聚合酶链反应用于深部真菌病早期诊断及分子流行病学研究进展
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国外医学皮肤性病学分册 2000年第26卷第1期
聚合酶链反应用于深部真菌病早期诊断及分子流行病学研究进展
上海铁道大学医学院附属甘泉医院皮肤科 朴英兰(综述)
北京医科大学第一医院真菌和真菌病研究中心 李若瑜(审校)
摘 要 近些年来，免疫缺损患者的大量增加，使条件性真菌感染的发病率迅速上升。由于系统性真菌病治疗困难。预后不良，及早确立诊断和判断感染来源显得十分重要。现就聚合酶链反应用于深部真菌感染的早期诊断以及非白念珠菌感染的分子流行病学研究的一些近期进展及应用前景作一综述。
关键词：深部真菌病 聚合酶链反应
系统性真菌病，特别是由念珠菌、隐球菌和曲霉等条件致病菌引起的真菌感染已成为院内感染死亡的主要原因之一。迄今为止，这类感染的诊断所用的方法依旧是镜检、培养和组织病理，由于这些方法的敏感性不高，加之在感染早期侵袭的病原菌较少，故获得早期诊断很困难[1-3]。但发生于某种原因导致免疫受损患者的真菌感染大多病势凶险，后期治疗十分困难，预后不良，因此能否及早确立诊断并针对病原菌进行治疗是挽救患者生命、改善预后的关键。同时尽快弄清传染源并予以干预阻断对防止暴发流行或再感染有着重要意义。分子生物学技术的发展，尤其是聚合酶链反应技术，为有效解决上述临床问题带来了希望。
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一、非白念珠菌感染的分子流行病学
在过去10年间，念珠菌引起粘膜和系统感染的发生率上升很快。尽管白念珠菌仍被公认为是念珠菌属(实际也是所有条件致病真菌)中最多见的病原菌，但大量研究表明其在临床分离菌中所占的比例在逐年下降，而非白念珠菌包括热带、光滑、近平滑、克柔和葡萄牙念珠菌等却越来越多地从临床标本中分离出；一些罕见菌种、如皱落念珠菌、挪威念珠菌、产朊念珠菌、涎沫念珠菌等也有引起感染的报道。这种致病菌谱变化的临床及流行病学意义尚不十分清楚。对临床分离菌株进行菌种鉴定和(或)种内分型，可提供有价值的资料。这些资料除了有助于医生选择敏感的抗真菌药物外，尚可追踪传染源，明确传播途径。因此，从流行学的角度，人们应该将病原体鉴定至个体株。例如有时需将不同患者的分离株或同一患者不同感染部位或不同感染时期的分离株进行比较。如果两株菌来自非同一克隆，则提示感染来源不同，而如果发现不同患者由同一母本的菌株所感染，则提示系交叉感染或是来自相同环境的菌株[4]。
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目前的问题是，尽管可用于非白念珠菌流行病学分析的技术有许多(其中绝大多数来源于对白念珠菌的研究)，但菌株均是用表型参数来进行比较分析的。表型分类方法难免有性状变异，方法繁琐、分型粗糙等缺点。自从80年代末期分子生物学技术的大量应用，才解决了许多表型参数分析所不能解决的问题。
(一)限制性内切酶分析(REA)：Scherer和Stevens[5]最早将REA技术应用于非白念珠菌，包括热带和近平滑念珠菌，并在其它的一些研究的应用中获得成功。但在一项对热带念珠菌引起胸外伤医源性暴发感染的鉴定中，尽管较早应用了REA分析，但其带型的复杂性却妨碍了对菌株的精确认定。DNA探针亦已应用于热带念珠菌(Ct-8)和克柔念珠菌(CkF1，2)的分子流行病学分析[6]。应用这些探针获得的特征性带型使菌株间彼此容易区分，近期又应用于光滑念珠菌的鉴定。另外Sullivan等[7]报道利用微卫星设计的寡核苷酸探针包含着一些短的重复序列，这些重复序列之间的DNA片段在不同菌种之间存在着一定的差异，由此所得到的分子指纹可直接地反映出物种之间的差异。
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(二)聚合酶链反应(PCR)：目前应用最为广泛的PCR菌株分型技术是随机扩增多态性DNA(RAPD)[8-9]。该PCR技术中的引物为4个碱基随机重复组合所构成的短核苷酸链，对靶基因组进行单引物扩增，反映基因组相应片段DNA多态性。随着PCR分析技术在临床上的大量应用，RAPD技术也越来越受到重视，特别是作为简单、快速、有效的分型方法在细菌、真菌、支原体、衣原体、螺旋体等微生物中得到广泛应用。自1992年这项技术首次被用于非白念珠菌以来[5]，已经成功地应用于各种相关研究中，其特点是简便、快速、灵敏地反映菌株的多态性，但缺陷是重复性稍差，不够精确。假如需要一个快速的结果来确定疾病暴发的来源及连续观察，那么宜选用RAPD；如果研究是对收集的分离株进行回顾性分析，则可考虑选用Southern杂交和脉冲场凝胶电泳。
总之，大多数非白念珠菌在遗传学上彼此是异质的，且种类是复合和多变的，这种菌株的多样性在检测艾滋病患者连续分离的口咽部菌株时可遇到。最近由于在各种酶母菌中证实了微进化(microevolution)或“亚株迁徙(substrain migration)”的存在，使这种情况变得更加复杂。尽管PCR技术在医学真菌学中的应用才刚刚开始，但已在医源性起源的判定、流行病学调查中显示了巨大的潜能。
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二、深部真菌病的PCR诊断
分子生物学技术对深部真菌病的快速诊断已成为关注的焦点。目前在临床实验室所进行的医学相关酵母菌的表型鉴定，仅仅是对培养出来的真菌而言。最近已有将PCR快速鉴定分析直接用于检测几种真菌包括白念珠菌和烟曲霉的报道。
(一)编码白念珠菌细胞色素P450L1A1基因序列：Buchman和Burgener-Kairuz等[10，11]于1990年率先利用探我或已知序列设计引物进行PCR检测，提高了临床早期诊断的可能性。编码细胞色素P450L1A1的基因序列是催化羊毛甾醇转化为麦角甾醇的重要步骤，该酶可被抗真菌药物咪唑类抑制，从而阻断真菌细胞壁形成，达到治疗目的。由于这种酶为真菌所特有，以此基因设计引物进行PCR扩增，可以快速从人体标本中检出白念珠菌。1994年，他们又对光滑和热带念珠菌的1.3kb片段进行克隆测序，分段与已发表的白念珠菌和热带念珠菌共有序列相比较，扩增的基因序列是高度保守的。PCR扩增阳性的菌种有白念珠菌、新生隐球菌和其它5种念珠菌。另外还选择了高度可变区基因[11]，对白念、光滑、克柔和热带念珠菌利用巢式PCR进行种特异性检测。其第1次PCR是用属特异性引物DH-1558扩增保守区远端螺旋结构和HR2区，在对80份临床标本培养阳性的检测中白念珠菌和光滑念珠菌的检出率为46%。第2次巢式PCR用种特异性引物DH-X选择扩增的是编码蛋白羧基端序列高度分歧的片段，其检出率为76%。对白念珠菌的敏感性在血培养标本中为86%，光滑念珠菌的敏感性为100%。其引物序列为：DHATGGGTGGTCAACATACTTC 1558 TACATCTATGTCTACCACC C.albicansGTITT(T/C)TA(T/C)TGGATICCITGG T.glabrata TTCGTCACCACCAGCAGCACT C.DRUSEI GCATTTTCACCTTCAG C.tropicalis GTATCTTCAGAATTGA。
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Morace等[12]用PCR-REA对临床标本中各种念珠菌进行鉴定，引物同样来自细胞色素P450 L1A1基因恒定区，扩增片段为300～350bp，可扩增包括白念珠菌在内的热带、克柔、光滑、季也蒙、近平滑和乳酒念珠菌。这些PCR产物用Sau 3A、HincⅡ和NsiⅠ进行酶切可得到完全不同的指纹图，使之能够鉴定到种的水平。他们用15例血标本和6例支气管肺泡灌洗液标本的PCR-REA结果与临床提供的血培养和抗原检测分析结果对照，表明PCR-REA有更好的敏感性。
(二)编码白念珠菌rRNA基因序列：编码rRNA基因在物种传代过程中是高度保守的。在rRNA重复区内的保守序列包含多拷贝和种特异性序列。Reiss等的引物就是从真菌18srRNA基因中挑选的，检测的敏感性对溴化已锭染色的白念珠菌基因组DNA是1pg，Southern印迹则敏感性可提高为100fg。研究者成功地从28种医学真菌中扩增出一687bp大小的阳性产物，但毛霉、申克孢子丝菌以及大肠杆菌、小朱胸腺或人胎盘血DNA则扩增阴性。Southern印迹分析进一步证实了该方法的特异性。标本的收集是从实验性系统感染白念珠菌的小鼠和深部真菌病患者中获得，来源包括血液、脑脊液和痰[4]。Hopfer等[13]选择的引物序列为NS5 AACTTAAAGGAATTGACGGAAG和NS6CGATCACAGACCTGTTATTGCCTC，可扩增出一个310bp的真菌界高度保守的特异性rDNA片段。用该引物对临床分离的30种真菌和17种细菌、5份人体细胞标本进行扩增，结果所有真菌均扩增出该片段，而细菌和人体细胞扩增阴性，且敏感性达到15cfu/ml。Holmes等[1]则选用了5S rDNA片段的AGTTTCGCGTATGGTCTCCC和GTTGCGGCCATATCTAGCAG为引物。在实验中发现至少有白念珠菌等6种念珠菌在单一PCR中被扩增出来，所得为105bp片段。白念珠菌特异性此物为NTS TAGCGATGAGGTAGTGCAAGT和GCTGCAGCTACGAATGTTAG，在所有的念珠中只有白念珠菌才出现预期的684bp产物。其敏感性为15±5cfu/ml。
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Burik[2]与Maiwald等[14]根据该序列分别设计了一对真菌通用引物，能扩增出念珠菌属和曲霉属等真菌。后者还用限制性内切酶进行PCR产物酶切，均获得预期的独特酶切带型。他们认为PCR-REA操作简单、快速，在菌种鉴定方面具有广阔的应用前景。
(三)几丁质合成酶基因序列：几丁质是真菌胞壁的重要组成成分，其合成酶基因序列已被用于分类学的基因标记[15]。Jordan等首次用该基因特异性片段设计引物并对引起90%以上新生儿念珠菌血症的白念、近平滑、热带和光滑念珠菌DNA进行PCR扩增和鉴定，其共同引物为CGCCTCTTGATGGTGATGAT和TCCGGTATGCCTGGCTC扩增产物为大小不等的一条区带。作者又合成了4种种特异性探针，扩增产物用Southern印迹来验证，其检出灵敏性为血浆中10cfu/100μl。然后又对血培养证实的16例念珠菌血症患者的27份血标本作了回顾性研究，该技术可在种水平上检测出26株念珠菌并对其进行鉴定[16]。
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三、PCR与念珠菌血症
对侵袭性念珠菌病及时的实验室诊断已成为临床的迫切需要，这就为临床应用PCR方法来检测血标本中的念珠菌提供了用武之地。首先程序必须是简单的，能短时间内直接从血中进行有效的标本制备；其次PCR重复的结果可达到排除假阳性和假阴性的目的。理想地，PCR检测念珠菌血症的结果与血培养是互补的，或当两者都为阳性时，它可比常规酵母菌鉴定更为快捷[17]。
病原真菌的分子指纹可能存在于所有的种中，这些种存在着足够的种间差异，由此选择的基因标记可能发展为标准方法来鉴定临床标本中任何一种真菌。编码rRNA基因是一个串连的重复，即：18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28SrRNA转录单位，分隔18S，5.8S，28S rRNA基因亚单位的是内转录间隔区(ITS)，为非编码区。ITS在两代之间进化很快，在属内的种甚或种内所有菌株之间存在变异[18]。采用通用真菌引物ITS3和ITS4，并参照ITS2区设计特异性的DNA探针，在26种念珠菌中扩增出66～240bp片段，不包括保守的侧翼序列。Fujita等[19]也描述了兼有类似于通用引物和种特异性探针的PCR引物用于检测5种主要的念珠菌。其标本制备约需4小时，敏感性在血中为10cfu/ml。
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深部真菌感染的研究目前正面临新的挑战。以形态学和生物化学等方法将致病性酵母菌鉴定到种并非难事，一般需要3～5，但在此期间患者体内真菌量可继续增加，如不进行有效救治，后果往往较为严重。通过以上文献综述，人们有理由相信，随着PCR及相关技术在临床的应用及更广泛深入的研究，将会对致病性念珠菌及其它真菌感染的诊断和鉴定产生根本的影响。
参考文献
1 Holmes AR et al.J Clin Microbiol,1994；32(1)：228-231
2 Burik JAV et al.J Clin Microbiol,1998;36(5):1169-1175
3 Flanagan PG et al J Hosp Infect,1998;38:163-177
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4 Reiss E et al.Med Mycol,1998;36(Suppl 1):249-257
5 Scherer S et al.J Clin Microbiol,1987;25:675-679
6 Carlotti A et al.J Clin Microbiol,1994;32:1691-9
7 Sullivan DJ et al.J Med Microbiol,1996;44:399-408
8 Welsh J et al.Nucl Acid Res,1990;18(24):7213-7217
9 Williams JGK et al.Nucl Acid Res,1990;18(22):6531-6535
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10 Buchman TG et al.Surgery,1990;108(2):338-247
11 Burgener-Kairuz P et al.J Clin Microbiol,1994;32(8):1902-1907
12 Morace G et al.J Clin Microbiol,1997;35(3):667
13 Hopfer RL et al.J Med Vet Mycol,1993;31(1):65-75
14 Maiwald et al.J Med Vet Mycol,1994;32(2):115
15 Seong-Pil C et al.Korean J Mycol,1997;25(3):167
16 Jordan JA.J Clin Microbiol,1994;32(12):2962-2967
17 Rand KH et al.Mol Cell Probes,1994;8:215-221
18 White TJ et al.PCR Protocols:A Guide to Methods and Applification,CA:Acad Press,1990:315-322
19 Fujita S et al.J Clin Microbiol,1995;33:962-967, http://www.100md.com
上海铁道大学医学院附属甘泉医院皮肤科 朴英兰(综述)
北京医科大学第一医院真菌和真菌病研究中心 李若瑜(审校)
摘 要 近些年来，免疫缺损患者的大量增加，使条件性真菌感染的发病率迅速上升。由于系统性真菌病治疗困难。预后不良，及早确立诊断和判断感染来源显得十分重要。现就聚合酶链反应用于深部真菌感染的早期诊断以及非白念珠菌感染的分子流行病学研究的一些近期进展及应用前景作一综述。
关键词：深部真菌病 聚合酶链反应
系统性真菌病，特别是由念珠菌、隐球菌和曲霉等条件致病菌引起的真菌感染已成为院内感染死亡的主要原因之一。迄今为止，这类感染的诊断所用的方法依旧是镜检、培养和组织病理，由于这些方法的敏感性不高，加之在感染早期侵袭的病原菌较少，故获得早期诊断很困难[1-3]。但发生于某种原因导致免疫受损患者的真菌感染大多病势凶险，后期治疗十分困难，预后不良，因此能否及早确立诊断并针对病原菌进行治疗是挽救患者生命、改善预后的关键。同时尽快弄清传染源并予以干预阻断对防止暴发流行或再感染有着重要意义。分子生物学技术的发展，尤其是聚合酶链反应技术，为有效解决上述临床问题带来了希望。
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一、非白念珠菌感染的分子流行病学
在过去10年间，念珠菌引起粘膜和系统感染的发生率上升很快。尽管白念珠菌仍被公认为是念珠菌属(实际也是所有条件致病真菌)中最多见的病原菌，但大量研究表明其在临床分离菌中所占的比例在逐年下降，而非白念珠菌包括热带、光滑、近平滑、克柔和葡萄牙念珠菌等却越来越多地从临床标本中分离出；一些罕见菌种、如皱落念珠菌、挪威念珠菌、产朊念珠菌、涎沫念珠菌等也有引起感染的报道。这种致病菌谱变化的临床及流行病学意义尚不十分清楚。对临床分离菌株进行菌种鉴定和(或)种内分型，可提供有价值的资料。这些资料除了有助于医生选择敏感的抗真菌药物外，尚可追踪传染源，明确传播途径。因此，从流行学的角度，人们应该将病原体鉴定至个体株。例如有时需将不同患者的分离株或同一患者不同感染部位或不同感染时期的分离株进行比较。如果两株菌来自非同一克隆，则提示感染来源不同，而如果发现不同患者由同一母本的菌株所感染，则提示系交叉感染或是来自相同环境的菌株[4]。
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目前的问题是，尽管可用于非白念珠菌流行病学分析的技术有许多(其中绝大多数来源于对白念珠菌的研究)，但菌株均是用表型参数来进行比较分析的。表型分类方法难免有性状变异，方法繁琐、分型粗糙等缺点。自从80年代末期分子生物学技术的大量应用，才解决了许多表型参数分析所不能解决的问题。
(一)限制性内切酶分析(REA)：Scherer和Stevens[5]最早将REA技术应用于非白念珠菌，包括热带和近平滑念珠菌，并在其它的一些研究的应用中获得成功。但在一项对热带念珠菌引起胸外伤医源性暴发感染的鉴定中，尽管较早应用了REA分析，但其带型的复杂性却妨碍了对菌株的精确认定。DNA探针亦已应用于热带念珠菌(Ct-8)和克柔念珠菌(CkF1，2)的分子流行病学分析[6]。应用这些探针获得的特征性带型使菌株间彼此容易区分，近期又应用于光滑念珠菌的鉴定。另外Sullivan等[7]报道利用微卫星设计的寡核苷酸探针包含着一些短的重复序列，这些重复序列之间的DNA片段在不同菌种之间存在着一定的差异，由此所得到的分子指纹可直接地反映出物种之间的差异。
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(二)聚合酶链反应(PCR)：目前应用最为广泛的PCR菌株分型技术是随机扩增多态性DNA(RAPD)[8-9]。该PCR技术中的引物为4个碱基随机重复组合所构成的短核苷酸链，对靶基因组进行单引物扩增，反映基因组相应片段DNA多态性。随着PCR分析技术在临床上的大量应用，RAPD技术也越来越受到重视，特别是作为简单、快速、有效的分型方法在细菌、真菌、支原体、衣原体、螺旋体等微生物中得到广泛应用。自1992年这项技术首次被用于非白念珠菌以来[5]，已经成功地应用于各种相关研究中，其特点是简便、快速、灵敏地反映菌株的多态性，但缺陷是重复性稍差，不够精确。假如需要一个快速的结果来确定疾病暴发的来源及连续观察，那么宜选用RAPD；如果研究是对收集的分离株进行回顾性分析，则可考虑选用Southern杂交和脉冲场凝胶电泳。
总之，大多数非白念珠菌在遗传学上彼此是异质的，且种类是复合和多变的，这种菌株的多样性在检测艾滋病患者连续分离的口咽部菌株时可遇到。最近由于在各种酶母菌中证实了微进化(microevolution)或“亚株迁徙(substrain migration)”的存在，使这种情况变得更加复杂。尽管PCR技术在医学真菌学中的应用才刚刚开始，但已在医源性起源的判定、流行病学调查中显示了巨大的潜能。
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二、深部真菌病的PCR诊断
分子生物学技术对深部真菌病的快速诊断已成为关注的焦点。目前在临床实验室所进行的医学相关酵母菌的表型鉴定，仅仅是对培养出来的真菌而言。最近已有将PCR快速鉴定分析直接用于检测几种真菌包括白念珠菌和烟曲霉的报道。
(一)编码白念珠菌细胞色素P450L1A1基因序列：Buchman和Burgener-Kairuz等[10，11]于1990年率先利用探我或已知序列设计引物进行PCR检测，提高了临床早期诊断的可能性。编码细胞色素P450L1A1的基因序列是催化羊毛甾醇转化为麦角甾醇的重要步骤，该酶可被抗真菌药物咪唑类抑制，从而阻断真菌细胞壁形成，达到治疗目的。由于这种酶为真菌所特有，以此基因设计引物进行PCR扩增，可以快速从人体标本中检出白念珠菌。1994年，他们又对光滑和热带念珠菌的1.3kb片段进行克隆测序，分段与已发表的白念珠菌和热带念珠菌共有序列相比较，扩增的基因序列是高度保守的。PCR扩增阳性的菌种有白念珠菌、新生隐球菌和其它5种念珠菌。另外还选择了高度可变区基因[11]，对白念、光滑、克柔和热带念珠菌利用巢式PCR进行种特异性检测。其第1次PCR是用属特异性引物DH-1558扩增保守区远端螺旋结构和HR2区，在对80份临床标本培养阳性的检测中白念珠菌和光滑念珠菌的检出率为46%。第2次巢式PCR用种特异性引物DH-X选择扩增的是编码蛋白羧基端序列高度分歧的片段，其检出率为76%。对白念珠菌的敏感性在血培养标本中为86%，光滑念珠菌的敏感性为100%。其引物序列为：DHATGGGTGGTCAACATACTTC 1558 TACATCTATGTCTACCACC C.albicansGTITT(T/C)TA(T/C)TGGATICCITGG T.glabrata TTCGTCACCACCAGCAGCACT C.DRUSEI GCATTTTCACCTTCAG C.tropicalis GTATCTTCAGAATTGA。
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Morace等[12]用PCR-REA对临床标本中各种念珠菌进行鉴定，引物同样来自细胞色素P450 L1A1基因恒定区，扩增片段为300～350bp，可扩增包括白念珠菌在内的热带、克柔、光滑、季也蒙、近平滑和乳酒念珠菌。这些PCR产物用Sau 3A、HincⅡ和NsiⅠ进行酶切可得到完全不同的指纹图，使之能够鉴定到种的水平。他们用15例血标本和6例支气管肺泡灌洗液标本的PCR-REA结果与临床提供的血培养和抗原检测分析结果对照，表明PCR-REA有更好的敏感性。
(二)编码白念珠菌rRNA基因序列：编码rRNA基因在物种传代过程中是高度保守的。在rRNA重复区内的保守序列包含多拷贝和种特异性序列。Reiss等的引物就是从真菌18srRNA基因中挑选的，检测的敏感性对溴化已锭染色的白念珠菌基因组DNA是1pg，Southern印迹则敏感性可提高为100fg。研究者成功地从28种医学真菌中扩增出一687bp大小的阳性产物，但毛霉、申克孢子丝菌以及大肠杆菌、小朱胸腺或人胎盘血DNA则扩增阴性。Southern印迹分析进一步证实了该方法的特异性。标本的收集是从实验性系统感染白念珠菌的小鼠和深部真菌病患者中获得，来源包括血液、脑脊液和痰[4]。Hopfer等[13]选择的引物序列为NS5 AACTTAAAGGAATTGACGGAAG和NS6CGATCACAGACCTGTTATTGCCTC，可扩增出一个310bp的真菌界高度保守的特异性rDNA片段。用该引物对临床分离的30种真菌和17种细菌、5份人体细胞标本进行扩增，结果所有真菌均扩增出该片段，而细菌和人体细胞扩增阴性，且敏感性达到15cfu/ml。Holmes等[1]则选用了5S rDNA片段的AGTTTCGCGTATGGTCTCCC和GTTGCGGCCATATCTAGCAG为引物。在实验中发现至少有白念珠菌等6种念珠菌在单一PCR中被扩增出来，所得为105bp片段。白念珠菌特异性此物为NTS TAGCGATGAGGTAGTGCAAGT和GCTGCAGCTACGAATGTTAG，在所有的念珠中只有白念珠菌才出现预期的684bp产物。其敏感性为15±5cfu/ml。
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Burik[2]与Maiwald等[14]根据该序列分别设计了一对真菌通用引物，能扩增出念珠菌属和曲霉属等真菌。后者还用限制性内切酶进行PCR产物酶切，均获得预期的独特酶切带型。他们认为PCR-REA操作简单、快速，在菌种鉴定方面具有广阔的应用前景。
(三)几丁质合成酶基因序列：几丁质是真菌胞壁的重要组成成分，其合成酶基因序列已被用于分类学的基因标记[15]。Jordan等首次用该基因特异性片段设计引物并对引起90%以上新生儿念珠菌血症的白念、近平滑、热带和光滑念珠菌DNA进行PCR扩增和鉴定，其共同引物为CGCCTCTTGATGGTGATGAT和TCCGGTATGCCTGGCTC扩增产物为大小不等的一条区带。作者又合成了4种种特异性探针，扩增产物用Southern印迹来验证，其检出灵敏性为血浆中10cfu/100μl。然后又对血培养证实的16例念珠菌血症患者的27份血标本作了回顾性研究，该技术可在种水平上检测出26株念珠菌并对其进行鉴定[16]。
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三、PCR与念珠菌血症
对侵袭性念珠菌病及时的实验室诊断已成为临床的迫切需要，这就为临床应用PCR方法来检测血标本中的念珠菌提供了用武之地。首先程序必须是简单的，能短时间内直接从血中进行有效的标本制备；其次PCR重复的结果可达到排除假阳性和假阴性的目的。理想地，PCR检测念珠菌血症的结果与血培养是互补的，或当两者都为阳性时，它可比常规酵母菌鉴定更为快捷[17]。
病原真菌的分子指纹可能存在于所有的种中，这些种存在着足够的种间差异，由此选择的基因标记可能发展为标准方法来鉴定临床标本中任何一种真菌。编码rRNA基因是一个串连的重复，即：18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28SrRNA转录单位，分隔18S，5.8S，28S rRNA基因亚单位的是内转录间隔区(ITS)，为非编码区。ITS在两代之间进化很快，在属内的种甚或种内所有菌株之间存在变异[18]。采用通用真菌引物ITS3和ITS4，并参照ITS2区设计特异性的DNA探针，在26种念珠菌中扩增出66～240bp片段，不包括保守的侧翼序列。Fujita等[19]也描述了兼有类似于通用引物和种特异性探针的PCR引物用于检测5种主要的念珠菌。其标本制备约需4小时，敏感性在血中为10cfu/ml。
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深部真菌感染的研究目前正面临新的挑战。以形态学和生物化学等方法将致病性酵母菌鉴定到种并非难事，一般需要3～5，但在此期间患者体内真菌量可继续增加，如不进行有效救治，后果往往较为严重。通过以上文献综述，人们有理由相信，随着PCR及相关技术在临床的应用及更广泛深入的研究，将会对致病性念珠菌及其它真菌感染的诊断和鉴定产生根本的影响。
参考文献
1 Holmes AR et al.J Clin Microbiol,1994；32(1)：228-231
2 Burik JAV et al.J Clin Microbiol,1998;36(5):1169-1175
3 Flanagan PG et al J Hosp Infect,1998;38:163-177
, http://www.100md.com
4 Reiss E et al.Med Mycol,1998;36(Suppl 1):249-257
5 Scherer S et al.J Clin Microbiol,1987;25:675-679
6 Carlotti A et al.J Clin Microbiol,1994;32:1691-9
7 Sullivan DJ et al.J Med Microbiol,1996;44:399-408
8 Welsh J et al.Nucl Acid Res,1990;18(24):7213-7217
9 Williams JGK et al.Nucl Acid Res,1990;18(22):6531-6535
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10 Buchman TG et al.Surgery,1990;108(2):338-247
11 Burgener-Kairuz P et al.J Clin Microbiol,1994;32(8):1902-1907
12 Morace G et al.J Clin Microbiol,1997;35(3):667
13 Hopfer RL et al.J Med Vet Mycol,1993;31(1):65-75
14 Maiwald et al.J Med Vet Mycol,1994;32(2):115
15 Seong-Pil C et al.Korean J Mycol,1997;25(3):167
16 Jordan JA.J Clin Microbiol,1994;32(12):2962-2967
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