黄菊液雾浴治疗兔实验性单纯疱疹病毒角膜炎研究
申厚凤 陈红菊 汤念翥 陈阳 李国才 焦红梅
摘 要：目的 证实用黄菊液雾浴法治疗家兔实验性单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)角膜炎的效果。方法 以HSV-Ⅰ感染家兔眼角膜，用黄菊液进行雾浴治疗，分别用裂隙灯检查和扫描电镜观察病变情况，并与对照组比较。结果与结论 治疗组与对照组差别明显，黄菊液雾浴治疗单纯疱疹病毒性角膜炎具有良好的效果。
关键词：黄菊液 雾浴治疗 单纯疱疹病毒性角膜炎
黄菊液为纯中药制剂，在细胞培养条件下显示出良好的预防和治疗HSV-Ⅰ感染作用，在临床治疗疱疹性角膜炎中亦显示出良好的疗效。为进一步证实其抗HSV-Ⅰ作用，特进行本研究，结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 健康家兔8只，体重2～3kg，雌雄不分，由扬州大学医学院动物室提供。
1.1.2 病毒 HSV-Ⅰ(Storke株)，由中国预防医科院病毒研究所引入。
1.1.3 细胞 BHK21细胞由上海细胞生物学研究所引入。
1.1.4 药物 黄菊液为棕色水煎剂，由泰兴市中医院提供，系临床经验方。主要由黄芪、大黄、野菊花等7味中药组成。含量为2g生药/ml。批号：981020。
1.1.5 眼科雾浴治疗仪 TX98-Ⅰ型，泰兴市中医院产品。
1.1.6 H-300型电镜 日本日立公司产品。
, 百拇医药
1.1.7 YZ-5CS2照相裂隙灯显微镜 苏州医疗器械厂产。
1.2 方法
1.2.1 病毒制备 BHK21细胞培养成单层后，加入HSV-Ⅰ吸附1h，放37℃5%CO2培养箱内增毒，待出现75%以上细胞病变时收获，调整滴度为10TCID50/0.1ml。细菌和真菌培养阴性。
1.2.2 HSV-Ⅰ感染家兔 每兔双眼用1%的卡因表面麻醉角膜，作4mm“＃”字划痕，滴入病毒原液30μl，闭睑轻揉30sec，单笼饲养。
1.2.3 感染后24h供药 右眼滴对照液(人白蛋白20mg/ml、0.5%卡那霉素)，每次2滴，每日3次。左眼用黄菊液雾浴15min，每日1次，雾浴温度为30℃。
, http://www.100md.com 1.2.4 临床观察 每日检查外眼情况，行裂隙灯检查和病变拍照。
1.2.5 扫描电镜观察[1] 接种病毒后4、8、12d分别取双眼角膜标本，经戊二醛与锇酸双固定，CO2临界点干燥，真空喷金，用H-300透射电镜扫描附件观察。
1.2.6 病灶分级[2]
Ⅰ级：点状病灶数<10，范围<1/4角膜面积。
Ⅱ级：点状病灶数<20，或出现短树枝状病灶，范围1/4～2/4角膜面积。
Ⅲ级：点状病灶数<30，或树枝状、地图状病灶，范围2/4～3/4角膜面积。
Ⅳ级：密集树枝状或大片地图状病灶，范围3/4～4/4角膜面积。
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计算病毒对照眼、黄菊液雾浴治疗眼每日病灶平均值，作对照比较，结果经统计学处理。
2 结果
2.1 黄菊液雾浴治疗家兔实验性HSV-Ⅰ感染裂隙灯检查结果见表1。
表1 黄菊液雾浴治疗家兔实验性HSV-Ⅰ感染裂隙灯检查结果
Tab.1 The therapy results of HUANGJU extraction to HSV-Ⅰ infection examined by crevice light
感染天数
Days after
infection
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试验组
experimental group
对照组
control group
P值
病变数
未病变数
病变程度
病变数
未病变数
病变程度
2
0
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8
0
8
>0.05
3
0
8
3
5
Ⅰ级
<0.05
4
2
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Ⅰ级
8
0
Ⅰ级
<0.01
5
2
4
Ⅰ级—Ⅱ级
6
0
Ⅰ级—Ⅱ级
<0.05
6
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2
4
Ⅰ级—Ⅱ级
6
0
Ⅱ级—Ⅲ级
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7
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4
Ⅰ级—Ⅱ级
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Ⅱ级—Ⅲ级
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<0.05
8
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0
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4
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4
0
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<0.05
12
1
3
Ⅱ级
4
0
Ⅱ级—Ⅲ级
<0.05
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2.2 正常兔角膜上皮细胞扫描电镜观察，细胞界限清晰，呈正常多边形形态。裂隙灯检查无荧光素着色点。
2.3 兔眼角膜划痕感染HSV-Ⅰ，第3天病毒感染对照组开始出现病变。第4天可见眼睫状充血，角膜上有数个浸润点(图2)。扫描电镜显示受染细胞浆收缩圆化，失去正常多边形形态，病变细胞间连接松懈，出现缝隙，部分角膜细胞破溃(图7)。而治疗组8只家兔左眼中共有3只出现病变，潜伏期3～5天，稍长于病毒感染对照组。感染第4天时，治疗组兔眼外观正常，但荧光素染色可见角膜中央有1个浸润点(图1)，电镜下可见兔角膜大部分上皮细胞正常，仅少数细胞受损(图6)。第5天起对照组兔眼睫状充血明显。第8天可见结膜轻度水肿，角膜浸润，范围达1/2(图4)，电镜下可见兔角膜细胞破溃明显，以后逐渐加重(图9)。而治疗组用裂隙灯检查，角膜未见明显浸润点(图3)。扫描电镜下可见细胞已趋正常(图8)。至第12天时对照组兔眼分泌物(+)，睑缘充血水肿，混合性充血(++)，角膜溃疡呈地图状(图5)，电镜下可见兔角膜上皮细胞破损严重(图10)。治疗组家兔经治疗后病变得到控制。只有一只家兔的病变发展为溃疡，后经解剖发现有化脓性感染，可能是因细菌继发感染所致。
, 百拇医药
图1 用裂隙灯检查兔眼角膜，感染4天时，治疗组眼外观正常，角膜中央有1个浸润点
Fig.1 The pathological changes of eyes examined by crevice light,experimental group (4 days)
图2 用裂隙灯检查眼角膜，感染4天时，对照组眼睫状充血，角膜上12个浸润点连成3个短树枝状
Fig.2 The pathological changes of eyes examined by crevice light,control group,(4 days)
, 百拇医药
图3 用裂隙灯检查眼角膜，感染8天时，治疗组眼角膜未见明显浸润点
Fig.3 The pathological changes of eyes examined by crevice light,experimental group (8 days)
图4 用裂隙灯检查眼角膜，感染8天时，对照组眼角膜浸润范围达1/2
Fig.4 The pathological changes of eyes examined by crevice light,control group (8 days)
, 百拇医药
图5 用裂隙灯检查眼角膜，感染12天时，对照组眼角膜破溃约3×4mm大小，呈地图状
Fig.5 The pathological changes of eyes examined by crevice light,control group (12 days)
图6 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染4天时治疗组兔眼角膜细胞大部分正常，仅少数细胞受损(×1000)
Fig.6 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope,experimental group (4 days)
, http://www.100md.com
图7 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染4天时，对照组眼角膜细胞破溃(×1000)
Fig.7 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope,control group (4 days)
图8 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染8天时治疗组眼角膜细胞大部分正常，仅少数细胞受损(×1000)
Fig.8 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope experimental group (8 days)
, 百拇医药
图9 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染8天时，对照组眼角膜细胞破溃(×1000)
Fig.9 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope,control group (8 days)
图10 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染12天时，对照组眼角膜细胞破损严重(×2000)
Fig.10 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope,control group (12 days)
, 百拇医药
3 讨论
HSV可引起多种不同的病症。其中，眼角膜结膜炎主要由Ⅰ型病毒引起，在新生儿也可由Ⅱ型病毒引起。其特点是分泌物很少或无分泌物。复发性病变表现为树枝状角膜炎或角膜溃疡，病变可达角膜基层，引起角膜永久性浑浊甚至失明[3]。HSV-Ⅰ的易感细胞是成纤维细胞，原始受染细胞内新合成的子代病毒通过细胞—细胞途径直接感染相邻细胞[4]，其破坏是一种裂解性破坏[5]。病毒对受染细胞的裂解性破坏，加上机体对HSV-Ⅰ抗原的免疫应答，进一步加重了这种破坏，从而导致角膜形成白色疤痕，出现病灶[6]。
抗病毒药物的作用，可能表现在直接抑制病毒增殖和对机体细胞的保护作用，对病毒复制某些环节上的干扰作用以及对提高机体免疫状态起着佐剂的作用[7]。本研究所用黄菊液为7种中药成分经水煎后浓缩而成，可能直接灭活病毒，或诱生干扰素，减少或阻断病毒mRNA的翻译，还可作用于邻近细胞表面的特殊膜系统。提高机体免疫功能与抗病毒作用。
, 百拇医药
申厚凤(扬州大学医学院 扬州，225001)
陈红菊(扬州大学医学院 扬州，225001)
汤念翥(扬州大学医学院 扬州，225001)
陈阳(泰兴市中医院)
李国才(扬州大学医学院 扬州，225001)
焦红梅(扬州大学医学院 扬州，225001)
参考文献
1，宋琛.眼组织电镜图谱[M].北京：人民军医出版社，1988，51～53.
2，金秀英，等.基因工程干扰素治疗实验性单疱角膜炎的临床与扫描电镜观察[J].中华眼科杂志，1990，26(1)∶36.
, http://www.100md.com
3，黄帧祥，主编.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990.96.
4，Christian RT，et al.Cell to cell transmission of HSV in primary human amnion cells[J].Pros Soc Exp Biol Med，1971，138∶1109.
5，陈德怀，等.实验性单疱角膜炎的动态电镜观察[J].中华实验和临床病毒学杂志，1995，9(4)∶364.
6，钟慈声，主编.细胞和组织的超微结构[M].北京：人民卫生出版社，1984，187.
7，郑民实，等.抗病毒药物的实验室和临床研究进展[J].药学通报，1981，16(6)∶38., http://www.100md.com
摘 要：目的 证实用黄菊液雾浴法治疗家兔实验性单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)角膜炎的效果。方法 以HSV-Ⅰ感染家兔眼角膜，用黄菊液进行雾浴治疗，分别用裂隙灯检查和扫描电镜观察病变情况，并与对照组比较。结果与结论 治疗组与对照组差别明显，黄菊液雾浴治疗单纯疱疹病毒性角膜炎具有良好的效果。
关键词：黄菊液 雾浴治疗 单纯疱疹病毒性角膜炎
黄菊液为纯中药制剂，在细胞培养条件下显示出良好的预防和治疗HSV-Ⅰ感染作用，在临床治疗疱疹性角膜炎中亦显示出良好的疗效。为进一步证实其抗HSV-Ⅰ作用，特进行本研究，结果报告如下。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 健康家兔8只，体重2～3kg，雌雄不分，由扬州大学医学院动物室提供。
1.1.2 病毒 HSV-Ⅰ(Storke株)，由中国预防医科院病毒研究所引入。
1.1.3 细胞 BHK21细胞由上海细胞生物学研究所引入。
1.1.4 药物 黄菊液为棕色水煎剂，由泰兴市中医院提供，系临床经验方。主要由黄芪、大黄、野菊花等7味中药组成。含量为2g生药/ml。批号：981020。
1.1.5 眼科雾浴治疗仪 TX98-Ⅰ型，泰兴市中医院产品。
1.1.6 H-300型电镜 日本日立公司产品。
, 百拇医药
1.1.7 YZ-5CS2照相裂隙灯显微镜 苏州医疗器械厂产。
1.2 方法
1.2.1 病毒制备 BHK21细胞培养成单层后，加入HSV-Ⅰ吸附1h，放37℃5%CO2培养箱内增毒，待出现75%以上细胞病变时收获，调整滴度为10TCID50/0.1ml。细菌和真菌培养阴性。
1.2.2 HSV-Ⅰ感染家兔 每兔双眼用1%的卡因表面麻醉角膜，作4mm“＃”字划痕，滴入病毒原液30μl，闭睑轻揉30sec，单笼饲养。
1.2.3 感染后24h供药 右眼滴对照液(人白蛋白20mg/ml、0.5%卡那霉素)，每次2滴，每日3次。左眼用黄菊液雾浴15min，每日1次，雾浴温度为30℃。
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1.2.5 扫描电镜观察[1] 接种病毒后4、8、12d分别取双眼角膜标本，经戊二醛与锇酸双固定，CO2临界点干燥，真空喷金，用H-300透射电镜扫描附件观察。
1.2.6 病灶分级[2]
Ⅰ级：点状病灶数<10，范围<1/4角膜面积。
Ⅱ级：点状病灶数<20，或出现短树枝状病灶，范围1/4～2/4角膜面积。
Ⅲ级：点状病灶数<30，或树枝状、地图状病灶，范围2/4～3/4角膜面积。
Ⅳ级：密集树枝状或大片地图状病灶，范围3/4～4/4角膜面积。
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计算病毒对照眼、黄菊液雾浴治疗眼每日病灶平均值，作对照比较，结果经统计学处理。
2 结果
2.1 黄菊液雾浴治疗家兔实验性HSV-Ⅰ感染裂隙灯检查结果见表1。
表1 黄菊液雾浴治疗家兔实验性HSV-Ⅰ感染裂隙灯检查结果
Tab.1 The therapy results of HUANGJU extraction to HSV-Ⅰ infection examined by crevice light
感染天数
Days after
infection
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试验组
experimental group
对照组
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P值
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Ⅱ级
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Ⅱ级—Ⅲ级
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Ⅱ级—Ⅲ级
<0.05
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2.2 正常兔角膜上皮细胞扫描电镜观察，细胞界限清晰，呈正常多边形形态。裂隙灯检查无荧光素着色点。
2.3 兔眼角膜划痕感染HSV-Ⅰ，第3天病毒感染对照组开始出现病变。第4天可见眼睫状充血，角膜上有数个浸润点(图2)。扫描电镜显示受染细胞浆收缩圆化，失去正常多边形形态，病变细胞间连接松懈，出现缝隙，部分角膜细胞破溃(图7)。而治疗组8只家兔左眼中共有3只出现病变，潜伏期3～5天，稍长于病毒感染对照组。感染第4天时，治疗组兔眼外观正常，但荧光素染色可见角膜中央有1个浸润点(图1)，电镜下可见兔角膜大部分上皮细胞正常，仅少数细胞受损(图6)。第5天起对照组兔眼睫状充血明显。第8天可见结膜轻度水肿，角膜浸润，范围达1/2(图4)，电镜下可见兔角膜细胞破溃明显，以后逐渐加重(图9)。而治疗组用裂隙灯检查，角膜未见明显浸润点(图3)。扫描电镜下可见细胞已趋正常(图8)。至第12天时对照组兔眼分泌物(+)，睑缘充血水肿，混合性充血(++)，角膜溃疡呈地图状(图5)，电镜下可见兔角膜上皮细胞破损严重(图10)。治疗组家兔经治疗后病变得到控制。只有一只家兔的病变发展为溃疡，后经解剖发现有化脓性感染，可能是因细菌继发感染所致。
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图1 用裂隙灯检查兔眼角膜，感染4天时，治疗组眼外观正常，角膜中央有1个浸润点
Fig.1 The pathological changes of eyes examined by crevice light,experimental group (4 days)
图2 用裂隙灯检查眼角膜，感染4天时，对照组眼睫状充血，角膜上12个浸润点连成3个短树枝状
Fig.2 The pathological changes of eyes examined by crevice light,control group,(4 days)
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图3 用裂隙灯检查眼角膜，感染8天时，治疗组眼角膜未见明显浸润点
Fig.3 The pathological changes of eyes examined by crevice light,experimental group (8 days)
图4 用裂隙灯检查眼角膜，感染8天时，对照组眼角膜浸润范围达1/2
Fig.4 The pathological changes of eyes examined by crevice light,control group (8 days)
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图5 用裂隙灯检查眼角膜，感染12天时，对照组眼角膜破溃约3×4mm大小，呈地图状
Fig.5 The pathological changes of eyes examined by crevice light,control group (12 days)
图6 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染4天时治疗组兔眼角膜细胞大部分正常，仅少数细胞受损(×1000)
Fig.6 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope,experimental group (4 days)
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图7 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染4天时，对照组眼角膜细胞破溃(×1000)
Fig.7 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope,control group (4 days)
图8 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染8天时治疗组眼角膜细胞大部分正常，仅少数细胞受损(×1000)
Fig.8 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope experimental group (8 days)
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图9 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染8天时，对照组眼角膜细胞破溃(×1000)
Fig.9 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope,control group (8 days)
图10 用扫描电镜检查眼角膜细胞病变，感染12天时，对照组眼角膜细胞破损严重(×2000)
Fig.10 The pathological changes of eyes examined by scanning electromicroscope,control group (12 days)
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3 讨论
HSV可引起多种不同的病症。其中，眼角膜结膜炎主要由Ⅰ型病毒引起，在新生儿也可由Ⅱ型病毒引起。其特点是分泌物很少或无分泌物。复发性病变表现为树枝状角膜炎或角膜溃疡，病变可达角膜基层，引起角膜永久性浑浊甚至失明[3]。HSV-Ⅰ的易感细胞是成纤维细胞，原始受染细胞内新合成的子代病毒通过细胞—细胞途径直接感染相邻细胞[4]，其破坏是一种裂解性破坏[5]。病毒对受染细胞的裂解性破坏，加上机体对HSV-Ⅰ抗原的免疫应答，进一步加重了这种破坏，从而导致角膜形成白色疤痕，出现病灶[6]。
抗病毒药物的作用，可能表现在直接抑制病毒增殖和对机体细胞的保护作用，对病毒复制某些环节上的干扰作用以及对提高机体免疫状态起着佐剂的作用[7]。本研究所用黄菊液为7种中药成分经水煎后浓缩而成，可能直接灭活病毒，或诱生干扰素，减少或阻断病毒mRNA的翻译，还可作用于邻近细胞表面的特殊膜系统。提高机体免疫功能与抗病毒作用。
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申厚凤(扬州大学医学院 扬州，225001)
陈红菊(扬州大学医学院 扬州，225001)
汤念翥(扬州大学医学院 扬州，225001)
陈阳(泰兴市中医院)
李国才(扬州大学医学院 扬州，225001)
焦红梅(扬州大学医学院 扬州，225001)
参考文献
1，宋琛.眼组织电镜图谱[M].北京：人民军医出版社，1988，51～53.
2，金秀英，等.基因工程干扰素治疗实验性单疱角膜炎的临床与扫描电镜观察[J].中华眼科杂志，1990，26(1)∶36.
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3，黄帧祥，主编.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990.96.
4，Christian RT，et al.Cell to cell transmission of HSV in primary human amnion cells[J].Pros Soc Exp Biol Med，1971，138∶1109.
5，陈德怀，等.实验性单疱角膜炎的动态电镜观察[J].中华实验和临床病毒学杂志，1995，9(4)∶364.
6，钟慈声，主编.细胞和组织的超微结构[M].北京：人民卫生出版社，1984，187.
7，郑民实，等.抗病毒药物的实验室和临床研究进展[J].药学通报，1981，16(6)∶38., http://www.100md.com