确定HCMV抗药性实验方法研究进展
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国外医学病毒学分册 2000年第7卷第2期
确定HCMV抗药性实验方法研究进展
南京铁道医学院微生物教研室(210009) 窦 骏(综述)
浙江医科大学附属第一医院传染病研究所(310006) 刘克洲 陈 智(审校)
摘 要 HCMV感染免疫妥协的机体，通常是无症状的，但在AIDS和骨髓、实质器官移植病人，是引发病和死亡的主要原因之一，确定有毒力的、对病毒药产生抗性的HCMV株，对临床治疗HCMV感染引起的相关疾病很有必要。目前实验室用来确定HCMV抗药性敏感性实验方法有多种，且在不断改进和更新。本文对这些实验方法在临床上应用及其研究进展予以综述。
关键词：HCMV 抗药性 实验方法 人巨细胞病毒
, 百拇医药
人巨细胞病毒(HCMV)感染免疫功能低下的机体，临床上可引起广泛疾病，包括肺炎、脑炎、多神经根炎、结肠炎、食管炎、肾上腺炎、全身消瘦等，特别在AIDS和骨髓、实质器官移植病人，是引起机会性感染的主要病因之一，对这类病人的视力和生命构成了严重威胁[1，2]。GCV(ganciclovir 脱氧鸟苷类似物)、PFA(Phosphonoformic acid.磷甲酸钠)、CID(cido-fovir，开链核苷酸盐)、ACV(acyclovir,无苷鸟环)等药物，是目前准许临床上应用的抗病毒药物，对HCMV感染引起的相关疾病有较好的疗效。但对免疫功能严重低下的AIDS病人，及HCMV相关性视网膜炎等病人的治疗，需延长疗程，常可引起HCMV对药物的抗性，给临床治疗带来困难。因此，确定有毒力的、对抗病毒药物产生抗生的HCMV株，对临床指导治疗很有必要。目前实验室用来确定HCMV抗药性敏感实验方法大致可归为表现型和基因型两大类[3～5]。本文对这些实验方法在确定HCMV抗药性方面的应用及其优缺点加以简述。
, 百拇医药
1 表现型方法
表现型方法的设计是在病毒培养时，确定对病毒生长有抑制作用的抗病毒药物浓度。以细胞培养方法为基础，用已知的病毒感染量在有不同抗病毒药物浓度存在时，观察病毒的生长，以病毒的生长量来确定50%抑制病毒生长的抗病毒药物浓度，常用μM或μg/ml表示。根据表现型方法分析结果，将所检测病毒归为对某药物敏感或不敏感的HCMV株[6,7]。表现型方法有多种，在不同实验室应用中，根据情况和不同来源标本而采用相应的方法。
1.1 空斑减少实验 这种方法被认为是用来测试HCMV和其它病毒对抗病毒药物敏感性实验的“标准”方法[8]。该实验是将事先培养时已确定好的病毒滴度作为接种物，加入到含有不同药物浓度的细胞培养孔(瓶)中，可以观察培养的细胞出现病毒空(蚀)斑，以能引起细胞空(蚀)斑减少50%的药物浓度(IC50)来确定某病毒对药物的敏感性。空斑减少实验是精细的实验操作，包括以下步骤：(1)从细胞培养中分离病毒；(2)通过连续培养准备足量病毒用于实验；(3)确定实验使用的病毒滴度；(4)抗病毒药物敏感性测试。可见，空斑减少实验需要4～6周较长时间才能完成整个实验过程，同时，在不同的实验室中尚缺乏有效的标准化的实验方法，使得该法广泛应用受到限制。此外，为了准备实验用的足量病毒，需要连续分离培养，可能会筛选出原来病毒中不典型的病毒株而影响实验结果。
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1.2 DNA杂交实验 该方法通过细胞培养时,测量抗病毒药物对HCMV DNA合成的抑制效应来确定药物对HCMV的IC50。[9]用标准量的HCMV接种到细胞培养中,与不同的抗病毒药物浓度孵育。当没有加药物的对照孔出现60%～80%细胞病变时结束细胞培养(典型的细胞病变在培养6～8天后出现)。然后溶解细胞，抽提DNA，将其转染到尼龙膜上，在用125I标记的HCMV探针杂交，经洗涤、漂洗，最后在γ-计数仪上测每分种计数(CMP)。计算每种抗病毒药物浓度的平均杂交值(CPM)，并以对照孔的百分率表示结果。IC50是指与对照孔杂交值相比，用药孔核酸杂交值减少50%，以此确定抗病毒药物浓度。与空斑减少实验相似，DNA杂交实验需要分离病毒，连续培养准备足量病毒、以及病毒滴度测定，抗病毒药物敏感性测试。两种方法获得的实验结果有较好的相关性。DNA杂交实验的缺点是需要放射性探针，与空斑减少实验相比其优点是，排除了不同个体对空斑计数引起的主观性差错。
, 百拇医药 1.3 其它表现型方法 以培养为基础的各种方法已在不同的实验室中应用，来确定抗病毒药物对HCMV的敏感性。这些方法应用的原则与空斑减少实验雷同，但使用免疫荧光、免疫过氧化物酶、ELISA、FACS等方法来检测病毒产物，并对细胞表达的HCMV抗原进行定量分析，绘制好剂量抑制曲线，以确定药物对HCMV的IC50。这些实验方法均较麻烦，与空斑减少实验一样，应有其限制性[7,10]。
为减少鉴定HCMV对药物抗生所需时间，人们设法研制快速筛选方法，从最初的细胞培养及从临床分离的标本中直接检测对药物敏感性方法，因而产生了改良的空斑减少实验。这种方法只需5天时间就可确定分离标本中对药物的敏感性。在一项研究中，从有病毒血症病人分离的白细胞，用于改良的空斑减少实验的接种物，4～6天就可提供实验结果。而且检测出抗药株的准确性较高，但该法实验实用的限制病人病毒血症的水平太低，有时很难用此法来检测。
从实际应用的角度分析，不同实验室使用不同敏感性的实验方法，对某种抗病毒药物活性的研究，有时能得出不一致的结果。因此，在分析解释这一结果时比较困难。在不同的实验室影响药物敏感性结果的因素有：培养的细胞类型，不同标本接种物，作用的方法和实验室各自的常规操作等。为了减少实验方法差异性，更好地确定抗病毒药物敏感性的可靠性。AIDS临床实验组不久前对空斑减少实验进行了一次统一标准的试验。分布美国各处的13个实验室，通过一份从临床和从实验室分离的具有典型特征的HCMV株，对不同抗病毒药物敏感性进行实验。经统计分析后建议使用的IC50临界标准为：GCV>12μM，PFA>40μM，CID>2μM。最近有研究组提出更为精确的临界植标准为：当CID的IC50是>4μM，认为HCMV对其有抗性，当GCV的IC50界于>6μM>12μM之间。此HCMV株被看作是“中度抗性表现型”而且已经对GCV的敏感性开始减低[12，13]。
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2 基因型方法
HCMV的UL97(长单位)和UL54(DNA多聚酶)基因的特异性突变与病毒产生对抗病毒药物抗性有关。基因型方法设计的原则是确定HCMV株不同基因片段所发生的序列改变。
2.1 限制性酶切方法。该法是从HCMV感染的细胞培养物提取DNA进行PCR，扩增产物用限制性酶切方法分析HCMV UL97和UL54基因突变。一项研究显示，在UL97基因460位和694位密码子的突变，引起NlaⅢ和HhaⅠ限制性酶切点自然丢失，而在520位和595位的突变，又可导致附加一些限制性酶切点(如AluⅠ、MseⅠ和TaqⅠ)。这些基因突变位点，通过酶切后凝胶电泳能清晰辨别。当临床分离的HCMV达到该病毒种群的10%时，用这种筛选方能检出基因突变。有研究表明，临床分离的HCMV，用表现型方法鉴定对GCV有抗性的话，用限制性酶切方法则能检出78%对GCV有抗性。该法主要优点是能在2天内迅速获得敏感的信息，可直接用于临床标本(白细胞、血浆，脑脊液，眼房液等)检测。该法缺点是检出涉及到碱基改变的特异性改变，是否能引起限制性酶切位点改变，尚不能断定。此外，该法还“忽视”了对GCV抗性HCMV株。除了野生型HCMV的UL97基因序列突变外，可能包含DNA多聚酶基因(UL54)的突变。因此，当阳性结果能明确诊断HCMV株对GCV有抗性时，而阴性结果并非能肯定HCMV株对GCV是敏感的。
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2.2 PCR测序方法。该方法是通过PCR方法扩增所要检测的靶基因，再在DNA测序仪上检测靶基因核苷酸序列，最后与HCMV标准AD169株比较，最后确定突变的部位。与HCMV抗性相关的DNA多聚酶基因突变，常用此法鉴定。如用PCR测定方法可检出实验室分离的对GCV有抗性的HCMV株，突变主要位于UL54基因高度保守区，象412位(F→V)突变位于Ⅳ区；501位(L→I)突变位于(δ→C)区；987位(A→G)突变位于Ⅴ区等；虽然报道PCR测序方法的研究资料不多，但此法快速简便，敏感性高，影响因素小，对检测HCMV的UL97和UL54基因突变与抗病毒药物研究很有帮助，正在被越来越多的实验室采用[15]。从临床分离的HCMV株，是否对抗病毒药物有抗性，这与临床医师选择药物治疗HCMV感染引起的相关疾病很有帮助。因此，有学者认为，应把表现型方法和基因型方法结合起来，对筛选的HCMV进行研究，这对准确理解的HCMV抗性问题很有必要。但问题是，用基因型方法鉴定的UL97和UL54基因突变引起的HCMV抗性，在用表现型方法鉴定时，可能对病毒药物是敏感的。例如有研究显示，用空斑减少方法(表现型法)研究临床分离的HCMV株在UL97基因区594位密码子发生丙氨酸→缬氨酸的突变，仍然对GCV敏感；对骨髓移植受者分离的HCMV株，用DNA杂交方法(表现型法)得出，同样在UL97基因区594位发生丙氨酸→缬氨酸的突变，也对GCV敏感，而这两例病人分离的HCMV株用基因型方法研究显示，对GCV有抗性[16，17]。
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由此可见，同一标本用基因型方法检测出UL97和UL54基因突变引起的HCMV抗性，与用表现型方法检得出的结论相反，这种差异说明表现型方法检测HCMV对药物抗性的敏感性方法灵敏度可能要比基因型测序方法要低，这可能是HCMV感染的免疫妥协病人体内有多种不同HCMV株，也有可能是以细胞培养为基础的表现型检测方法，能够从用PCR测序方法研究的病人体内，筛选出不同的HCMV种群，但不论怎样，用表现型实验方法，检测已知的UL97和 UL54基因突变的病毒，确定HCMV对抗病毒药物的交叉反应抗性方式很重要，同时也有助于通过评价对突变病毒表现型影响，进而确定HCMV基因组中可能存在意义的单个位点突变。
3 结 语
近年来随着对HCMV药物抗性研究的深入，人们对HCMV产生药物抗生机制认识已有很大发展。期望基因型和表现型检测方法的不断改进与相互结合，将会产生更快，更敏感，更准确地检测HCMV对药物抗性的实验方法，直接为临床治疗感染服务。
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参考文献
1 Spector SA, Hsia K ,Crager M,et al. J Virol,1999;73:7027-7030
2 Prichard MN, Gao N, Jairath S,et al. la J Virol,1999;73:5663-5670
3 Erice A, Clin Microbiol Rev, 1999;12:286-297
4 Zimmermann A, Michel D, Pavic I, et al. Vaccina Virus Antivir Res,1997;36:35-42
5 Michel D, Kramer S, Hohn S, et al. J Virol,1999;73:8898-8901
, 百拇医药
6 Kimberlin DW, Spector SA, Hill EL,et all Antiviral Res,1995;26:403-413
7 Mcsharry JM, Lurain NS, Drusano GL, et al. J Clin Microbiol 1998:36-958-964
8 Biron KK, Fyfe JA, Stanat SC, et al. Proc Nati A-cad Sci USA, 1986:83:8769-8773
9 Dankner WM, Scholl D, Stanat SC, et al. J Virol Methods ,1990:28:293-298
10 Erice A, Gil-Roda C, Perez J,et al. J Infect Dis, 1997;175:1087-1092
, 百拇医药
11 Gerna G, Sarasini A, Percivalle E, et al. J Clin Mi-crobiol,1995;33:738-741
12 Crumpacker CS, Baldanti F, Boeck M,et al. Ac-quired Immunoe Defic Syndr Hum Retroviral,1996;12(Suuppl .l):SI～S22
13 Drew WL, Miner R, Saleh E, Clin Diagn Vrial, 1993;1:179-185
14 Hanson MN, Preheim LC, Chou S, Antimierob Agents Chemother,1995;39:1204-1205
15 Harada K, Eizuru Y, Isashiki Y, et al. Arch Virol,1997;142:215-225
16 Wolf DG, Lee DJ, Spector SA, J Infect Dis,1998;178:535-538
17 Erice A, Borrell N, Li W, et al. J Infect Dis,1998;178:531-534, 百拇医药
南京铁道医学院微生物教研室(210009) 窦 骏(综述)
浙江医科大学附属第一医院传染病研究所(310006) 刘克洲 陈 智(审校)
摘 要 HCMV感染免疫妥协的机体，通常是无症状的，但在AIDS和骨髓、实质器官移植病人，是引发病和死亡的主要原因之一，确定有毒力的、对病毒药产生抗性的HCMV株，对临床治疗HCMV感染引起的相关疾病很有必要。目前实验室用来确定HCMV抗药性敏感性实验方法有多种，且在不断改进和更新。本文对这些实验方法在临床上应用及其研究进展予以综述。
关键词：HCMV 抗药性 实验方法 人巨细胞病毒
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人巨细胞病毒(HCMV)感染免疫功能低下的机体，临床上可引起广泛疾病，包括肺炎、脑炎、多神经根炎、结肠炎、食管炎、肾上腺炎、全身消瘦等，特别在AIDS和骨髓、实质器官移植病人，是引起机会性感染的主要病因之一，对这类病人的视力和生命构成了严重威胁[1，2]。GCV(ganciclovir 脱氧鸟苷类似物)、PFA(Phosphonoformic acid.磷甲酸钠)、CID(cido-fovir，开链核苷酸盐)、ACV(acyclovir,无苷鸟环)等药物，是目前准许临床上应用的抗病毒药物，对HCMV感染引起的相关疾病有较好的疗效。但对免疫功能严重低下的AIDS病人，及HCMV相关性视网膜炎等病人的治疗，需延长疗程，常可引起HCMV对药物的抗性，给临床治疗带来困难。因此，确定有毒力的、对抗病毒药物产生抗生的HCMV株，对临床指导治疗很有必要。目前实验室用来确定HCMV抗药性敏感实验方法大致可归为表现型和基因型两大类[3～5]。本文对这些实验方法在确定HCMV抗药性方面的应用及其优缺点加以简述。
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1 表现型方法
表现型方法的设计是在病毒培养时，确定对病毒生长有抑制作用的抗病毒药物浓度。以细胞培养方法为基础，用已知的病毒感染量在有不同抗病毒药物浓度存在时，观察病毒的生长，以病毒的生长量来确定50%抑制病毒生长的抗病毒药物浓度，常用μM或μg/ml表示。根据表现型方法分析结果，将所检测病毒归为对某药物敏感或不敏感的HCMV株[6,7]。表现型方法有多种，在不同实验室应用中，根据情况和不同来源标本而采用相应的方法。
1.1 空斑减少实验 这种方法被认为是用来测试HCMV和其它病毒对抗病毒药物敏感性实验的“标准”方法[8]。该实验是将事先培养时已确定好的病毒滴度作为接种物，加入到含有不同药物浓度的细胞培养孔(瓶)中，可以观察培养的细胞出现病毒空(蚀)斑，以能引起细胞空(蚀)斑减少50%的药物浓度(IC50)来确定某病毒对药物的敏感性。空斑减少实验是精细的实验操作，包括以下步骤：(1)从细胞培养中分离病毒；(2)通过连续培养准备足量病毒用于实验；(3)确定实验使用的病毒滴度；(4)抗病毒药物敏感性测试。可见，空斑减少实验需要4～6周较长时间才能完成整个实验过程，同时，在不同的实验室中尚缺乏有效的标准化的实验方法，使得该法广泛应用受到限制。此外，为了准备实验用的足量病毒，需要连续分离培养，可能会筛选出原来病毒中不典型的病毒株而影响实验结果。
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1.2 DNA杂交实验 该方法通过细胞培养时,测量抗病毒药物对HCMV DNA合成的抑制效应来确定药物对HCMV的IC50。[9]用标准量的HCMV接种到细胞培养中,与不同的抗病毒药物浓度孵育。当没有加药物的对照孔出现60%～80%细胞病变时结束细胞培养(典型的细胞病变在培养6～8天后出现)。然后溶解细胞，抽提DNA，将其转染到尼龙膜上，在用125I标记的HCMV探针杂交，经洗涤、漂洗，最后在γ-计数仪上测每分种计数(CMP)。计算每种抗病毒药物浓度的平均杂交值(CPM)，并以对照孔的百分率表示结果。IC50是指与对照孔杂交值相比，用药孔核酸杂交值减少50%，以此确定抗病毒药物浓度。与空斑减少实验相似，DNA杂交实验需要分离病毒，连续培养准备足量病毒、以及病毒滴度测定，抗病毒药物敏感性测试。两种方法获得的实验结果有较好的相关性。DNA杂交实验的缺点是需要放射性探针，与空斑减少实验相比其优点是，排除了不同个体对空斑计数引起的主观性差错。
, 百拇医药 1.3 其它表现型方法 以培养为基础的各种方法已在不同的实验室中应用，来确定抗病毒药物对HCMV的敏感性。这些方法应用的原则与空斑减少实验雷同，但使用免疫荧光、免疫过氧化物酶、ELISA、FACS等方法来检测病毒产物，并对细胞表达的HCMV抗原进行定量分析，绘制好剂量抑制曲线，以确定药物对HCMV的IC50。这些实验方法均较麻烦，与空斑减少实验一样，应有其限制性[7,10]。
为减少鉴定HCMV对药物抗生所需时间，人们设法研制快速筛选方法，从最初的细胞培养及从临床分离的标本中直接检测对药物敏感性方法，因而产生了改良的空斑减少实验。这种方法只需5天时间就可确定分离标本中对药物的敏感性。在一项研究中，从有病毒血症病人分离的白细胞，用于改良的空斑减少实验的接种物，4～6天就可提供实验结果。而且检测出抗药株的准确性较高，但该法实验实用的限制病人病毒血症的水平太低，有时很难用此法来检测。
从实际应用的角度分析，不同实验室使用不同敏感性的实验方法，对某种抗病毒药物活性的研究，有时能得出不一致的结果。因此，在分析解释这一结果时比较困难。在不同的实验室影响药物敏感性结果的因素有：培养的细胞类型，不同标本接种物，作用的方法和实验室各自的常规操作等。为了减少实验方法差异性，更好地确定抗病毒药物敏感性的可靠性。AIDS临床实验组不久前对空斑减少实验进行了一次统一标准的试验。分布美国各处的13个实验室，通过一份从临床和从实验室分离的具有典型特征的HCMV株，对不同抗病毒药物敏感性进行实验。经统计分析后建议使用的IC50临界标准为：GCV>12μM，PFA>40μM，CID>2μM。最近有研究组提出更为精确的临界植标准为：当CID的IC50是>4μM，认为HCMV对其有抗性，当GCV的IC50界于>6μM>12μM之间。此HCMV株被看作是“中度抗性表现型”而且已经对GCV的敏感性开始减低[12，13]。
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2 基因型方法
HCMV的UL97(长单位)和UL54(DNA多聚酶)基因的特异性突变与病毒产生对抗病毒药物抗性有关。基因型方法设计的原则是确定HCMV株不同基因片段所发生的序列改变。
2.1 限制性酶切方法。该法是从HCMV感染的细胞培养物提取DNA进行PCR，扩增产物用限制性酶切方法分析HCMV UL97和UL54基因突变。一项研究显示，在UL97基因460位和694位密码子的突变，引起NlaⅢ和HhaⅠ限制性酶切点自然丢失，而在520位和595位的突变，又可导致附加一些限制性酶切点(如AluⅠ、MseⅠ和TaqⅠ)。这些基因突变位点，通过酶切后凝胶电泳能清晰辨别。当临床分离的HCMV达到该病毒种群的10%时，用这种筛选方能检出基因突变。有研究表明，临床分离的HCMV，用表现型方法鉴定对GCV有抗性的话，用限制性酶切方法则能检出78%对GCV有抗性。该法主要优点是能在2天内迅速获得敏感的信息，可直接用于临床标本(白细胞、血浆，脑脊液，眼房液等)检测。该法缺点是检出涉及到碱基改变的特异性改变，是否能引起限制性酶切位点改变，尚不能断定。此外，该法还“忽视”了对GCV抗性HCMV株。除了野生型HCMV的UL97基因序列突变外，可能包含DNA多聚酶基因(UL54)的突变。因此，当阳性结果能明确诊断HCMV株对GCV有抗性时，而阴性结果并非能肯定HCMV株对GCV是敏感的。
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2.2 PCR测序方法。该方法是通过PCR方法扩增所要检测的靶基因，再在DNA测序仪上检测靶基因核苷酸序列，最后与HCMV标准AD169株比较，最后确定突变的部位。与HCMV抗性相关的DNA多聚酶基因突变，常用此法鉴定。如用PCR测定方法可检出实验室分离的对GCV有抗性的HCMV株，突变主要位于UL54基因高度保守区，象412位(F→V)突变位于Ⅳ区；501位(L→I)突变位于(δ→C)区；987位(A→G)突变位于Ⅴ区等；虽然报道PCR测序方法的研究资料不多，但此法快速简便，敏感性高，影响因素小，对检测HCMV的UL97和UL54基因突变与抗病毒药物研究很有帮助，正在被越来越多的实验室采用[15]。从临床分离的HCMV株，是否对抗病毒药物有抗性，这与临床医师选择药物治疗HCMV感染引起的相关疾病很有帮助。因此，有学者认为，应把表现型方法和基因型方法结合起来，对筛选的HCMV进行研究，这对准确理解的HCMV抗性问题很有必要。但问题是，用基因型方法鉴定的UL97和UL54基因突变引起的HCMV抗性，在用表现型方法鉴定时，可能对病毒药物是敏感的。例如有研究显示，用空斑减少方法(表现型法)研究临床分离的HCMV株在UL97基因区594位密码子发生丙氨酸→缬氨酸的突变，仍然对GCV敏感；对骨髓移植受者分离的HCMV株，用DNA杂交方法(表现型法)得出，同样在UL97基因区594位发生丙氨酸→缬氨酸的突变，也对GCV敏感，而这两例病人分离的HCMV株用基因型方法研究显示，对GCV有抗性[16，17]。
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由此可见，同一标本用基因型方法检测出UL97和UL54基因突变引起的HCMV抗性，与用表现型方法检得出的结论相反，这种差异说明表现型方法检测HCMV对药物抗性的敏感性方法灵敏度可能要比基因型测序方法要低，这可能是HCMV感染的免疫妥协病人体内有多种不同HCMV株，也有可能是以细胞培养为基础的表现型检测方法，能够从用PCR测序方法研究的病人体内，筛选出不同的HCMV种群，但不论怎样，用表现型实验方法，检测已知的UL97和 UL54基因突变的病毒，确定HCMV对抗病毒药物的交叉反应抗性方式很重要，同时也有助于通过评价对突变病毒表现型影响，进而确定HCMV基因组中可能存在意义的单个位点突变。
3 结 语
近年来随着对HCMV药物抗性研究的深入，人们对HCMV产生药物抗生机制认识已有很大发展。期望基因型和表现型检测方法的不断改进与相互结合，将会产生更快，更敏感，更准确地检测HCMV对药物抗性的实验方法，直接为临床治疗感染服务。
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参考文献
1 Spector SA, Hsia K ,Crager M,et al. J Virol,1999;73:7027-7030
2 Prichard MN, Gao N, Jairath S,et al. la J Virol,1999;73:5663-5670
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17 Erice A, Borrell N, Li W, et al. J Infect Dis,1998;178:531-534, 百拇医药