用3’非编码区通用引物通过RT-PCR检测登革1～4型病毒RNA
段鸿元 杨佩英 秦鄂德 于曼 欧武
摘 要：目的 根据登革病毒(DEN)3端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型通用引物，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测登革病毒1～4型RNA。方法 用C6/36细胞培养登革病毒。用热酚法提取病毒RNA，进行RT-PCR扩增，并对扩增产物测序。结果 DEN-2-NGC株可扩增出至少10TCID50的病毒，测序结果与已知序列一致。DEN-1～4型标准株和DEN-2-04与DEN-2-43株均能够扩增出唯一的一条特异条带。结论 应用通用引物RT-PCR法可从病毒浓度少至10TCID50的感染细胞培养液中检出DEN-2-NGC株病毒，并且该对通用引物对于其他3型登革病毒亦具有很好的通用性，其方法的特异性和敏感性亦较强。
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关键词：登革热病毒 RT-PCR 检测 基因
登革病毒(DEN)是引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的病原体，登革热是严重影响人类健康的世界范围的流行病。自1978年以来在我国两广和海南省，间或有较大规模流行，平常年份亦有散发流行。登革病毒的经典诊断方法为血清学实验，但该方法周期长。运用逆转录-PCR方法检测登革病毒的工作国内已有报道[1～3]，他们先后设计出一些通用引物及型特异引物，并且对组织培养的病毒和病人血清标本进行了扩增，试验结果较为理想。同时须指出的是，在对扩增产物的鉴定上以往一般采用凝胶电泳这一粗略的指标，缺乏准确性；又有采用Southern印记杂交方法的[1]，其假阳性率亦较高。而对病人血清标本的扩增试验[2]，由于没有事先对血清标本进行血清学验证，因而其检验结果的阳性率尚有待商榷[4]。本实验采用3端非编码区通用引物结合逆转录-聚合酶链技术(RT-PCR)的方法，它具有同以上方法一样的优越性，并且对扩增结果进行了DNA测序，用测序结果与已知的国际标准参考株序列进行对比，得到了最直接的验证。同时本实验也探索了检测病毒RNA的敏感性和特异性的问题。
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1 材料和方法
1.1 病毒株 登革病毒1～4型国际标准参考株分别为DEN-1夏威夷株、DEN-2-NGC株、DEN-3-H87株和DEN-4-H241株；国内分离的DEN-2型04株和DEN-2型43株。
1.2 病毒的培养 采用C6/36细胞培养。待细胞长成单层后接种病毒，当细胞病变作用(CPE)出现3+后，以4 000r/min离心去除细胞碎片，收集上清，在-20℃保存。
1.3 病毒滴定 采用96孔微量培养板，细胞加病毒同时培养，做TCID50滴定，直到细胞病变不再继续为止，DEN-2-NGC株的TCID50为107。
1.4 RNA提取 取1ml病毒培养液加0.2ml 40%PEG，4℃过夜；第2天以8 000r/min，4℃，离心20min，弃上清；然后用热酚法提RNA。其中乙醇沉淀一步为-20℃过夜或置液氮中沉淀15～20min。最后将RNA溶于20μl含0.5～1U/μl的RNAsin的TE或水中。
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1.5 引物设计 根据登革病毒GenBank提供的序列数据，其3非编码区10 406～10 423序列在登革4个血清型中是高度保守的，据此设计下列登革4个型的通用引物进行PCR扩增[5]。见表1。
表1 引物设计
Table 1 The designed oligonuclotide primers
正向引物：
Sense primers：
ALD-1
5
AAA
CCG
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TGT
TGC
CTG
TAG-3
ALD-1b
5
AAA
CTG
TGC
AGC
CTG
TAG-3
反向引物：
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Antisense primer：
ALD-2
5
TCT
CTC
CCA
GCG
TCA
ATA-3
1.6 RT-PCR[6]
1.6.1 RNA逆转录 取样品RNA 0.1～0.5μg(10μl)，100℃5min；快速冰浴5min；加下游引物5μl，100℃2min；室温10min，简短离心。依次再加入下列试剂于该试管：RNAsin，1.0μl；5×1st buffer，6.0μl；0.1M DTT，3.0μl；dNTP(10μm)，3.0μl；M-MLV-Rtase(反转录酶)1.5μl。37℃水浴1h。
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1.6.2 PCR扩增 本实验注意的是退火温度应在58℃左右。对于DEN-1，3，4型应适当提高温度，变性条件为94℃，1min；延伸条件为72℃，1.5min。反应共进行25～30个循环。
对反应敏感性的验证：将DEN-2-NGC株病毒上清进行10倍递增稀释，其浓度从10-1～10-6，然后分别提取RNA进行RT-PCR。
对反应通用性的验证：以原液浓度扩增DEN-1，2，3，4型病毒和DEN-2-04，43株病毒。
1.6.3 凝胶电泳和测序 取扩增产物10μl以2%琼脂糖凝胶进行电泳，与标准DNA Marker比较分子量大小。对DEN-2-NGC株的扩增产物进行测序。
2 结果
2.1 RT-PCR产物的鉴定 将DEN-2-NGC株病毒培养液以10倍连续稀释，得到10-1，10-2，10-3，……，10-6浓度。分别扩增后，每个稀释度取产物10μl进行琼脂糖电泳，结果见图1。从电泳上可见每一浓度均能够得到唯一的一条目的条带，其大小位于核酸分子量标准的267～174bp之间，与预期的238bp相符，并且一直稀释到10TCID50浓度(即10-6稀释度)DNA条带仍清晰可见。说明其敏感性较高，最低可达到检测10TCID50病毒的RNA。
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图1 DEN-2-NGC株病毒RT-PCR扩增产物电泳
1～6：依次为10-1、10-2、……10-6稀释液
M：分子量标准C：正常细胞悬液对照
Fig 1 Agarose gel analysis of the DNA product from RT-PCR of RNA samples isolated from DEN-2-NGC1～6：diluted virus samples of 10-1、10-2、……10-6 times concentration respectively.
M：pGEM-3Zf(+)/Hae Ⅲ Markers
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C：normal cells suspension used as a negative control
2.2 登革1～4型病毒RT-PCR 用上述方法对登革1～4型病毒标准株和DEN-2-04株，DEN-2-43株进行扩增，结果见图2，图3。登革1～4型病毒扩增产物的片段大小分别为：DEN-1，229bp；DEN-2，238bp；DEN-3，227bp；DEN-4，241bp。
图2 登革病毒标准株的扩增产物电泳
M：核酸分子量标准C：正常C6/36细胞悬液对照
1～4：分别为DEN-1，2，3，4型病毒
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Fig.2 Agarosegel analysis of the DNA product from RT-PCR of RNA samples isolated from classical dengue viruses
M：pGEM-3Zf(+)/Hae Ⅲ MarkersC：normal cells suspension used as a negative control
图3 登革病毒2-04、2-43株扩增产物电泳
M：核酸分子量标准C：正常C6/36细胞悬液对照
04，43：DEN-2-04株，43株
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Fig.3 Agarosegel analysis of the DNA product from RT-PCR of RNA samples isolated from DEN-2-04 and DEN-2-43M：pGEM-3Zf(+)/Hae Ⅲ Markers
C：normal cells suspension used as a negative control
图2为DEN-1，2，3，和4型国际标准参考株病毒原液的RT-PCR扩增结果，各型病毒均能够得到唯一的一条目的条带，条带大小也在预期范围内。其中DEN-1型病毒条带较浅，可能由于培养所获病毒滴度低所致。DEN-2-NGC株扩增产物的测序结果与已知的DEN-2-NGC株序列相比较，在长度为238bp的范围内，仅有一个碱基不一致。即位于10425位的A被T取代，这可能由于扩增时碱基对错配或转化时在DH5α菌内基因突变所致。另外，图3为我国自行分离的DEN-2-04株和43株扩增结果，用该通用引物也能够扩增出唯一的一条目的条带。以上说明，该引物对DEN-1～4型国际标准参考株及我国自行分离的DEN-2-04株和43株的RNA检测都具有很好的通用性。
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3 讨论
登革病毒在C6/36细胞中培养，由其病变的变化可以看出一般在96h左右出现较明显的CPE[1]。到病变为约75%时大部分 细胞已经破裂，释放出装配完整的病毒颗粒；由于细胞破裂，细胞质以及部分细胞核中的核酸也被释放到培养液中。用这种培养液得到的上清成分复杂，干扰因素多，更接近于病人血清。用该对通用引物采用本实验室建立的RT-PCR方法可以清楚地扩增出登革病毒4个型别的国际标准参考株的相应序列；并以登革2型NGC株为样本进行了敏感性试验，可以检测到最低为10TCID50的病毒RNA，并且经测序证明扩增片段是特异的。综上说明结合该对引物的RT-PCR方法具有很好的通用性、特异性和敏感性，可作为登革热实验诊断的辅助方法。
检测登革病毒的传统血清学方法有：血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)、中和试验及测定IgG、IgM和登革抗体的试验。这些方法的不足之处是周期过长，涉及因素多，操作繁琐。现在，新的RT-PCR方法缩短了时间，提高了特异性和敏感性。由于PCR方法易出现非特异性结果，它只作为综合诊断的一个具体方法，单纯PCR结果还不能作为确诊的依据。把RT-PCR方法和登革热的临床诊断结合起来将有利于登革热的早期确诊。
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段鸿元(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
杨佩英(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
秦鄂德(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
于曼(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
欧武(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
参考文献
1，秦鄂德，杨佩英，于曼，等.应用通用引物聚合酶链反应技术检测不同型别的登革病毒[J].中华实验和临床病毒学杂志，1995，9(1)：56.
, http://www.100md.com 2，方美玉，陈火盛，陈翠华，等.嵌套式PCR法分型检测登革病毒基因[J].中山医科大学学报，1995，16(2)：39.
3，方美玉，陈火盛，陈翠华，等.通用引物体外扩增黄病毒核酸的研究[J].中华流行病学杂志，1993，14(特刊11号)：204.
4，Eliane Chungue，Claudine Roche，Marie-France Lefevre，et al.Ultra-rapid，simple，sensitive，and economical silica method for extraction of dengue viral RNA from clinical specimens and mosquitoes by reverse transcriptase-poly rase chain reaction[J].J Med Virol，1993，40：142.
5，T.Miraawati Sudiro，Hiroaki Ishiko，Sharone Green et al.Rapid diagnosis of dengue viremia by reverse transcriptase-polymerase chain reaction using 3-noncoding region universal primers[J].Am J Trop Med Hyg，1997，56(4)：424.
6，Kouichi Morita，Mariko Tanaka，Akira Igarashi，et al.Rapid Identification of dengue virus serotypes by using polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol，1991，10：2107., http://www.100md.com
摘 要：目的 根据登革病毒(DEN)3端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型通用引物，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测登革病毒1～4型RNA。方法 用C6/36细胞培养登革病毒。用热酚法提取病毒RNA，进行RT-PCR扩增，并对扩增产物测序。结果 DEN-2-NGC株可扩增出至少10TCID50的病毒，测序结果与已知序列一致。DEN-1～4型标准株和DEN-2-04与DEN-2-43株均能够扩增出唯一的一条特异条带。结论 应用通用引物RT-PCR法可从病毒浓度少至10TCID50的感染细胞培养液中检出DEN-2-NGC株病毒，并且该对通用引物对于其他3型登革病毒亦具有很好的通用性，其方法的特异性和敏感性亦较强。
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关键词：登革热病毒 RT-PCR 检测 基因
登革病毒(DEN)是引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的病原体，登革热是严重影响人类健康的世界范围的流行病。自1978年以来在我国两广和海南省，间或有较大规模流行，平常年份亦有散发流行。登革病毒的经典诊断方法为血清学实验，但该方法周期长。运用逆转录-PCR方法检测登革病毒的工作国内已有报道[1～3]，他们先后设计出一些通用引物及型特异引物，并且对组织培养的病毒和病人血清标本进行了扩增，试验结果较为理想。同时须指出的是，在对扩增产物的鉴定上以往一般采用凝胶电泳这一粗略的指标，缺乏准确性；又有采用Southern印记杂交方法的[1]，其假阳性率亦较高。而对病人血清标本的扩增试验[2]，由于没有事先对血清标本进行血清学验证，因而其检验结果的阳性率尚有待商榷[4]。本实验采用3端非编码区通用引物结合逆转录-聚合酶链技术(RT-PCR)的方法，它具有同以上方法一样的优越性，并且对扩增结果进行了DNA测序，用测序结果与已知的国际标准参考株序列进行对比，得到了最直接的验证。同时本实验也探索了检测病毒RNA的敏感性和特异性的问题。
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1 材料和方法
1.1 病毒株 登革病毒1～4型国际标准参考株分别为DEN-1夏威夷株、DEN-2-NGC株、DEN-3-H87株和DEN-4-H241株；国内分离的DEN-2型04株和DEN-2型43株。
1.2 病毒的培养 采用C6/36细胞培养。待细胞长成单层后接种病毒，当细胞病变作用(CPE)出现3+后，以4 000r/min离心去除细胞碎片，收集上清，在-20℃保存。
1.3 病毒滴定 采用96孔微量培养板，细胞加病毒同时培养，做TCID50滴定，直到细胞病变不再继续为止，DEN-2-NGC株的TCID50为107。
1.4 RNA提取 取1ml病毒培养液加0.2ml 40%PEG，4℃过夜；第2天以8 000r/min，4℃，离心20min，弃上清；然后用热酚法提RNA。其中乙醇沉淀一步为-20℃过夜或置液氮中沉淀15～20min。最后将RNA溶于20μl含0.5～1U/μl的RNAsin的TE或水中。
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1.5 引物设计 根据登革病毒GenBank提供的序列数据，其3非编码区10 406～10 423序列在登革4个血清型中是高度保守的，据此设计下列登革4个型的通用引物进行PCR扩增[5]。见表1。
表1 引物设计
Table 1 The designed oligonuclotide primers
正向引物：
Sense primers：
ALD-1
5
AAA
CCG
, 百拇医药
TGT
TGC
CTG
TAG-3
ALD-1b
5
AAA
CTG
TGC
AGC
CTG
TAG-3
反向引物：
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Antisense primer：
ALD-2
5
TCT
CTC
CCA
GCG
TCA
ATA-3
1.6 RT-PCR[6]
1.6.1 RNA逆转录 取样品RNA 0.1～0.5μg(10μl)，100℃5min；快速冰浴5min；加下游引物5μl，100℃2min；室温10min，简短离心。依次再加入下列试剂于该试管：RNAsin，1.0μl；5×1st buffer，6.0μl；0.1M DTT，3.0μl；dNTP(10μm)，3.0μl；M-MLV-Rtase(反转录酶)1.5μl。37℃水浴1h。
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1.6.2 PCR扩增 本实验注意的是退火温度应在58℃左右。对于DEN-1，3，4型应适当提高温度，变性条件为94℃，1min；延伸条件为72℃，1.5min。反应共进行25～30个循环。
对反应敏感性的验证：将DEN-2-NGC株病毒上清进行10倍递增稀释，其浓度从10-1～10-6，然后分别提取RNA进行RT-PCR。
对反应通用性的验证：以原液浓度扩增DEN-1，2，3，4型病毒和DEN-2-04，43株病毒。
1.6.3 凝胶电泳和测序 取扩增产物10μl以2%琼脂糖凝胶进行电泳，与标准DNA Marker比较分子量大小。对DEN-2-NGC株的扩增产物进行测序。
2 结果
2.1 RT-PCR产物的鉴定 将DEN-2-NGC株病毒培养液以10倍连续稀释，得到10-1，10-2，10-3，……，10-6浓度。分别扩增后，每个稀释度取产物10μl进行琼脂糖电泳，结果见图1。从电泳上可见每一浓度均能够得到唯一的一条目的条带，其大小位于核酸分子量标准的267～174bp之间，与预期的238bp相符，并且一直稀释到10TCID50浓度(即10-6稀释度)DNA条带仍清晰可见。说明其敏感性较高，最低可达到检测10TCID50病毒的RNA。
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图1 DEN-2-NGC株病毒RT-PCR扩增产物电泳
1～6：依次为10-1、10-2、……10-6稀释液
M：分子量标准C：正常细胞悬液对照
Fig 1 Agarose gel analysis of the DNA product from RT-PCR of RNA samples isolated from DEN-2-NGC1～6：diluted virus samples of 10-1、10-2、……10-6 times concentration respectively.
M：pGEM-3Zf(+)/Hae Ⅲ Markers
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C：normal cells suspension used as a negative control
2.2 登革1～4型病毒RT-PCR 用上述方法对登革1～4型病毒标准株和DEN-2-04株，DEN-2-43株进行扩增，结果见图2，图3。登革1～4型病毒扩增产物的片段大小分别为：DEN-1，229bp；DEN-2，238bp；DEN-3，227bp；DEN-4，241bp。
图2 登革病毒标准株的扩增产物电泳
M：核酸分子量标准C：正常C6/36细胞悬液对照
1～4：分别为DEN-1，2，3，4型病毒
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Fig.2 Agarosegel analysis of the DNA product from RT-PCR of RNA samples isolated from classical dengue viruses
M：pGEM-3Zf(+)/Hae Ⅲ MarkersC：normal cells suspension used as a negative control
图3 登革病毒2-04、2-43株扩增产物电泳
M：核酸分子量标准C：正常C6/36细胞悬液对照
04，43：DEN-2-04株，43株
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Fig.3 Agarosegel analysis of the DNA product from RT-PCR of RNA samples isolated from DEN-2-04 and DEN-2-43M：pGEM-3Zf(+)/Hae Ⅲ Markers
C：normal cells suspension used as a negative control
图2为DEN-1，2，3，和4型国际标准参考株病毒原液的RT-PCR扩增结果，各型病毒均能够得到唯一的一条目的条带，条带大小也在预期范围内。其中DEN-1型病毒条带较浅，可能由于培养所获病毒滴度低所致。DEN-2-NGC株扩增产物的测序结果与已知的DEN-2-NGC株序列相比较，在长度为238bp的范围内，仅有一个碱基不一致。即位于10425位的A被T取代，这可能由于扩增时碱基对错配或转化时在DH5α菌内基因突变所致。另外，图3为我国自行分离的DEN-2-04株和43株扩增结果，用该通用引物也能够扩增出唯一的一条目的条带。以上说明，该引物对DEN-1～4型国际标准参考株及我国自行分离的DEN-2-04株和43株的RNA检测都具有很好的通用性。
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3 讨论
登革病毒在C6/36细胞中培养，由其病变的变化可以看出一般在96h左右出现较明显的CPE[1]。到病变为约75%时大部分 细胞已经破裂，释放出装配完整的病毒颗粒；由于细胞破裂，细胞质以及部分细胞核中的核酸也被释放到培养液中。用这种培养液得到的上清成分复杂，干扰因素多，更接近于病人血清。用该对通用引物采用本实验室建立的RT-PCR方法可以清楚地扩增出登革病毒4个型别的国际标准参考株的相应序列；并以登革2型NGC株为样本进行了敏感性试验，可以检测到最低为10TCID50的病毒RNA，并且经测序证明扩增片段是特异的。综上说明结合该对引物的RT-PCR方法具有很好的通用性、特异性和敏感性，可作为登革热实验诊断的辅助方法。
检测登革病毒的传统血清学方法有：血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)、中和试验及测定IgG、IgM和登革抗体的试验。这些方法的不足之处是周期过长，涉及因素多，操作繁琐。现在，新的RT-PCR方法缩短了时间，提高了特异性和敏感性。由于PCR方法易出现非特异性结果，它只作为综合诊断的一个具体方法，单纯PCR结果还不能作为确诊的依据。把RT-PCR方法和登革热的临床诊断结合起来将有利于登革热的早期确诊。
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段鸿元(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
杨佩英(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
秦鄂德(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
于曼(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
欧武(军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京，100850)
参考文献
1，秦鄂德，杨佩英，于曼，等.应用通用引物聚合酶链反应技术检测不同型别的登革病毒[J].中华实验和临床病毒学杂志，1995，9(1)：56.
, http://www.100md.com 2，方美玉，陈火盛，陈翠华，等.嵌套式PCR法分型检测登革病毒基因[J].中山医科大学学报，1995，16(2)：39.
3，方美玉，陈火盛，陈翠华，等.通用引物体外扩增黄病毒核酸的研究[J].中华流行病学杂志，1993，14(特刊11号)：204.
4，Eliane Chungue，Claudine Roche，Marie-France Lefevre，et al.Ultra-rapid，simple，sensitive，and economical silica method for extraction of dengue viral RNA from clinical specimens and mosquitoes by reverse transcriptase-poly rase chain reaction[J].J Med Virol，1993，40：142.
5，T.Miraawati Sudiro，Hiroaki Ishiko，Sharone Green et al.Rapid diagnosis of dengue viremia by reverse transcriptase-polymerase chain reaction using 3-noncoding region universal primers[J].Am J Trop Med Hyg，1997，56(4)：424.
6，Kouichi Morita，Mariko Tanaka，Akira Igarashi，et al.Rapid Identification of dengue virus serotypes by using polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol，1991，10：2107., http://www.100md.com