、肾脏作肝肾系数测定。结果表明，观察组与对照组比较无显著差别，见表4。血象及血浆蛋白检查，结果见表5。
, 百拇医药
表4 表3的方差分析结果
变异来源
变异
自由度
均方
F值
P值
总变异
25979.37
19
组间变异
417830.35
3
, 百拇医药
957.01
0.3692
>0.05
组内变异
24108.29
16
1506.77
0.3962
F0.05(3,16)8.69>0.3962，组间均数差别无显著意义
表5 乳宁合剂对大鼠肝肾功能及肝肾系数的影响(x±s,n＝6)
组别
, 百拇医药
转氨酶
(u/L)
肌肝
(μmol/L)
尿素氮
(μmol/L)
肝系数
肾系数
1
65.50±14.87
101.0±19.8
7.70±1.66
0.089±0.007
, 百拇医药
0.007±0.002
2
64.70±18.00
110.1±18.4
7.15±1.48
0.045±0.013
0.002±0.002
3
63.00±15.12
107.0±17.1
7.14±1.43
0.032±0.001
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0.006±0.001
表6 乳宁合剂对大白鼠血象及血浆蛋白的影响(x±s)
组别
n
白细胞
(×109/L)
红细胞
(×1012/L)
血色素
(g/L)
血小板
(×109/L)
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总蛋白
(g/L)
白蛋白
(g/L)
球蛋白
(g/L)
1
6
15.35±1.75a
3.69±2.03
160.30±15.70
502.70±211.40
, 百拇医药
47.70±6.17
27.70±7.32
46.70±11.90
2
6
12.90±4.31
1.47±2.24
156.30±24.90
167.40±266.80
70.30±5.99
36.80±4.40
35.20±8.60
, 百拇医药
3
6
16.37±4.04
1.76±2.39
177.80±18.40
457.20±188.60
75.30±5.11
36.20±7.97
39.50±9.46
4
6
12.76±1.45
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1.88±2.14
174.00±16.10
322.30±135.40
73.00±5.98
34.00±8.84
39.00±9.98
观察组与对照组比较对血象、血浆蛋白无显著影响；但观察1组白细胞有显著升高现象，a：P<0.05讨 论
西医理论认为乳腺增生是由于孕激素不足,雌激素相对或绝对过高而引起[3],而中医认为本病类似中医乳癖(mammaryaddiction)，发病机制皆因肝、胃、冲、任经络失调所至，肝胃不和，多因思虑伤脾，恼怒伤肝，肝气不舒，郁于胃内所致，乳房疼痛生包块，常随喜怒而消长；任主胞胎，冲为血海，隶属肝肾，肝气不舒，冲任失调，经水一行，肝气舒畅，所以乳房包块及疼痛，常随月经变化而变化。中医治疗原则是取疏肝解郁，理气止痛，活血化瘀，软坚散结，调理冲任为要。乳宁合剂组方正是根据这一理论及治病原则而设计的。柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，当归、川芎活血调经，丹参活血化瘀，香附理气解郁，调经止痛，延胡活血理气止痛，橘核理气散结止痛，夏枯草清肝软坚散结，全瓜蒌宽胸散结，王不留行活血消肿，通经下乳，麦芽回乳，甘草和中。表1结果表明：剂量宜大，给药时间宜长，否则不足以纠正激素紊乱失衡状况。临床研究取得了总有效率92.8%的成效[4]。
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LD50测定在新药研究中价值十分重要，但本实验经多次预试而测不出LD50实验数据，本实验除了测得大鼠MTD之外，还引入了MNLD，这不仅给实验的剂量设计提供了重要参考，而且还为今后必要的长期毒性实验剂量设计和药品标准的制定都有重要的参考价值。
剂量设计12.0，10.5，5.25ml，分别为MNLD的20%，17.5%及人用剂量外推到动物上之剂量，给药30d，未见明显毒性表现，这对试品的安全性评价有重要意义。实验1组对白细胞有明显增高现象，这对于解释临床治疗中的消炎作用可能有意义。实验结果认为乳宁合剂在乳腺增生病模型上所表现出来的治疗效果显著，毒性低微，与临床研究中的治疗效果一致。
作者单位：第三军医大学大坪医院临床药理研究室，重庆400042
参考文献
, http://www.100md.com
1 Malmfors T,Teilina A.From the taxicology laboratories,AB Astra,sodertaje,Sweden.Acta Pharmacol Toxicol,1983，52(Suppl II)∶S229
2 孙跃平,田凯. 乳腺增生的雌激素测定. 中华妇产科杂志，1989，24(3)∶177
3 段泾云,张小莉,于利森,等.乳宁抑制家兔乳腺增生的实验研究.实用中西医结合 杂志，1994，7(1)∶42
4 何双梧,王殿富.中西医结合治疗乳腺增生症540例疗效观察.实用医学杂志，1990 ，6(5)∶36, 百拇医药