大鼠供肝质量的快速评价方法
韩德恩 曾兆林 陈嘉薇 胡占良 张新宇 陈大志 杨维良
摘 要 目的 探讨供肝质量的快速评价方法。方法 建立大鼠酒精性肝病模型，然后取不同时期的大鼠肝组织做快速石蜡切片、普通石蜡切片和冰冻切片，观察病理改变，并行病理学综合评分，同时对肝脏进行门静脉灌洗，监测灌洗时门静脉压力及流量。结果 实验组病理学综合评分随实验时间的延长逐渐增高；快速石蜡切片的病理学综合评分与普通石蜡切片比较，差异无显著性(P>0.05)；实验组大鼠在恒定流量进行门静脉灌洗时，门静脉压力升高，与实验对照组比较，差异有显著性(P<0.05)，且门静脉压力变化与病理学综合评分呈高度正相关(r=0.819, P<0.001)。结论 快速石蜡切片与普通石蜡切片一样，可对供肝病理学改变做出准确评估；在门静脉灌洗液流量恒定的情况下，门静脉压力与供肝的病理学改变高度相关；快速石蜡切片和灌洗时门静脉压力测定相结合，能准确判断供肝质量。
关键词：肝疾病，酒精性 移植物 质量控制
, 百拇医药
对来自尸体的供肝质量做出快速评价，能显著降低原发性肝移植物无功能的发生率。本研究通过建立大鼠酒精性肝病(ALD)的动物模型[1]，探讨快速评价供肝质量的方法。报告如下。
资料与方法
雄性Wistar大鼠70只，体重(250±30)g，随机分成正常对照组(10只)、实验对照组(30只)和实验组(30只)。正常对照组投颗粒饲料，正常饮水；实验组与实验对照组60只大鼠全部手术置入长期胃造瘘管，除给予与正常对照组相同的颗粒饲料外，实验组大鼠按(10±2)g.kg-1.d-1通过胃管注入体积分数为40%的食用乙醇；实验对照组用等热量的葡萄糖代替乙醇，其余同实验组。
实验组与实验对照组分组配对观察酒精性肝损伤的过程，每个组根据饲喂乙醇(葡萄糖)的时间4周、12周、16周再各分成3个组，每组10只大鼠。
, 百拇医药
实验组分别于饲喂4、12和16周在麻醉下开腹，取大小为1.5cm×1.5cm×0.4cm的肝中叶组织，分别作冰冻切片、普通石蜡切片与快速石蜡切片。(1)冰冻切片：取0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的新鲜肝组织，置于冰冻切片机房内快速冷冻，切成6～7μm厚的组织切片，HE染色，光镜观察。此过程约需30min。(2)快速石蜡切片：取0.2cm×0.2cm×0.2cm大小的新鲜肝组织，滤纸包裹后用体积分数为95%的乙醇固定，置于人体快速组织处理仪上处理30min，然后更换为丙酮液，再置于处理仪上处理30min，更换为硬脂酸石蜡液，置于人体快速组织处理仪上1h，取出，石蜡包埋，切成厚约4～5μm的切片，HE染色，光镜观察。此过程约需3h。(3)普通石蜡切片：将大小为0.8cm×0.8cm×0.4cm的肝组织块置于自动脱水包埋机上，处置24h后制作石蜡块，切片，HE染色，光镜观察。此过程约需30h。对切片进行观察时，依据文献[1，2]的标准进行病理综合评分。
上述操作完成后，肝断面结扎止血，由下腔静脉注入肝素生理盐水2ml(含肝素25U/ml)，经肠系膜上静脉刺入直径1.2mm细针直至门静脉，肝周放冰屑。钳夹肝上下腔静脉、肝动脉、胃幽门静脉与食管周围交通支，剪开肝上下腔静脉，用容量输液泵以0～4℃的生理盐水灌洗门静脉(恒定流量，10ml/min)。门静脉穿刺针旁接压力换能器，连接生理记录仪，记录灌洗时门静脉内的压力。
, http://www.100md.com
实验对照组按配对的相同时间，完成上述实验过程。
结 果
正常对照组在不同观察时期内，肝表面均光滑，边缘锐利，颜色红润，质地柔软。实验组中4周时的肝外观与对照组相似，12周时有7只大鼠的肝脏轻度肿大，色略苍白，质地尚软，16周时的大鼠肝脏明显肿大，色灰白，质地韧。快速石蜡切片显示，实验组4周时出现轻度肝脂肪变性，12周与16周时为中、重度脂肪变性，70%切片可见细胞坏死，并随着时间的延长，出现灶状坏死，甚至桥接样坏死，大部分肝组织有不同程度的单核细胞与多核细胞浸润，16周组出现明显的肝纤维化。由于冰冻切片不能观察肝细胞的形态，因此难以区分肝细胞变性与坏死的程度。普通石蜡切片在观察大鼠酒精性肝病变时，其病理综合评分与快速石蜡切片比较，差异无显著性(表1)。
表1 快速石蜡切片与普通石蜡切片的病理学综合评分结果
切片方法
, 百拇医药
不同时间的病理学综合评分
4周
12周
16周
普通石蜡切片
3.875±0.378
(n=10)
9.143±1.210
(n=8)
10.429±1.272
(n=7)
快速石蜡切片
, 百拇医药
3.714±0.756
(n=10)
9.000±1.000
(n=8)
10.714±1.704
(n=7)
P 值
>0.05
>0.05
>0.05
行门静脉灌洗时，门静脉内的压力见表2。正常对照组大鼠的门静脉压力为(15.00±1.58)mmHg，与实验对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。实验组门静脉压力与组织学综合评分呈高度正相关(r=0.819, P<0.001)。
, http://www.100md.com
表2 实验组与实验对照组大鼠门静脉灌洗时的门静脉压力(X±s)
组 别
不同时间组的门静脉压力(mmHg)
4周
12周
16周
实验组
18.38±1.65
(n=10)
22.43±1.58
(n=8)
29.93±1.58
, 百拇医药
(n=7)
实验对照组
15.38±1.26
(n=10)
15.12±1.38
(n=8)
15.40±1.63
(n=7)
P 值
<0.05
<0.05
<0.05
, 百拇医药
讨 论
一、本研究的意义
我们利用ALD大鼠做动物模型的原因主要是ALD能提供多种肝脏的常见病变，如变性、坏死、脂肪样变性、肝纤维化等，而这些病变比较接近人肝的常见病理改变。
术中切取供肝做活组织病理检查是判断供肝质量的可靠方法[3-6]。实践证明，快速石蜡切片克服了普通石蜡切片费时长的缺点，同样能较准确地反映肝组织的真实情况。但肝活组织病理检查存在取材的局限性与病变的不均一性问题，若对供肝多点取材，必然造成多处创伤，这将为术后发生并发症埋下隐患。因此，临床上应避免利用多点取材做活组织病理检查。
有研究证实[7]，门静脉内的压力与肝组织的病变程度有关，即肝细胞的变性、坏死及汇管区的纤维化等组织学改变均能改变肝内门静脉系统的形态结构，使血流阻力增加，导致门静脉压力升高。当对这样的肝脏进行门静脉灌洗时，其门静脉压力肯定会升高。因此，当我们进行门静脉灌洗时，监测门静脉内压力(或流量)，可了解肝内门静脉管道系统结构的改变，从另外一个角度判断供肝质量的好坏。如果把门静脉压力监测与快速石蜡切片检查相结合，能更全面地反映供肝的质量。
, http://www.100md.com
近两年来，我们将这个质量评价方法应用于3例临床肝移植，结果提示该方法能较好地评价供肝质量，对临床肝移植有指导意义。我们临床应用的经验是，应用上述灌洗装置，维持灌洗压为58～75mmHg，保持其流量为100～110ml/min是适合的，如果灌洗压很高尚不能维持这个流量，那么说明这个供肝质量不佳而应放弃。这3例中有1例灌洗压力超过112.5mmHg，而流量只有85ml/min，移植后受者出现原发性移植肝无功能，术后不足24h即死亡。值得注意的是，这例快速石蜡切片病理检查结果提示供肝质量一般。
二、质量判定要点
(1)首先观察肝脏的大体形态，若柔软、紫红色、边缘锐，这样的肝脏应认为是“好肝”；(2)供肝门静脉灌洗时压力(或流量)的监测与病理诊断比较，前者更具否定意义，即好的供肝应灌洗流畅，压力不高，如果灌洗中发现压力高或流量低，灌洗后肝脏变白不均匀，有块状瘀斑，无论其后的病理检查结果如何，应认为供肝质量不好；(3)肝脏活组织检查切取的组织块不应小于0.5cm×0.5cm×0.5cm，如果快速病理活组织检查发现如下所述，应视该供肝不适于移植：重度脂肪浸润成大泡状脂肪变性，肝小叶中央或全小叶坏死、水肿、退行性变及明显纤维化[8-10]。
, 百拇医药
本方法评价供肝质量方便快捷，灌洗及病理报告在供者手术开始后3.5h内即可完成，建议在供肝质量评价完成后再启动受者手术。如果把受者麻醉、体外转流、病肝切除等操作时间全部考虑在内，供肝在切取保存后7～8h内一般可完成血管吻合，恢复血流，对供肝质量的影响不大。
基金项目：黑龙江省科委九五攻关课题基金资助项目(G96C19-8-01)
韩德恩(Email：xhw@263.net)
作者单位：曾兆林(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
胡占良(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
张新宇(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
陈大志(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
, http://www.100md.com
杨维良(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
陈嘉薇(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院病理科)
参考文献
[1]Tsukamoto H, French SW, Benwon N, et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology, 1985, 5:224-232.
[2]赵静波, 王泰龄, 张道明, 等. 嗜酒者肝脏病变的形态学研究. 中华病理学杂志, 1994, 23:14-16.
, 百拇医药
[3]Makowka L, Gordon RD, Toto S, et al. Analysis of donor criteria for the prediction of donor criteria for the prediction of outcome in clinical liver transplantation. Transplant Proc, 1987, 19:2378-2382.
[4]Markin RS, Wood RP, Stratta RJ, et al. Pretictive value of intraoperative liver biopsies of donor organs in patients undergoing orthotopic transplantation. Transplant Proc, 1990, 22:418-419.
[5]Alessandro AM, Kalayoglu M, Sollinger HW, et al. The predictive value of donor liver biopsies for the development of primary nonfunction after orthotopic liver transplantation. Transplantation, 1991, 51:157-163.
, http://www.100md.com
[6]Michael JG, James CBS, Thomas T, et al. Predictive value of intraoperative biopsies and liver function tests for preservation injury orthotopic liver transplantation. Hepatology, 1997, 25:184-189.
[7]吴志勇，黄安，邝耀麟，等. 鼠肝硬变形成中肝脏病理变化和门静脉压力的关系. 中华外科杂志，1990，28：147.
[8]Thomas M，Fishbein M，Isabel S，et al. Use of liver with microvesi-cular fat safely expands the donor pool. Transplantation, 1997, 64:248-251.
[9]Tosiyuki, Kitai, Bertrand B, et al. Optical determination of fatty change of the graft liver with near-infrared time-resolved spectroscopy. Transplantation, 1996, 62:642-647.
[10]Adam R, Reynes M, Tohan M, et al. The outcome of steatotic graft in liver transplantation. Transplant Proc, 1991, 23:1538-1540., 百拇医药
摘 要 目的 探讨供肝质量的快速评价方法。方法 建立大鼠酒精性肝病模型，然后取不同时期的大鼠肝组织做快速石蜡切片、普通石蜡切片和冰冻切片，观察病理改变，并行病理学综合评分，同时对肝脏进行门静脉灌洗，监测灌洗时门静脉压力及流量。结果 实验组病理学综合评分随实验时间的延长逐渐增高；快速石蜡切片的病理学综合评分与普通石蜡切片比较，差异无显著性(P>0.05)；实验组大鼠在恒定流量进行门静脉灌洗时，门静脉压力升高，与实验对照组比较，差异有显著性(P<0.05)，且门静脉压力变化与病理学综合评分呈高度正相关(r=0.819, P<0.001)。结论 快速石蜡切片与普通石蜡切片一样，可对供肝病理学改变做出准确评估；在门静脉灌洗液流量恒定的情况下，门静脉压力与供肝的病理学改变高度相关；快速石蜡切片和灌洗时门静脉压力测定相结合，能准确判断供肝质量。
关键词：肝疾病，酒精性 移植物 质量控制
, 百拇医药
对来自尸体的供肝质量做出快速评价，能显著降低原发性肝移植物无功能的发生率。本研究通过建立大鼠酒精性肝病(ALD)的动物模型[1]，探讨快速评价供肝质量的方法。报告如下。
资料与方法
雄性Wistar大鼠70只，体重(250±30)g，随机分成正常对照组(10只)、实验对照组(30只)和实验组(30只)。正常对照组投颗粒饲料，正常饮水；实验组与实验对照组60只大鼠全部手术置入长期胃造瘘管，除给予与正常对照组相同的颗粒饲料外，实验组大鼠按(10±2)g.kg-1.d-1通过胃管注入体积分数为40%的食用乙醇；实验对照组用等热量的葡萄糖代替乙醇，其余同实验组。
实验组与实验对照组分组配对观察酒精性肝损伤的过程，每个组根据饲喂乙醇(葡萄糖)的时间4周、12周、16周再各分成3个组，每组10只大鼠。
, 百拇医药
实验组分别于饲喂4、12和16周在麻醉下开腹，取大小为1.5cm×1.5cm×0.4cm的肝中叶组织，分别作冰冻切片、普通石蜡切片与快速石蜡切片。(1)冰冻切片：取0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的新鲜肝组织，置于冰冻切片机房内快速冷冻，切成6～7μm厚的组织切片，HE染色，光镜观察。此过程约需30min。(2)快速石蜡切片：取0.2cm×0.2cm×0.2cm大小的新鲜肝组织，滤纸包裹后用体积分数为95%的乙醇固定，置于人体快速组织处理仪上处理30min，然后更换为丙酮液，再置于处理仪上处理30min，更换为硬脂酸石蜡液，置于人体快速组织处理仪上1h，取出，石蜡包埋，切成厚约4～5μm的切片，HE染色，光镜观察。此过程约需3h。(3)普通石蜡切片：将大小为0.8cm×0.8cm×0.4cm的肝组织块置于自动脱水包埋机上，处置24h后制作石蜡块，切片，HE染色，光镜观察。此过程约需30h。对切片进行观察时，依据文献[1，2]的标准进行病理综合评分。
上述操作完成后，肝断面结扎止血，由下腔静脉注入肝素生理盐水2ml(含肝素25U/ml)，经肠系膜上静脉刺入直径1.2mm细针直至门静脉，肝周放冰屑。钳夹肝上下腔静脉、肝动脉、胃幽门静脉与食管周围交通支，剪开肝上下腔静脉，用容量输液泵以0～4℃的生理盐水灌洗门静脉(恒定流量，10ml/min)。门静脉穿刺针旁接压力换能器，连接生理记录仪，记录灌洗时门静脉内的压力。
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实验对照组按配对的相同时间，完成上述实验过程。
结 果
正常对照组在不同观察时期内，肝表面均光滑，边缘锐利，颜色红润，质地柔软。实验组中4周时的肝外观与对照组相似，12周时有7只大鼠的肝脏轻度肿大，色略苍白，质地尚软，16周时的大鼠肝脏明显肿大，色灰白，质地韧。快速石蜡切片显示，实验组4周时出现轻度肝脂肪变性，12周与16周时为中、重度脂肪变性，70%切片可见细胞坏死，并随着时间的延长，出现灶状坏死，甚至桥接样坏死，大部分肝组织有不同程度的单核细胞与多核细胞浸润，16周组出现明显的肝纤维化。由于冰冻切片不能观察肝细胞的形态，因此难以区分肝细胞变性与坏死的程度。普通石蜡切片在观察大鼠酒精性肝病变时，其病理综合评分与快速石蜡切片比较，差异无显著性(表1)。
表1 快速石蜡切片与普通石蜡切片的病理学综合评分结果
切片方法
, 百拇医药
不同时间的病理学综合评分
4周
12周
16周
普通石蜡切片
3.875±0.378
(n=10)
9.143±1.210
(n=8)
10.429±1.272
(n=7)
快速石蜡切片
, 百拇医药
3.714±0.756
(n=10)
9.000±1.000
(n=8)
10.714±1.704
(n=7)
P 值
>0.05
>0.05
>0.05
行门静脉灌洗时，门静脉内的压力见表2。正常对照组大鼠的门静脉压力为(15.00±1.58)mmHg，与实验对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。实验组门静脉压力与组织学综合评分呈高度正相关(r=0.819, P<0.001)。
, http://www.100md.com
表2 实验组与实验对照组大鼠门静脉灌洗时的门静脉压力(X±s)
组 别
不同时间组的门静脉压力(mmHg)
4周
12周
16周
实验组
18.38±1.65
(n=10)
22.43±1.58
(n=8)
29.93±1.58
, 百拇医药
(n=7)
实验对照组
15.38±1.26
(n=10)
15.12±1.38
(n=8)
15.40±1.63
(n=7)
P 值
<0.05
<0.05
<0.05
, 百拇医药
讨 论
一、本研究的意义
我们利用ALD大鼠做动物模型的原因主要是ALD能提供多种肝脏的常见病变，如变性、坏死、脂肪样变性、肝纤维化等，而这些病变比较接近人肝的常见病理改变。
术中切取供肝做活组织病理检查是判断供肝质量的可靠方法[3-6]。实践证明，快速石蜡切片克服了普通石蜡切片费时长的缺点，同样能较准确地反映肝组织的真实情况。但肝活组织病理检查存在取材的局限性与病变的不均一性问题，若对供肝多点取材，必然造成多处创伤，这将为术后发生并发症埋下隐患。因此，临床上应避免利用多点取材做活组织病理检查。
有研究证实[7]，门静脉内的压力与肝组织的病变程度有关，即肝细胞的变性、坏死及汇管区的纤维化等组织学改变均能改变肝内门静脉系统的形态结构，使血流阻力增加，导致门静脉压力升高。当对这样的肝脏进行门静脉灌洗时，其门静脉压力肯定会升高。因此，当我们进行门静脉灌洗时，监测门静脉内压力(或流量)，可了解肝内门静脉管道系统结构的改变，从另外一个角度判断供肝质量的好坏。如果把门静脉压力监测与快速石蜡切片检查相结合，能更全面地反映供肝的质量。
, http://www.100md.com
近两年来，我们将这个质量评价方法应用于3例临床肝移植，结果提示该方法能较好地评价供肝质量，对临床肝移植有指导意义。我们临床应用的经验是，应用上述灌洗装置，维持灌洗压为58～75mmHg，保持其流量为100～110ml/min是适合的，如果灌洗压很高尚不能维持这个流量，那么说明这个供肝质量不佳而应放弃。这3例中有1例灌洗压力超过112.5mmHg，而流量只有85ml/min，移植后受者出现原发性移植肝无功能，术后不足24h即死亡。值得注意的是，这例快速石蜡切片病理检查结果提示供肝质量一般。
二、质量判定要点
(1)首先观察肝脏的大体形态，若柔软、紫红色、边缘锐，这样的肝脏应认为是“好肝”；(2)供肝门静脉灌洗时压力(或流量)的监测与病理诊断比较，前者更具否定意义，即好的供肝应灌洗流畅，压力不高，如果灌洗中发现压力高或流量低，灌洗后肝脏变白不均匀，有块状瘀斑，无论其后的病理检查结果如何，应认为供肝质量不好；(3)肝脏活组织检查切取的组织块不应小于0.5cm×0.5cm×0.5cm，如果快速病理活组织检查发现如下所述，应视该供肝不适于移植：重度脂肪浸润成大泡状脂肪变性，肝小叶中央或全小叶坏死、水肿、退行性变及明显纤维化[8-10]。
, 百拇医药
本方法评价供肝质量方便快捷，灌洗及病理报告在供者手术开始后3.5h内即可完成，建议在供肝质量评价完成后再启动受者手术。如果把受者麻醉、体外转流、病肝切除等操作时间全部考虑在内，供肝在切取保存后7～8h内一般可完成血管吻合，恢复血流，对供肝质量的影响不大。
基金项目：黑龙江省科委九五攻关课题基金资助项目(G96C19-8-01)
韩德恩(Email：xhw@263.net)
作者单位：曾兆林(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
胡占良(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
张新宇(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
陈大志(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
, http://www.100md.com
杨维良(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院外科)
陈嘉薇(150086 哈尔滨医科大学附属第二医院病理科)
参考文献
[1]Tsukamoto H, French SW, Benwon N, et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology, 1985, 5:224-232.
[2]赵静波, 王泰龄, 张道明, 等. 嗜酒者肝脏病变的形态学研究. 中华病理学杂志, 1994, 23:14-16.
, 百拇医药
[3]Makowka L, Gordon RD, Toto S, et al. Analysis of donor criteria for the prediction of donor criteria for the prediction of outcome in clinical liver transplantation. Transplant Proc, 1987, 19:2378-2382.
[4]Markin RS, Wood RP, Stratta RJ, et al. Pretictive value of intraoperative liver biopsies of donor organs in patients undergoing orthotopic transplantation. Transplant Proc, 1990, 22:418-419.
[5]Alessandro AM, Kalayoglu M, Sollinger HW, et al. The predictive value of donor liver biopsies for the development of primary nonfunction after orthotopic liver transplantation. Transplantation, 1991, 51:157-163.
, http://www.100md.com
[6]Michael JG, James CBS, Thomas T, et al. Predictive value of intraoperative biopsies and liver function tests for preservation injury orthotopic liver transplantation. Hepatology, 1997, 25:184-189.
[7]吴志勇，黄安，邝耀麟，等. 鼠肝硬变形成中肝脏病理变化和门静脉压力的关系. 中华外科杂志，1990，28：147.
[8]Thomas M，Fishbein M，Isabel S，et al. Use of liver with microvesi-cular fat safely expands the donor pool. Transplantation, 1997, 64:248-251.
[9]Tosiyuki, Kitai, Bertrand B, et al. Optical determination of fatty change of the graft liver with near-infrared time-resolved spectroscopy. Transplantation, 1996, 62:642-647.
[10]Adam R, Reynes M, Tohan M, et al. The outcome of steatotic graft in liver transplantation. Transplant Proc, 1991, 23:1538-1540., 百拇医药