谷氨酰胺强化的肠内营养对化疗大鼠肠屏障的影响
邓高月 刘广华 刘振邦 刘跃武 何桂珍 徐燕英 闻天学 蒋朱明
摘 要 目的 评价谷氨酰胺强化的肠内营养对氟尿嘧啶(5-Fu)化疗大鼠肠屏障的影响。方法 30只胃造瘘术后的Wistar大鼠随机分为饲料组(A组)、肠内营养组(B组)和谷氨酰胺强化的肠内营养组(C组)，每组10只。术后第4天用5-Fu化疗，比较它们的体重变化、小肠和结肠结构、血浆谷氨酰胺水平、肠通透性(L/M)及细菌移位率(BTR)等指标。结果 B组体重丢失(-6.6±5.2) g (P<0.01)，C组体重无明显变化；C组小肠结构优于B组(P<0.01)与A组相似(P 0.05)，但C组结肠结构不及A组(P<0.01)而与B组相似(P 0.05)。化疗后与A组比，C组L/M无明显变化(P 0.05)，而B组上升(P<0.01)；C组细菌移位率(30%)低于B组(70%)(P<0.05)，与A组(20%)无显著差异(P 0.05)。结论 谷氨酰胺强化的肠内营养能保护5-Fu化疗大鼠的肠屏障。
, 百拇医药 关键词：谷氨酰胺 肠屏障 化学治疗
肿瘤患者接受化疗时其肠结构和屏障功能会受到损害，导致肠道细菌和毒素移位，引起肠源性感染，严重者可引起败血症，甚至多脏器功能衰竭而死亡。研究表明，谷氨酰胺(glutamine, Gln)对某些应激状态造成的肠黏膜结构和屏障功能的损害具有保护作用[1-4]。我们以化疗大鼠为模型，研究谷氨酰胺强化的肠内营养(EN)对肠屏障的影响。
材料与方法
一. 动物模型的制备
取健康雄性Wistar大鼠30只，体重180～220 g，行胃造瘘术。术后按随机化表进行分组，每组10只。A组每天输0.9%氯化钠溶液10 mL，自由食普通饲料。B组给予普通肠内营养，其成分为(W/W)：蛋白质18.8%，植物油18.3%，碳水化合物57.5%，矿物质2.5%，维生素0.15%，热卡4.184 kJ/mL,其中谷氨酰(Gln)含量为0.43 g/100 mL。C组在普通肠内营养中加丙氨酰谷氨酰胺双肽(每100 mL中加入2.35 g，相当于谷氨酰胺1.57 g)，使谷氨酰胺的浓度达2 g/100 mL。B组中则加入等量的(2.35 g/100 mL)甘氨酸，以使B、C两组等氮。B、C两组营养液为等氮(每天2.5 g/kg)和等热卡(每天1 046 kJ/kg)。剂量为每天250 mL/kg。所有实验动物可自由饮水。麻醉苏醒后2小时开始输注营养液，第1天输半量，第2天开始输全量。各组营养液当天配制，用微量注射器泵在24小时内均匀输注。于术后第4天，用氟尿嘧啶(5-Fu)腹腔内注射进行化疗，剂量为75 mg/kg。
, 百拇医药
二. 观察指标
(一)体重
于手术当天及术后第8天分别称空腹体重，比较实验前后的变化及各组差值的大小。
(二)肠结构
于距Treiz韧带40 cm处取小肠，测其湿重(mg/cm)，并做成病理切片测黏膜厚度和绒毛高度。每张切片随机测5个视野，取其平均值。于距盲肠结肠交界5 cm处取结肠，测其湿重和黏膜厚度，方法如上。
(三)肠系膜淋巴结细菌移位
术后第8天在无菌台内严格按无菌手术要求收集肠系膜淋巴结。淋巴结和腹腔拭子进行普通培养48小时，计算菌落数。按照国际上通用的标准，确定菌落数大于100菌落形成单位(CFU)/克淋巴结组织为细菌移位阳性[3]。计算各组细菌移位率(细菌移位阳性的动物个数/该组动物总数×100)。
, 百拇医药
(四)肠通透性
术后第3天和第7天分别从胃造瘘管中注入乳果糖和甘露醇混合液2 mL(含乳果糖100 mg和甘露醇50 mg)。收集24小时尿，记录尿量。测定尿中的乳果糖和甘露醇浓度。根据尿量计算其各自从尿中排出的量，再根据注入的量计算出各自的排泄率。以乳果糖排出率/甘露醇排出率(L/M)表示肠通透性的大小。
(五)血浆Gln水平
术后第8天取静脉血于肝素抗凝管中，离心，用磺基水扬酸(SSA)沉淀蛋白质，用氨基酸自动分析仪(119 CL型，美国Beckman公司)测Gln水平。
三. 统计分析
各组间细菌移位率的比较用χ2 检验；实验前后体重和肠通透性的变化用t检验；其它数据各组间的比较用方差分析。
, http://www.100md.com
结 果
一. 体重的变化
实验后与实验前比较，A组体重增加(4.9±4.3) g(P<0.01)；B组体重下降(6.6±5.2) g(P<0.01)；C组无显著变化(P>0.05)。
二. 肠结构
(一)小肠结构
B组小肠的湿重、黏膜厚度和绒毛高度均低于A、C两组，A、C两组间无显著性差异(表1)。
表1 3组大鼠小肠湿重、黏膜厚度和绒毛高度
组别
鼠数
(只)
, 百拇医药
湿重
(mg/cm)
黏膜厚度
(μm)
绒毛高度
(μm)
A组
10
52.2±5.7
547.3±45.9
428.6±23.0
B组
10
, 百拇医药
35.2±7.9*
411.5±63.0*
360.8±31.5*
C组
10
46.1±8.4
498.5±67.4
404.2±33.7
B组与A、C组比较，*P<0.05
(二)结肠结构
A组的结肠湿重和黏膜厚度高于B、C组，B、C组间无显著差异(表2)。 表2 3组大鼠结肠湿重和黏膜厚度
, 百拇医药
组别
鼠数(只)
湿重(mg/cm)
黏膜厚度(μm)
A组
10
70.5±8.2*
402.4±40.8*
B组
10
51.9±11.3
309.7±56.4
, 百拇医药
C组
10
55.2±8.0
326.1±40.2
A组与B、C组比较，*P<0.05
三. 细菌移位
全部腹腔拭子培养为阴性，提示无手术污染。A、B、C组细菌移位的阳性率分别为20%、70%和30%。B组显著高于A、C组(P<0.05)，A、C组间无显著差异(P>0.05)。
四. 肠通透性
与化疗前比较，B组的L/M显著升高。A组和C组的L/M无显著变化(表3)。 表3 3组大鼠化疗前后肠通透性的变化(X±S)
, 百拇医药
组别
鼠数(只)
化疗前L/M
化疗后L/M
差值
P值
A组
10
0.0268±0.0039
0.0281±0.0044
0.0013±0.0022
>0.05
, 百拇医药 B组
10
0.0289±0.0070
0.0331±0.0084
0.0042±0.0033*
<0.05
C组
10
0.0244±0.0060
0.0254±0.0067
0.0010±0.0029
>0.05
, http://www.100md.com
B组与A、C组比较，*P<0.01
五. 血浆Gln水平
B组显著降低，为(385.5±120.3) μmol/L；而A组和C组之间无显著差异，分别为(552.5±132.6) μmol/L、(556.5±111.7) μmol/L。讨 论
本研究模拟临床化疗和EN的状况，以大鼠腹腔内注射5-Fu为化疗模型，评价Gln强化的EN对肠屏障功能的影响。结果表明，与传统的EN比较，Gln强化的EN能防止化疗引起的肠结构损害、通透性升高和细菌移位增加，提示对肠屏障功能有保护作用。
肠屏障包括两个方面，一是结构完整的肠黏膜屏障，二是肠道局部和全身免疫功能完好的免疫屏障。Gln作为小肠细胞的氧化燃料和核苷酸合成的前体物质，能够促进肠黏膜细胞的蛋白质、DNA和RNA的合成，在应激状态下维持它们的含量，防止肠黏膜萎缩，增强细胞构筑，从而增强肠黏膜的物理屏障[1，5]，本研究结果提示，Gln强化的肠内营养对小肠结构有良好的保护作用，而对结肠的作用与传统肠内营养对照组无显著差异，其他作者亦有类似报道[5]。这可能与小肠细胞主要以Gln作为氧化燃料，而结肠细胞主要以短链脂肪酸作为主要燃料有关，同时说明肠黏膜物理屏障在肠屏障功能中起的作用可能不是最主要的。
, http://www.100md.com
Gln调节肠道局部和全身的免疫功能可能是其保护肠屏障最重要的机制[6]。Gln能提高腹膜炎大鼠腹膜腔和肝脏对细菌的清除能力，防止流感病毒刺激和全肠外营养(TPN)所致的肠集合淋巴结(peyer's 斑)及肠上皮和黏膜下淋巴结中的淋巴细胞总数减少[7]，增强术后患者血中性粒细胞在体外的杀菌功能[8]，提高休克大鼠肠单核细胞和脾巨噬细胞的细胞介素-6(IL-6)活性和无胸腺小鼠(裸鼠)血清IL-2水平[9]，降低硫酸三硝酸基苯引起的结肠炎大鼠的IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)升高以及增加肠道局部分泌型免疫球蛋白活性等。
全身代谢状态的改善对保护肠屏障功能也有重要的作用。在应激状态下，Gln的合成受抑制，其消耗超过内源性产生，造成Gln的缺乏，表现为血浆Gln水平下降[6]，因此，血浆Gln水平被认为是反映机体代谢损害(或应激代谢)的一个指标。Gln能改善氮平衡，促进合成代谢。本研究从肠内补充Gln，结果其血浆Gln水平和体重的维持均优于传统肠内营养对照组，提示能产生良好的代谢效应。血浆Gln水平的维持可能与肠细胞直接从肠腔摄取Gln从而减少其从血中的摄取有关。
, 百拇医药
本研究的结果提示，用Gln强化的肠内营养对化疗引起的肠屏障损害可产生保护作用，从而为改进临床肠内营养的配方提供依据。
作者单位：邓高月(100017 北京，中国人民解放军305医院外科)
刘振邦(100017 北京，中国人民解放军305医院外科)
刘广华(北京协和医院外科)
刘跃武(北京协和医院外科)
何桂珍(北京协和医院外科)
蒋朱明(北京协和医院外科)
徐燕英(中国协和医科大学基础医学院仪器中心)
参考文献
, 百拇医药
1，Chen KAI, Okuma T, Okamura K, et al. Glutamine-supplemented parenteral nutrition improves gut mucosa integrity and function in endotoxemic rats. JPEN 1994;18:167-171.
2，Zapata-Sirvent RL, Hansbrough JF, Ohara MM, et al. Bacterial translocation in burned mice after administration of various diets including fiber-and glutamine-enriched enteral formulas. Crit Care Med 1994; 22:690-696.
3，Zhang W, Frankel WL, Bain A, et al. Glutamine reduces bacterial translocation after small bowel transpantation in cyclosporine-treated rats. J Surg Res 1995; 58:159-164.
, 百拇医药
4，白满喜，蒋朱明，马永贤，等. 谷氨酰胺双肽对大鼠肠切除后细菌移位的影响. 中华医学杂志， 1996；76：116-119.
5，O'Dwyer ST, Smith RJ, Hwang TL, et al. Maintenance of small bowel mucosa with glutamine-enriched parenteral nutrition. JPEN 1989;13:579-594.
6，Wilmore DW, Shabert JK. Role of glutamine in immunologic responses. Nutrition 1998; 14:618-626.
7，Li J, King BK, Janu PG, et al. Glycyl-L-glutamine-enriched total parenteral nutrition maintains small intestine gut-associated lymphoid tissue and upper respiratory tract immunity. JPEN 1998;22:31-36.
8，Furukawa S, Saito H, Fukatsu K, et al. Glutamine enhanced bacterial killing by neutrophils from postoperative patients. Nutrition 1997;13:863-869.
9，Gismondo MR, Drago L, Fassina MC, et al. Immunostimulating effect of oral glutamine. Dig Dis Sci 1998; 43:1752-1754., 百拇医药
摘 要 目的 评价谷氨酰胺强化的肠内营养对氟尿嘧啶(5-Fu)化疗大鼠肠屏障的影响。方法 30只胃造瘘术后的Wistar大鼠随机分为饲料组(A组)、肠内营养组(B组)和谷氨酰胺强化的肠内营养组(C组)，每组10只。术后第4天用5-Fu化疗，比较它们的体重变化、小肠和结肠结构、血浆谷氨酰胺水平、肠通透性(L/M)及细菌移位率(BTR)等指标。结果 B组体重丢失(-6.6±5.2) g (P<0.01)，C组体重无明显变化；C组小肠结构优于B组(P<0.01)与A组相似(P 0.05)，但C组结肠结构不及A组(P<0.01)而与B组相似(P 0.05)。化疗后与A组比，C组L/M无明显变化(P 0.05)，而B组上升(P<0.01)；C组细菌移位率(30%)低于B组(70%)(P<0.05)，与A组(20%)无显著差异(P 0.05)。结论 谷氨酰胺强化的肠内营养能保护5-Fu化疗大鼠的肠屏障。
, 百拇医药 关键词：谷氨酰胺 肠屏障 化学治疗
肿瘤患者接受化疗时其肠结构和屏障功能会受到损害，导致肠道细菌和毒素移位，引起肠源性感染，严重者可引起败血症，甚至多脏器功能衰竭而死亡。研究表明，谷氨酰胺(glutamine, Gln)对某些应激状态造成的肠黏膜结构和屏障功能的损害具有保护作用[1-4]。我们以化疗大鼠为模型，研究谷氨酰胺强化的肠内营养(EN)对肠屏障的影响。
材料与方法
一. 动物模型的制备
取健康雄性Wistar大鼠30只，体重180～220 g，行胃造瘘术。术后按随机化表进行分组，每组10只。A组每天输0.9%氯化钠溶液10 mL，自由食普通饲料。B组给予普通肠内营养，其成分为(W/W)：蛋白质18.8%，植物油18.3%，碳水化合物57.5%，矿物质2.5%，维生素0.15%，热卡4.184 kJ/mL,其中谷氨酰(Gln)含量为0.43 g/100 mL。C组在普通肠内营养中加丙氨酰谷氨酰胺双肽(每100 mL中加入2.35 g，相当于谷氨酰胺1.57 g)，使谷氨酰胺的浓度达2 g/100 mL。B组中则加入等量的(2.35 g/100 mL)甘氨酸，以使B、C两组等氮。B、C两组营养液为等氮(每天2.5 g/kg)和等热卡(每天1 046 kJ/kg)。剂量为每天250 mL/kg。所有实验动物可自由饮水。麻醉苏醒后2小时开始输注营养液，第1天输半量，第2天开始输全量。各组营养液当天配制，用微量注射器泵在24小时内均匀输注。于术后第4天，用氟尿嘧啶(5-Fu)腹腔内注射进行化疗，剂量为75 mg/kg。
, 百拇医药
二. 观察指标
(一)体重
于手术当天及术后第8天分别称空腹体重，比较实验前后的变化及各组差值的大小。
(二)肠结构
于距Treiz韧带40 cm处取小肠，测其湿重(mg/cm)，并做成病理切片测黏膜厚度和绒毛高度。每张切片随机测5个视野，取其平均值。于距盲肠结肠交界5 cm处取结肠，测其湿重和黏膜厚度，方法如上。
(三)肠系膜淋巴结细菌移位
术后第8天在无菌台内严格按无菌手术要求收集肠系膜淋巴结。淋巴结和腹腔拭子进行普通培养48小时，计算菌落数。按照国际上通用的标准，确定菌落数大于100菌落形成单位(CFU)/克淋巴结组织为细菌移位阳性[3]。计算各组细菌移位率(细菌移位阳性的动物个数/该组动物总数×100)。
, 百拇医药
(四)肠通透性
术后第3天和第7天分别从胃造瘘管中注入乳果糖和甘露醇混合液2 mL(含乳果糖100 mg和甘露醇50 mg)。收集24小时尿，记录尿量。测定尿中的乳果糖和甘露醇浓度。根据尿量计算其各自从尿中排出的量，再根据注入的量计算出各自的排泄率。以乳果糖排出率/甘露醇排出率(L/M)表示肠通透性的大小。
(五)血浆Gln水平
术后第8天取静脉血于肝素抗凝管中，离心，用磺基水扬酸(SSA)沉淀蛋白质，用氨基酸自动分析仪(119 CL型，美国Beckman公司)测Gln水平。
三. 统计分析
各组间细菌移位率的比较用χ2 检验；实验前后体重和肠通透性的变化用t检验；其它数据各组间的比较用方差分析。
, http://www.100md.com
结 果
一. 体重的变化
实验后与实验前比较，A组体重增加(4.9±4.3) g(P<0.01)；B组体重下降(6.6±5.2) g(P<0.01)；C组无显著变化(P>0.05)。
二. 肠结构
(一)小肠结构
B组小肠的湿重、黏膜厚度和绒毛高度均低于A、C两组，A、C两组间无显著性差异(表1)。
表1 3组大鼠小肠湿重、黏膜厚度和绒毛高度
组别
鼠数
(只)
, 百拇医药
湿重
(mg/cm)
黏膜厚度
(μm)
绒毛高度
(μm)
A组
10
52.2±5.7
547.3±45.9
428.6±23.0
B组
10
, 百拇医药
35.2±7.9*
411.5±63.0*
360.8±31.5*
C组
10
46.1±8.4
498.5±67.4
404.2±33.7
B组与A、C组比较，*P<0.05
(二)结肠结构
A组的结肠湿重和黏膜厚度高于B、C组，B、C组间无显著差异(表2)。 表2 3组大鼠结肠湿重和黏膜厚度
, 百拇医药
组别
鼠数(只)
湿重(mg/cm)
黏膜厚度(μm)
A组
10
70.5±8.2*
402.4±40.8*
B组
10
51.9±11.3
309.7±56.4
, 百拇医药
C组
10
55.2±8.0
326.1±40.2
A组与B、C组比较，*P<0.05
三. 细菌移位
全部腹腔拭子培养为阴性，提示无手术污染。A、B、C组细菌移位的阳性率分别为20%、70%和30%。B组显著高于A、C组(P<0.05)，A、C组间无显著差异(P>0.05)。
四. 肠通透性
与化疗前比较，B组的L/M显著升高。A组和C组的L/M无显著变化(表3)。 表3 3组大鼠化疗前后肠通透性的变化(X±S)
, 百拇医药
组别
鼠数(只)
化疗前L/M
化疗后L/M
差值
P值
A组
10
0.0268±0.0039
0.0281±0.0044
0.0013±0.0022
>0.05
, 百拇医药 B组
10
0.0289±0.0070
0.0331±0.0084
0.0042±0.0033*
<0.05
C组
10
0.0244±0.0060
0.0254±0.0067
0.0010±0.0029
>0.05
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B组与A、C组比较，*P<0.01
五. 血浆Gln水平
B组显著降低，为(385.5±120.3) μmol/L；而A组和C组之间无显著差异，分别为(552.5±132.6) μmol/L、(556.5±111.7) μmol/L。讨 论
本研究模拟临床化疗和EN的状况，以大鼠腹腔内注射5-Fu为化疗模型，评价Gln强化的EN对肠屏障功能的影响。结果表明，与传统的EN比较，Gln强化的EN能防止化疗引起的肠结构损害、通透性升高和细菌移位增加，提示对肠屏障功能有保护作用。
肠屏障包括两个方面，一是结构完整的肠黏膜屏障，二是肠道局部和全身免疫功能完好的免疫屏障。Gln作为小肠细胞的氧化燃料和核苷酸合成的前体物质，能够促进肠黏膜细胞的蛋白质、DNA和RNA的合成，在应激状态下维持它们的含量，防止肠黏膜萎缩，增强细胞构筑，从而增强肠黏膜的物理屏障[1，5]，本研究结果提示，Gln强化的肠内营养对小肠结构有良好的保护作用，而对结肠的作用与传统肠内营养对照组无显著差异，其他作者亦有类似报道[5]。这可能与小肠细胞主要以Gln作为氧化燃料，而结肠细胞主要以短链脂肪酸作为主要燃料有关，同时说明肠黏膜物理屏障在肠屏障功能中起的作用可能不是最主要的。
, http://www.100md.com
Gln调节肠道局部和全身的免疫功能可能是其保护肠屏障最重要的机制[6]。Gln能提高腹膜炎大鼠腹膜腔和肝脏对细菌的清除能力，防止流感病毒刺激和全肠外营养(TPN)所致的肠集合淋巴结(peyer's 斑)及肠上皮和黏膜下淋巴结中的淋巴细胞总数减少[7]，增强术后患者血中性粒细胞在体外的杀菌功能[8]，提高休克大鼠肠单核细胞和脾巨噬细胞的细胞介素-6(IL-6)活性和无胸腺小鼠(裸鼠)血清IL-2水平[9]，降低硫酸三硝酸基苯引起的结肠炎大鼠的IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)升高以及增加肠道局部分泌型免疫球蛋白活性等。
全身代谢状态的改善对保护肠屏障功能也有重要的作用。在应激状态下，Gln的合成受抑制，其消耗超过内源性产生，造成Gln的缺乏，表现为血浆Gln水平下降[6]，因此，血浆Gln水平被认为是反映机体代谢损害(或应激代谢)的一个指标。Gln能改善氮平衡，促进合成代谢。本研究从肠内补充Gln，结果其血浆Gln水平和体重的维持均优于传统肠内营养对照组，提示能产生良好的代谢效应。血浆Gln水平的维持可能与肠细胞直接从肠腔摄取Gln从而减少其从血中的摄取有关。
, 百拇医药
本研究的结果提示，用Gln强化的肠内营养对化疗引起的肠屏障损害可产生保护作用，从而为改进临床肠内营养的配方提供依据。
作者单位：邓高月(100017 北京，中国人民解放军305医院外科)
刘振邦(100017 北京，中国人民解放军305医院外科)
刘广华(北京协和医院外科)
刘跃武(北京协和医院外科)
何桂珍(北京协和医院外科)
蒋朱明(北京协和医院外科)
徐燕英(中国协和医科大学基础医学院仪器中心)
参考文献
, 百拇医药
1，Chen KAI, Okuma T, Okamura K, et al. Glutamine-supplemented parenteral nutrition improves gut mucosa integrity and function in endotoxemic rats. JPEN 1994;18:167-171.
2，Zapata-Sirvent RL, Hansbrough JF, Ohara MM, et al. Bacterial translocation in burned mice after administration of various diets including fiber-and glutamine-enriched enteral formulas. Crit Care Med 1994; 22:690-696.
3，Zhang W, Frankel WL, Bain A, et al. Glutamine reduces bacterial translocation after small bowel transpantation in cyclosporine-treated rats. J Surg Res 1995; 58:159-164.
, 百拇医药
4，白满喜，蒋朱明，马永贤，等. 谷氨酰胺双肽对大鼠肠切除后细菌移位的影响. 中华医学杂志， 1996；76：116-119.
5，O'Dwyer ST, Smith RJ, Hwang TL, et al. Maintenance of small bowel mucosa with glutamine-enriched parenteral nutrition. JPEN 1989;13:579-594.
6，Wilmore DW, Shabert JK. Role of glutamine in immunologic responses. Nutrition 1998; 14:618-626.
7，Li J, King BK, Janu PG, et al. Glycyl-L-glutamine-enriched total parenteral nutrition maintains small intestine gut-associated lymphoid tissue and upper respiratory tract immunity. JPEN 1998;22:31-36.
8，Furukawa S, Saito H, Fukatsu K, et al. Glutamine enhanced bacterial killing by neutrophils from postoperative patients. Nutrition 1997;13:863-869.
9，Gismondo MR, Drago L, Fassina MC, et al. Immunostimulating effect of oral glutamine. Dig Dis Sci 1998; 43:1752-1754., 百拇医药