猪囊虫病疫苗生产用工程菌菌种的稳定性观察
唐雨德 顾志香 刘玉 郁兴明 翟春生
摘 要：目的 探讨猪囊虫病疫苗生产用工程菌菌种在传代过程中及不同保存条件下的稳定性。方法 对工程菌菌种按规程进行了52代传代及不同条件下保存，检测菌种的质粒、表达量、免疫学活性等方面的变化。结果 经52代传代，工程菌及其菌落形态结构及质粒DNA电泳与原始菌种一致，SDS-PAGE电泳显示分子量为60kD，其表达量约占菌体总蛋白的19%～24%，免疫学活性为4.0×103～1.6×104/mg，与原代菌种基本一致。菌种在4℃、-20℃、-30℃、-70℃下保存，菌种稳定性不一致，-70℃最稳定，-20℃最差。结论 猪囊虫病基因工程疫苗生产用工程菌菌种经52次人工传代和-70℃保存，其各种特性是稳定的。
关键词：猪囊虫病 基因工程疫苗 稳定性
, 百拇医药
猪囊虫病基因工程疫苗是预防猪囊虫病的一种新型生物制剂，由猪带绦虫六钩蚴重组抗原与ISCOM基质结合而成，目前已进入区域性试验阶段，有望进一步推广应用。为了适应该疫苗扩大生产及确保生产用菌种的稳定性，我们对该工程菌菌种进行52代人工传代和不同条件下保存试验，并进入了必要的检测，现将试验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌种 猪囊虫病疫苗生产用工程菌由翟春生等[1]构建，含猪带绦虫六钩蚴保护性抗原基因，原核表达载体PGEX-4T-2质粒含Amp抗性和tac启动子，宿主菌为大肠杆菌TG1。
1.2 菌种传代方法 在含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的LB琼脂平板上划线传代，37℃培养18h后挑选单个菌落继续划板，每传1次计作1个代次，连传52代，中间每10～20代次检测1次。
1.3 不同保存条件 原代培养菌种悬于30%甘油中，分别于-20℃、-30℃、-70℃保存或穿刺接种于软琼脂中37℃培养3～4h后4℃保存。1、3、6、10、15个月后取出，分别划平板37℃培养18h。
, 百拇医药
1.4 检测方法
1.4.1 形态观察 菌种接种于含100μg/ml Amp的固体培养基，37℃培养16h，观察菌落的大小、形态等，同时按常规制片并进行革兰氏染色，光镜下观察。
1.4.2 质粒DNA检查 固体培养的菌种，均随机挑选数个菌落，分别接种于含100μg/ml Amp的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600＝1.0时加氯霉素使终浓度为170μg/ml，继续培养10～12h。收集菌体，按碱裂解方法提取质粒DNA[2]、ECOR1酶切，按常规进行DNA琼脂糖电泳。
1.4.3 夹心ELISA 采用夹心ELISA检测重组六钩蚴抗原的免疫活性。固体培养的菌种，均随机挑选3个菌落分别接种于含100μg/ml Amp、1%乳糖的LB培养液中，37℃振荡培养16h，按文献[3]介绍的方法提取包涵体，并进行裂解及蛋白复性，测复性蛋白浓度和抗原ELISA效价。
, 百拇医药
1.4.4 SDS-PAGE电泳 分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电泳先60V 30min，后100V 3～4h，0.2%考马斯亮蓝R250染色。
2 结果与讨论
2.1 不同代次菌种的检测
2.1.1 形态观察 原始菌株经含100μg/ml Amp的固体培养基中传代52代，菌落呈典型的大肠杆菌集落，直径2～3mm、圆型隆起、边缘整齐、透明、光滑型菌落，革兰氏染色镜下见细菌为革兰氏阴性菌，短杆状，形态均一。这些与原代菌种是一致的。
2.1.2 质粒DNA检查 原代菌种、20代、40代、52代菌种质粒分别经ECOR1酶切后，1%琼脂糖电泳结果一致，分别为800bp和4.9kb的两条电泳带，与构建时酶切图谱一致，说明经不同传代后工程菌保留原重组质粒。
, 百拇医药
2.1.3 重组六钩蚴抗原ELISA效价 不同代次的菌种，随机挑选其中三个菌落进行扩增，包涵体的裂解液经复性后测抗原ELISA效价，其结果见表1。
表1 不同代次菌种表达产物的ELISA效价
Table 1 The ELISA titres of the expression production for the bacteria of the different generation
菌落
the colonies
原代
the original
generation
, 百拇医药
20代
the twentieth
generation
40代
the fortieth
generation
52代
the fifty-second
generation
1
8.0×103
104
, 百拇医药
4.0×103
1.6×104
2
104
8.0×103
8.0×103
8.0×103
3
104
1.6×104
8.0×103
, 百拇医药
8.0×103
从表1可知，原代菌种及经20代、40代、52代次传代的菌种，其三个菌落的重组六钩蚴抗原的ELISA效价相近，无明显差异。这说明工程菌菌种的基因表达也比较稳定。
2.1.4 SDS-PAGE电泳 在分子量约60kd处见占菌体蛋白总量19%～24%的表达带，取3个菌落的平均值，凝胶扫描结果为：原代21.9%，20代19.5%，40代22.3%，52代21.5%。可见各代次及各菌落之间的表达无明显差异。
2.2 不同保存条件的检测 表2所示为不同保存条件下的质粒稳定性的检测结果，每一保存条件各检测10个单个菌落，结果发现-20℃保存1个月就有质粒丢失，4℃、-30℃保存3个月也有一定数量的质粒丢失，4℃、-20℃及-30℃保存至10个月质粒丢失率分别达4/10、5/10和8/10，而-70℃保存15个月也未发现质粒丢失。虽然不同保存条件对工程菌重组质粒稳定性的影响较大，但表3的结果显示，只要含有重组质粒，不同保存条件对工程菌的基因表达无明显影响。 表2 不同保存条件下的质粒稳定性
, 百拇医药
Table 2 The plasmid stablity in the different preserved condition
保存时间(月)
the preserved
time (months)
1
one
3
three
6
six
10
, 百拇医药
ten
15
fifteen
4℃
10/10
8/10
8/10
4/10
未测
-20℃
9/10
8/10
6/10
, http://www.100md.com
5/10
5/10
-30℃
10/10
9/10
9/10
8/10
8/10
-70℃
10/10
10/10
10/10
10/10
, 百拇医药
10/10
表3 不同保存条件下抗原ELISA效价和表达量的检测
Table 3 The ELISA titres and expression levels of the recombinant antigen in the different preserved condition
保存时间(月)
the preserved
time (months)
1
one
3
, 百拇医药 three
6
six
10
ten
15
fifteen
4℃
4.0×103/20.6
4.0×103/22.3
4.0×103/21.5
4.0×103/19.8
, 百拇医药
4.0×103/20.5
-20℃
4.0×103/20.2
4.0×103/21.4
4.0×103/23.5
4.0×103/21.2
4.0×103/24.0
-30℃
4.0×103/23.3
4.0×103/20.8
, http://www.100md.com
4.0×103/21.0
4.0×103/20.5
4.0×103/18.8
-70℃
4.0×103/23.4
4.0×103/23.4
4.0×103/19.5
4.0×103/22.0
4.0×103/20.0
, 百拇医药
注：表中数据前为ELISA效价，后为表达量(%)
工程菌菌种稳定性是基因工程疫苗产品中关键的一环，直接关系到疫苗的质量及生产成本，且国内外对生物技术产品的菌种库也有比较严格的质控标准[4]。本文发现，猪囊虫病基因工程疫苗区域性试验所用的工程菌可稳定携带外源基因至52次人工传代，其生物学性状、外源基因表达及质粒内切酶图谱不变，同时在-70℃保存也能较好保留其遗传稳定性。
唐雨德(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
顾志香(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
刘玉(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
郁兴明(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
, 百拇医药
翟春生(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
参考文献
1，翟春生，唐雨德，顾志香.猪带绦虫六钩蚴抗原基因的克隆与表达〔J〕.中国兽医学报，1997，17(5)∶470.
2，J.萨姆布鲁克等著，金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南〔M〕.第2版，北京：科学出版社，1993，19.
3，唐雨德，顾志香，翟春生，等.以包涵体形式表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原的复性与纯化〔J〕.中国兽医科技，1999，29(8)∶13.
4，中华人民共和国农业部.兽用生物制品制造及检验规程〔S〕.1992., http://www.100md.com
摘 要：目的 探讨猪囊虫病疫苗生产用工程菌菌种在传代过程中及不同保存条件下的稳定性。方法 对工程菌菌种按规程进行了52代传代及不同条件下保存，检测菌种的质粒、表达量、免疫学活性等方面的变化。结果 经52代传代，工程菌及其菌落形态结构及质粒DNA电泳与原始菌种一致，SDS-PAGE电泳显示分子量为60kD，其表达量约占菌体总蛋白的19%～24%，免疫学活性为4.0×103～1.6×104/mg，与原代菌种基本一致。菌种在4℃、-20℃、-30℃、-70℃下保存，菌种稳定性不一致，-70℃最稳定，-20℃最差。结论 猪囊虫病基因工程疫苗生产用工程菌菌种经52次人工传代和-70℃保存，其各种特性是稳定的。
关键词：猪囊虫病 基因工程疫苗 稳定性
, 百拇医药
猪囊虫病基因工程疫苗是预防猪囊虫病的一种新型生物制剂，由猪带绦虫六钩蚴重组抗原与ISCOM基质结合而成，目前已进入区域性试验阶段，有望进一步推广应用。为了适应该疫苗扩大生产及确保生产用菌种的稳定性，我们对该工程菌菌种进行52代人工传代和不同条件下保存试验，并进入了必要的检测，现将试验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌种 猪囊虫病疫苗生产用工程菌由翟春生等[1]构建，含猪带绦虫六钩蚴保护性抗原基因，原核表达载体PGEX-4T-2质粒含Amp抗性和tac启动子，宿主菌为大肠杆菌TG1。
1.2 菌种传代方法 在含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的LB琼脂平板上划线传代，37℃培养18h后挑选单个菌落继续划板，每传1次计作1个代次，连传52代，中间每10～20代次检测1次。
1.3 不同保存条件 原代培养菌种悬于30%甘油中，分别于-20℃、-30℃、-70℃保存或穿刺接种于软琼脂中37℃培养3～4h后4℃保存。1、3、6、10、15个月后取出，分别划平板37℃培养18h。
, 百拇医药
1.4 检测方法
1.4.1 形态观察 菌种接种于含100μg/ml Amp的固体培养基，37℃培养16h，观察菌落的大小、形态等，同时按常规制片并进行革兰氏染色，光镜下观察。
1.4.2 质粒DNA检查 固体培养的菌种，均随机挑选数个菌落，分别接种于含100μg/ml Amp的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600＝1.0时加氯霉素使终浓度为170μg/ml，继续培养10～12h。收集菌体，按碱裂解方法提取质粒DNA[2]、ECOR1酶切，按常规进行DNA琼脂糖电泳。
1.4.3 夹心ELISA 采用夹心ELISA检测重组六钩蚴抗原的免疫活性。固体培养的菌种，均随机挑选3个菌落分别接种于含100μg/ml Amp、1%乳糖的LB培养液中，37℃振荡培养16h，按文献[3]介绍的方法提取包涵体，并进行裂解及蛋白复性，测复性蛋白浓度和抗原ELISA效价。
, 百拇医药
1.4.4 SDS-PAGE电泳 分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电泳先60V 30min，后100V 3～4h，0.2%考马斯亮蓝R250染色。
2 结果与讨论
2.1 不同代次菌种的检测
2.1.1 形态观察 原始菌株经含100μg/ml Amp的固体培养基中传代52代，菌落呈典型的大肠杆菌集落，直径2～3mm、圆型隆起、边缘整齐、透明、光滑型菌落，革兰氏染色镜下见细菌为革兰氏阴性菌，短杆状，形态均一。这些与原代菌种是一致的。
2.1.2 质粒DNA检查 原代菌种、20代、40代、52代菌种质粒分别经ECOR1酶切后，1%琼脂糖电泳结果一致，分别为800bp和4.9kb的两条电泳带，与构建时酶切图谱一致，说明经不同传代后工程菌保留原重组质粒。
, 百拇医药
2.1.3 重组六钩蚴抗原ELISA效价 不同代次的菌种，随机挑选其中三个菌落进行扩增，包涵体的裂解液经复性后测抗原ELISA效价，其结果见表1。
表1 不同代次菌种表达产物的ELISA效价
Table 1 The ELISA titres of the expression production for the bacteria of the different generation
菌落
the colonies
原代
the original
generation
, 百拇医药
20代
the twentieth
generation
40代
the fortieth
generation
52代
the fifty-second
generation
1
8.0×103
104
, 百拇医药
4.0×103
1.6×104
2
104
8.0×103
8.0×103
8.0×103
3
104
1.6×104
8.0×103
, 百拇医药
8.0×103
从表1可知，原代菌种及经20代、40代、52代次传代的菌种，其三个菌落的重组六钩蚴抗原的ELISA效价相近，无明显差异。这说明工程菌菌种的基因表达也比较稳定。
2.1.4 SDS-PAGE电泳 在分子量约60kd处见占菌体蛋白总量19%～24%的表达带，取3个菌落的平均值，凝胶扫描结果为：原代21.9%，20代19.5%，40代22.3%，52代21.5%。可见各代次及各菌落之间的表达无明显差异。
2.2 不同保存条件的检测 表2所示为不同保存条件下的质粒稳定性的检测结果，每一保存条件各检测10个单个菌落，结果发现-20℃保存1个月就有质粒丢失，4℃、-30℃保存3个月也有一定数量的质粒丢失，4℃、-20℃及-30℃保存至10个月质粒丢失率分别达4/10、5/10和8/10，而-70℃保存15个月也未发现质粒丢失。虽然不同保存条件对工程菌重组质粒稳定性的影响较大，但表3的结果显示，只要含有重组质粒，不同保存条件对工程菌的基因表达无明显影响。 表2 不同保存条件下的质粒稳定性
, 百拇医药
Table 2 The plasmid stablity in the different preserved condition
保存时间(月)
the preserved
time (months)
1
one
3
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6
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10
, 百拇医药
ten
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4℃
10/10
8/10
8/10
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未测
-20℃
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, http://www.100md.com
5/10
5/10
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9/10
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-70℃
10/10
10/10
10/10
10/10
, 百拇医药
10/10
表3 不同保存条件下抗原ELISA效价和表达量的检测
Table 3 The ELISA titres and expression levels of the recombinant antigen in the different preserved condition
保存时间(月)
the preserved
time (months)
1
one
3
, 百拇医药 three
6
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15
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4℃
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, 百拇医药
4.0×103/20.5
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4.0×103/23.5
4.0×103/21.2
4.0×103/24.0
-30℃
4.0×103/23.3
4.0×103/20.8
, http://www.100md.com
4.0×103/21.0
4.0×103/20.5
4.0×103/18.8
-70℃
4.0×103/23.4
4.0×103/23.4
4.0×103/19.5
4.0×103/22.0
4.0×103/20.0
, 百拇医药
注：表中数据前为ELISA效价，后为表达量(%)
工程菌菌种稳定性是基因工程疫苗产品中关键的一环，直接关系到疫苗的质量及生产成本，且国内外对生物技术产品的菌种库也有比较严格的质控标准[4]。本文发现，猪囊虫病基因工程疫苗区域性试验所用的工程菌可稳定携带外源基因至52次人工传代，其生物学性状、外源基因表达及质粒内切酶图谱不变，同时在-70℃保存也能较好保留其遗传稳定性。
唐雨德(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
顾志香(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
刘玉(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
郁兴明(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
, 百拇医药
翟春生(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
参考文献
1，翟春生，唐雨德，顾志香.猪带绦虫六钩蚴抗原基因的克隆与表达〔J〕.中国兽医学报，1997，17(5)∶470.
2，J.萨姆布鲁克等著，金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南〔M〕.第2版，北京：科学出版社，1993，19.
3，唐雨德，顾志香，翟春生，等.以包涵体形式表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原的复性与纯化〔J〕.中国兽医科技，1999，29(8)∶13.
4，中华人民共和国农业部.兽用生物制品制造及检验规程〔S〕.1992., http://www.100md.com