PCR-SSCP法检测冠心病患者载脂蛋白E基因多态性
作者：刘绪青 肖劲松
单位：刘绪青(443003 湖北省宜昌市中心医院内科)；肖劲松(武汉市，湖北医科大学附属第二医院内科)
关键词：载脂蛋白E类；基因；冠心病；聚合酶链反应；多态现象，单链构象；
实用医学杂志000808 摘 要 目的：建立聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测冠心病患者载脂蛋白E(apoE)基因多态性，研究我国汉族冠心病(CHD)患者载脂蛋白E基因多态性及其对血脂水平的影响。方法：建立PCR-SSCP技术，测定90例CHD患者及100例相应年龄的健康者apoE基因多态性，同时测定研究对象6项血脂指标。结果：CHD患者apoE4等位基因频率显著高于对照组(0.111比0.06，P<0.05)。CHD患者携apoE4等位基因者血总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及载脂蛋白B(apoB)显著高于对照组(P<0.05或<0.01)。结论：apoE基因多态性与CHD患者血脂紊乱有密切关系。apoE4等位基因是CHD的危险因子。PCR-SSCP法可简便、经济、准确地检测冠心病患者载脂蛋白E基因多态性。
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冠心病(CHD)是目前病死率高，严重危害人类健康的疾病。许多研究表明CHD与遗传因素有一定的关系。目前在CHD遗传因素的探索中，主要集中在遗传对脂类代谢的影响上。载脂蛋白E(apoE)等位基因对血浆中脂质含量有重要作用，血浆总胆固醇浓度变异中大约有8%是由apoE多态性引起的。一般来说，apoE4可显著提高血浆总胆固醇浓度，而apoE2可降低血浆胆固醇浓度[1]。我们应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术，分析了apoE等位基因频率在CHD人群和正常人群中的分布，以建立简便、经济、准确的检测冠心病患者apoE基因多态性的方法，探讨apoE基因多态性与CHD之间的相关关系。
1 对象与方法
1.1 对象 (1)CHD组：根据病史、体征、心电图、实验室检查确诊的CHD患者90例。(2)对照组：为无血缘关系的在门诊体检的健康人100例，其年龄、性别与CHD相对应。
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1.2 方法 (1)标本收集：全部受检对象均禁食12 h以上，于次日早晨采静脉血，EDTA抗凝。(2)血脂指标测定：采用酶法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A1(apoA1)及载脂蛋白B(apoB)，试剂盒由上海长征医学科学公司出品。(3)基因位点DNA扩增及PCR-SSCP：采用改进的Sambrook方法进行全血基因组DNA提取[2]。apoE基因位点引物按Tasi等[3]报道设计，由中科院上海细胞生物研究所合成。apoE基因位点引物序列为：5-GAACAACTGAGCCCGGTGGCGG-3；5-GGATGGCGCTCAGGCGGCGCTC-3。由这对引物扩增出由295 bp组成的DNA片段(核苷酸编序为3649-3943，密码子为80-170)50μl反应体系中，含DNA 0.5μg，Tris(10mmol,pH 8.0)，MgCl2(1.25mmol),KCl(50mmol),Geletin(100μg/ml)，4×dNTP各2.5mmol，覆盖无菌液体石蜡油50μl，置微电脑自动基因扩增仪(1109型，北京新技术应用研究所产)中预变性，95℃ 5min，再50℃退火1min，取出在冰浴上加Taq DNA酶(华美生物工程公司)1μl(2U/μl)，然后按94℃变性1min，取出在冰浴上加Taq DNA酶1μl。然后按94℃变性1min，56℃退火1min，70℃延伸1min，循环30次，最后经70℃延伸10min，取PCR扩增产物25μl，用冷无水乙醇沉淀DNA，加入10μl凝胶载体缓冲液，95℃变性5 min后迅速置冰水浴中冷却，于室温在80%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳完毕后将凝胶放入固定液中固定，然后用0.2%硝酸银染色，用显影液作用10～15min，将凝胶转移到滤纸上吸干观察结果。将已明确的apoE2/2，E3/3，E4/4纯合子个体的模板DNA进行PCR-SSCP分析，示快泳带中E3居前，E2居中，E4置后。将患者模板DNA与之同时电泳，比较快泳带的迁移率即可确定患儿的apoE基因型。本法与采用PCR为基础的扩增耐熔突变系统(ARMS)方法测定所得结果的符合率为100%。
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1.3 统计学处理 基因频率采用基因计数法，将基因型E3/2，E2/2合计为E2携带组，E4/3，E4/4合计为E4携带组。将apoE3/3计为E3纯合子组。apoE基因型及等位基因频率比较用卡方检验。用
±s表示计量资料，组间比较用t检验。
2 结果
对照组及CHD组apoE基因型及等位基因频率分布见表1。经检验两组均为HARDY-WEINBERY平衡群体。CHD组apoE等位基因频率显著高于对照组(0.111对0.06，P<0.05)。携带不同等位基因的CHD患者血脂水平的比较见表2。携带apoE4等位基因的CHD患者血TC，LDL-C，apoB显著高于携带apoE3等位基因型的CHD患者(P<0.05及P<0.01)。
表1 对照组及CHD组apoE基因型等位
, 百拇医药
基因频率(%) 组别
例数
apoE基因型频率
apoE等位基因频率
E2/2
E4/2
E3/2
E3/3
E4/3
E4/4
E2
E3
E4
, 百拇医药
对照组
100
0
1.00
9.00
80.00
9.00
1.00
5.00
89.00
6.00
CHD组
90
, 百拇医药
1.11
0
6.67
74.44
13.33
4.44
4.44
84.00
11.1*
注：与对照组比较* P<0.05表2 CHD患者apoE等位基因对血脂水平的
影响(±s) 血脂指标
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E2(n=7)
E3(n=67)
E4(n=16)
TC(mmol/L)
5.12±0.59
5.46±0.88
5.94±0.38*
TG(mmol/L)
1.61±1.02
1.35±0.61
1.26±0.37
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LDL-C(mmol/L)
2.96±0.62
3.47±0.76
3.92±0.48*
HDL-C(mmol/L)
1.21±0.32
1.27±0.35
1.18±0.26
apoA1(g/l)
1.28±0.31
1.34±0.39
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1.27±0.29
apoB(g/l)
0.81±0.18
0.90±0.21
0.11±0.25**
注：与E3组比较* P<0.05，** P<0.01
3 讨论
CHD的发病具有众多而复杂的遗传和环境因素，但其主要的病理基础及发病因素之一是动脉粥样硬化(AS)。而高脂血症又是AS的主要原因之一，研究表明[2]apoE是AS在个体间发病差异的主要决定因素。
本研究在国内建立了PCR-SSCP技术检测CHD患者apoE遗传多态性。结果表明CHD患者apoE4等位基因频率显著高于对照组，携带突变的apoE等位基因患者血TC，LDL-C，apoB显著高于携带“野生型”的apoE3/3等位基因患者。这与国外研究一致[4，5]。
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apoE是一种富含精氨酸的载脂蛋白，它是apoB/E(LDL)受体的配体，有助于将外周胆固醇送至肝脏代谢排除。apoE基因位于19号染色体上，该基因包括4个外显子和3个内含子，apoE基因经过点突变成为复等位基因，故在人群中常表现为遗传多态性，它有6种基因型及相应的表型，即E 2/2(E 2/2)，E 3/2(E 3/2)，E 4/2(E 4/2)，E 4/3(E 4/3)，E 3/3(E 3/3)及E 4/4(E 4/4)。其中apoE 3/3为野生型，E 3的多肽含有Cys 112/Arg 158。E 4的112位密码子由TGC突变为CGC，E 2的158位密码子由CGC突变为TGC，从而产生相应的突变基因。其他基因型为突变型。在血脂代谢途径中，乳糜微粒(CM)转化为极低密度脂蛋白(VLDL)可以通过三种不同的途径代谢：(1)通过其所含的apoE介导被肝细胞的CM残基受体结合、摄取和代谢；(2)通过其所含apoE及apoB介导，为机体组织(主要是肝脏)的低密度脂蛋白(LDL)受体结合、摄取和利用；(3)通过中密度脂蛋白(IDL)转变为LDL，所形成的LDL再通过apoB介导的LDL受体途径进一步代谢。由于突变的apoE4较apoE3与LDL受体结合活性升高，导致三条代谢途径增强，VLDL残基水平降低，LDL合成增加，同时LDL受体降调节而产生的LDL分解降低，最终结果是血TC，LDL-C及LCL中的主要载脂蛋白——apoB水平升高。
, 百拇医药
总之，CHD患者apoE基因多态性对血脂水平有明显影响。apoE4等位基因为CHD的高危因子。PCR-SSCP方法检测apoE基因多态性简便、经济、准确，可临床推广应用。以便及时预测CHD的高危因子，争取做到尽早防治CHD。
4 参考文献
1，赵水平，主编. 临床血脂学. 长沙：湖南科学技术出版社，1997.29.
2，Tsai MY,Suess P,Schwichtenberg K,et al. Determination of apolipoprotein E genotypes by single-strand conformational polymorphism. Clin Chem,1993,39(10):2121～2124.
3，Sambrook J,Fritech EF,Maniatis T. Molecular clonging. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 464.
, 百拇医药
4，Eichner JE,Kuller LH,Orchard TJ,et al.Relation of apolipoprotein E phenotype to myacardial infarction and motality from coronary artery disease. Am J Cardiol,1993,71(2):160.
5，Willson PW,Myers RH,Larson MG,et al. Apolipoprotein E alleles dyslipidemia and coronary heart disease. JAMA,1994,272(21)：1666～1671.
(收稿日期：2000-04-13)
, http://www.100md.com
单位：刘绪青(443003 湖北省宜昌市中心医院内科)；肖劲松(武汉市，湖北医科大学附属第二医院内科)
关键词：载脂蛋白E类；基因；冠心病；聚合酶链反应；多态现象，单链构象；
实用医学杂志000808 摘 要 目的：建立聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测冠心病患者载脂蛋白E(apoE)基因多态性，研究我国汉族冠心病(CHD)患者载脂蛋白E基因多态性及其对血脂水平的影响。方法：建立PCR-SSCP技术，测定90例CHD患者及100例相应年龄的健康者apoE基因多态性，同时测定研究对象6项血脂指标。结果：CHD患者apoE4等位基因频率显著高于对照组(0.111比0.06，P<0.05)。CHD患者携apoE4等位基因者血总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及载脂蛋白B(apoB)显著高于对照组(P<0.05或<0.01)。结论：apoE基因多态性与CHD患者血脂紊乱有密切关系。apoE4等位基因是CHD的危险因子。PCR-SSCP法可简便、经济、准确地检测冠心病患者载脂蛋白E基因多态性。
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冠心病(CHD)是目前病死率高，严重危害人类健康的疾病。许多研究表明CHD与遗传因素有一定的关系。目前在CHD遗传因素的探索中，主要集中在遗传对脂类代谢的影响上。载脂蛋白E(apoE)等位基因对血浆中脂质含量有重要作用，血浆总胆固醇浓度变异中大约有8%是由apoE多态性引起的。一般来说，apoE4可显著提高血浆总胆固醇浓度，而apoE2可降低血浆胆固醇浓度[1]。我们应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术，分析了apoE等位基因频率在CHD人群和正常人群中的分布，以建立简便、经济、准确的检测冠心病患者apoE基因多态性的方法，探讨apoE基因多态性与CHD之间的相关关系。
1 对象与方法
1.1 对象 (1)CHD组：根据病史、体征、心电图、实验室检查确诊的CHD患者90例。(2)对照组：为无血缘关系的在门诊体检的健康人100例，其年龄、性别与CHD相对应。
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1.2 方法 (1)标本收集：全部受检对象均禁食12 h以上，于次日早晨采静脉血，EDTA抗凝。(2)血脂指标测定：采用酶法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A1(apoA1)及载脂蛋白B(apoB)，试剂盒由上海长征医学科学公司出品。(3)基因位点DNA扩增及PCR-SSCP：采用改进的Sambrook方法进行全血基因组DNA提取[2]。apoE基因位点引物按Tasi等[3]报道设计，由中科院上海细胞生物研究所合成。apoE基因位点引物序列为：5-GAACAACTGAGCCCGGTGGCGG-3；5-GGATGGCGCTCAGGCGGCGCTC-3。由这对引物扩增出由295 bp组成的DNA片段(核苷酸编序为3649-3943，密码子为80-170)50μl反应体系中，含DNA 0.5μg，Tris(10mmol,pH 8.0)，MgCl2(1.25mmol),KCl(50mmol),Geletin(100μg/ml)，4×dNTP各2.5mmol，覆盖无菌液体石蜡油50μl，置微电脑自动基因扩增仪(1109型，北京新技术应用研究所产)中预变性，95℃ 5min，再50℃退火1min，取出在冰浴上加Taq DNA酶(华美生物工程公司)1μl(2U/μl)，然后按94℃变性1min，取出在冰浴上加Taq DNA酶1μl。然后按94℃变性1min，56℃退火1min，70℃延伸1min，循环30次，最后经70℃延伸10min，取PCR扩增产物25μl，用冷无水乙醇沉淀DNA，加入10μl凝胶载体缓冲液，95℃变性5 min后迅速置冰水浴中冷却，于室温在80%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳完毕后将凝胶放入固定液中固定，然后用0.2%硝酸银染色，用显影液作用10～15min，将凝胶转移到滤纸上吸干观察结果。将已明确的apoE2/2，E3/3，E4/4纯合子个体的模板DNA进行PCR-SSCP分析，示快泳带中E3居前，E2居中，E4置后。将患者模板DNA与之同时电泳，比较快泳带的迁移率即可确定患儿的apoE基因型。本法与采用PCR为基础的扩增耐熔突变系统(ARMS)方法测定所得结果的符合率为100%。
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1.3 统计学处理 基因频率采用基因计数法，将基因型E3/2，E2/2合计为E2携带组，E4/3，E4/4合计为E4携带组。将apoE3/3计为E3纯合子组。apoE基因型及等位基因频率比较用卡方检验。用
±s表示计量资料，组间比较用t检验。2 结果
对照组及CHD组apoE基因型及等位基因频率分布见表1。经检验两组均为HARDY-WEINBERY平衡群体。CHD组apoE等位基因频率显著高于对照组(0.111对0.06，P<0.05)。携带不同等位基因的CHD患者血脂水平的比较见表2。携带apoE4等位基因的CHD患者血TC，LDL-C，apoB显著高于携带apoE3等位基因型的CHD患者(P<0.05及P<0.01)。
表1 对照组及CHD组apoE基因型等位
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基因频率(%) 组别
例数
apoE基因型频率
apoE等位基因频率
E2/2
E4/2
E3/2
E3/3
E4/3
E4/4
E2
E3
E4
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对照组
100
0
1.00
9.00
80.00
9.00
1.00
5.00
89.00
6.00
CHD组
90
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1.11
0
6.67
74.44
13.33
4.44
4.44
84.00
11.1*
注：与对照组比较* P<0.05表2 CHD患者apoE等位基因对血脂水平的
影响(
±s) 血脂指标, http://www.100md.com
E2(n=7)
E3(n=67)
E4(n=16)
TC(mmol/L)
5.12±0.59
5.46±0.88
5.94±0.38*
TG(mmol/L)
1.61±1.02
1.35±0.61
1.26±0.37
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LDL-C(mmol/L)
2.96±0.62
3.47±0.76
3.92±0.48*
HDL-C(mmol/L)
1.21±0.32
1.27±0.35
1.18±0.26
apoA1(g/l)
1.28±0.31
1.34±0.39
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1.27±0.29
apoB(g/l)
0.81±0.18
0.90±0.21
0.11±0.25**
注：与E3组比较* P<0.05，** P<0.01
3 讨论
CHD的发病具有众多而复杂的遗传和环境因素，但其主要的病理基础及发病因素之一是动脉粥样硬化(AS)。而高脂血症又是AS的主要原因之一，研究表明[2]apoE是AS在个体间发病差异的主要决定因素。
本研究在国内建立了PCR-SSCP技术检测CHD患者apoE遗传多态性。结果表明CHD患者apoE4等位基因频率显著高于对照组，携带突变的apoE等位基因患者血TC，LDL-C，apoB显著高于携带“野生型”的apoE3/3等位基因患者。这与国外研究一致[4，5]。
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apoE是一种富含精氨酸的载脂蛋白，它是apoB/E(LDL)受体的配体，有助于将外周胆固醇送至肝脏代谢排除。apoE基因位于19号染色体上，该基因包括4个外显子和3个内含子，apoE基因经过点突变成为复等位基因，故在人群中常表现为遗传多态性，它有6种基因型及相应的表型，即E 2/2(E 2/2)，E 3/2(E 3/2)，E 4/2(E 4/2)，E 4/3(E 4/3)，E 3/3(E 3/3)及E 4/4(E 4/4)。其中apoE 3/3为野生型，E 3的多肽含有Cys 112/Arg 158。E 4的112位密码子由TGC突变为CGC，E 2的158位密码子由CGC突变为TGC，从而产生相应的突变基因。其他基因型为突变型。在血脂代谢途径中，乳糜微粒(CM)转化为极低密度脂蛋白(VLDL)可以通过三种不同的途径代谢：(1)通过其所含的apoE介导被肝细胞的CM残基受体结合、摄取和代谢；(2)通过其所含apoE及apoB介导，为机体组织(主要是肝脏)的低密度脂蛋白(LDL)受体结合、摄取和利用；(3)通过中密度脂蛋白(IDL)转变为LDL，所形成的LDL再通过apoB介导的LDL受体途径进一步代谢。由于突变的apoE4较apoE3与LDL受体结合活性升高，导致三条代谢途径增强，VLDL残基水平降低，LDL合成增加，同时LDL受体降调节而产生的LDL分解降低，最终结果是血TC，LDL-C及LCL中的主要载脂蛋白——apoB水平升高。
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总之，CHD患者apoE基因多态性对血脂水平有明显影响。apoE4等位基因为CHD的高危因子。PCR-SSCP方法检测apoE基因多态性简便、经济、准确，可临床推广应用。以便及时预测CHD的高危因子，争取做到尽早防治CHD。
4 参考文献
1，赵水平，主编. 临床血脂学. 长沙：湖南科学技术出版社，1997.29.
2，Tsai MY,Suess P,Schwichtenberg K,et al. Determination of apolipoprotein E genotypes by single-strand conformational polymorphism. Clin Chem,1993,39(10):2121～2124.
3，Sambrook J,Fritech EF,Maniatis T. Molecular clonging. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 464.
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4，Eichner JE,Kuller LH,Orchard TJ,et al.Relation of apolipoprotein E phenotype to myacardial infarction and motality from coronary artery disease. Am J Cardiol,1993,71(2):160.
5，Willson PW,Myers RH,Larson MG,et al. Apolipoprotein E alleles dyslipidemia and coronary heart disease. JAMA,1994,272(21)：1666～1671.
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