原位杂交检测子宫内膜癌中金黄色葡萄球菌L型DNA
夏佩莹 汪万英 赵发英 郭才 何杰
摘 要：目的 研究细菌L型感染与子宫内膜腺癌的相关性。方法 用革兰染色、免疫组化和DNA核酸探针原位杂交等方法，对66例子宫内膜腺癌，30例子宫内膜增生症进行检测。结果 子宫内膜腺癌和内膜增生症中革兰氏染色细菌L型阳性率分别为54.5%，56.7%；免疫组化染色(S-P法)检测阳性率分别为56.1%和60.6%；20例子宫内膜腺癌标本，用金黄色葡萄球菌(金葡菌)L型地高辛标记的核酸探针作原位杂交，结果发现45%的宫内膜腺上皮细胞核内显示有金葡菌L型DNA阳性颗粒。结论 提示细菌及其L型可侵入子宫内膜腺上皮细胞，导致细胞异常增生甚至肿瘤发生。证明子宫内膜腺癌的发生与细菌L型感染有一定的相关性。
关键词：子宫肿瘤 金黄色葡萄菌L型 核酸原位杂交
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目前，全球感染性疾病发病率明显上升，尤以金黄色葡萄球菌(金葡菌)和结核杆菌为甚。细菌L型为细菌的缺壁变异型，有学者报道细菌L型具有与病毒同样的致癌作用[1～2]。有关病毒致癌的机理研究较多，而细菌L型感染致癌仅有零星报道。本文应用革兰氏染色、免疫组化染色(S-P法)和原位核酸杂交等方法，对66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症进行研究，探讨子宫内膜腺癌中细菌及其L型感染与肿瘤发生的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集本院病理科1996～1997年外检档案中66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症标本，所有标本连续切片10张备用。
1.2 革兰氏染色 每份标本各取切片1张作革兰氏染色，油镜观察100个视野的腺体和间质。观察子宫内膜腺癌和子宫内膜增生症组织中的细菌型及L型。
1.3 免疫组化染色(S-P法) 取每份标本切片各1张作免疫组化检查。免疫组化第一抗体为自制的金葡菌CowanI株稳定L型的特异性抗体，使用浓度1∶200；第二抗体及S-P复合物购自福州迈新公司，使用浓度1∶100；DAB显色。每组试验均设阳性、阴性及省略一抗对照，阳性结果为细胞浆或核内见棕黄色颗粒。
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1.4 核酸原位杂交 随机抽取20例子宫内膜腺癌组织切片，以地高辛标记的金葡菌L型DNA探针，用ECOR I酶切后作原位杂交。(地高辛试剂盒为Bochring Mannheim公司产品，DNA系用稳定的金葡菌Cowan I株L型，由北京医科大学附属三院分子生物学实验室制备)。原位杂交主要步骤如下：①切片脱腊、水化、常规处理。②消化：加蛋白酶K25μg/ml 37℃ 20min。③固定：0.1%戊二醛固定30min。④预杂交：加入预杂交液，置42℃，4h。⑤杂交：切片滴加预先变性的金葡菌DNA地高辛探针20μl/片，95℃±2℃ 3～5min后置湿盒中42℃过夜，缓冲液Ⅰ、Ⅱ充分清洗，浸泡⑥杂交后检测：加用缓冲液Ⅰ稀释的抗体复合物(1∶1000)，37℃作用1h；充分洗涤⑦显色后水洗，透明，封片。阳性对照为金葡菌L型培养物涂片，阴性对照为不加变性DNA探针的组织切片，阳性切片细胞核内呈紫兰色颗粒。
2 结果
2.1 革兰氏染色 66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症组织中细菌L型感染率分别为54.5%(36/66)、56.7%(17/30)。子宫内膜间质中可见有细菌L型巨形体、圆球体和原生小体，常聚集成堆。在腺癌和增生症的腺腔内及腺上皮细胞浆内亦可查见L型菌体。腺癌组织出血区红细胞表面可见有细菌L型菌体粘附。
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2.2 免疫组化染色 66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症的组织切片经金葡菌L型特异性抗体免疫组化染色，阳性率分别为56.1%、60.6%。阳性颗粒呈棕黄色，主要分布于子宫内膜间质和腺上皮细胞浆内(见封三图1)。革兰氏染色与免疫组化阳性结果基本一致。
2.3 核酸原位杂交 在66例子宫内膜腺癌中随机抽取20例，用金葡菌L型DNA探针进行核酸原位杂交，其中9例(45%)癌细胞核内显示有金葡菌L型DNA杂交阳性信号，细胞核内见紫蓝色细小颗粒，分布均匀，细胞浆内也可见有少量阳性颗粒(见封三图2)。
夏佩莹等：原位杂交检测子宫内膜癌中金黄色葡萄球菌L型DNA
XIA peiying et al ,Detecting of Staphylococcus aureus L-form DNA in endometrial adenocarcinoma with in situ hybridization technique
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3 讨论
细菌侵入机体后，常在一定条件下被诱导为L型。L型菌可在体内长期存在，不仅使炎症转为慢性，还可侵入细胞内生长繁殖，并与病毒同样具有致癌的可能[3]。有关细菌L型感染与肿瘤的关系，国内外均有少量报道[1，2，4]，笔者近年来曾对实验动物及大量回顾性病例进行了研究。发现在多种肿瘤组织中可查到细菌L型，用金葡菌L型DNA探针与子宫颈癌切片进行原位杂交，发现83.3%宫颈癌细胞核内有金葡菌L型DNA表达[1]。先后用金葡菌、结核菌及其L型感染小鼠，引起小鼠自发性肿瘤发生率达6.3%～12.5%[5，6]。Brook在91例实体瘤中，63例分离到病原菌，其中大多为金葡菌和溶血性链球菌[4]。本文对66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症组织作革兰氏染色，细菌L型检出率达54.5%和56.7%；免疫组化染色在内膜腺癌细胞浆及增生症的腺上皮细胞和间质内亦查见大量金葡菌L型抗原成分(见封三图1)；其中对20例子宫内膜腺癌组织与金葡菌L型DNA探针进行原位杂交显示：45%癌细胞核及浆内均有杂交阳性颗粒，主要位于细胞核内(见封三图2)。提示细菌及其L型可侵入子宫内膜腺上皮细胞，导致细胞异常增生甚至肿瘤发生。证明子宫内膜腺癌的发生与细菌L型感染有一定的相关性。
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细菌及其L型感染在临床上极为常见，L型菌在体内长期定居，有可能通过阻断溶酶体的杀菌作用或抵抗酸性环境而居留在巨噬细胞空泡内，在细胞内不断增殖，借助宿主细胞提供营养而长期存活。L型感染后可引起炎症灶内巨噬细胞发生呼吸爆发和酶促化学反应，产生大量的自由基，造成组织细胞的损伤，使细胞产生小分子量的断裂因子，导致DNA损伤、断裂甚至错误修复，引起细胞突变或癌变[6]。本文进一步通过对子宫内膜腺癌及内膜增生症的病理学研究证明了细菌L型感染与肿瘤发生的相关性。如果细菌及其L型感染确实为致癌的因素之一，只要彻底治疗感染性疾病，将对肿瘤的防治具有重要意义。
本课题由安徽省教委重点科研基金资助，课题号：97JL1472
夏佩莹(蚌埠医学院微生物学教研室 蚌埠，233003)
汪万英(蚌埠医学院附属医院病理科)
, http://www.100md.com 赵发英(蚌埠医学院附属医院妇产科)
郭才(蚌埠医学院附属医院妇产科)
何杰(蚌埠医学院附属医院病理科)
参考文献
1，何杰，汪万英，张世馥，等.原位核酸杂交检测宫颈癌中金黄色葡萄球菌L型DNA[J].中国微生态学杂志，1997，9(5)：41.
2，汪万英，夏佩莹，张世馥，等.金黄色葡萄球菌及其L型感染对小鼠妊娠的影响[J].中华病理学杂志，1994，23(3)：175.
3，黄谷良，林特夫.细菌L型与疾病[M].北京：学苑出版社，1991：180.
4，Brook I.Bacteria in substantiol tumor[J].J Med Microbial，1990，32：207.
5，汪万英，何杰，张世馥，等.细菌及其L型感染荷瘤小鼠肿瘤发生的研究[J].中国微生态学杂志，1997，9(1)：40.
6，汪万英，张世馥，何杰.金葡菌及其L型感染荷瘤小鼠肿瘤内及非荷瘤小鼠肝脏内MDA和SOD的研究[J].中国微生态学杂志，1997，9(4)：51., 百拇医药
摘 要：目的 研究细菌L型感染与子宫内膜腺癌的相关性。方法 用革兰染色、免疫组化和DNA核酸探针原位杂交等方法，对66例子宫内膜腺癌，30例子宫内膜增生症进行检测。结果 子宫内膜腺癌和内膜增生症中革兰氏染色细菌L型阳性率分别为54.5%，56.7%；免疫组化染色(S-P法)检测阳性率分别为56.1%和60.6%；20例子宫内膜腺癌标本，用金黄色葡萄球菌(金葡菌)L型地高辛标记的核酸探针作原位杂交，结果发现45%的宫内膜腺上皮细胞核内显示有金葡菌L型DNA阳性颗粒。结论 提示细菌及其L型可侵入子宫内膜腺上皮细胞，导致细胞异常增生甚至肿瘤发生。证明子宫内膜腺癌的发生与细菌L型感染有一定的相关性。
关键词：子宫肿瘤 金黄色葡萄菌L型 核酸原位杂交
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目前，全球感染性疾病发病率明显上升，尤以金黄色葡萄球菌(金葡菌)和结核杆菌为甚。细菌L型为细菌的缺壁变异型，有学者报道细菌L型具有与病毒同样的致癌作用[1～2]。有关病毒致癌的机理研究较多，而细菌L型感染致癌仅有零星报道。本文应用革兰氏染色、免疫组化染色(S-P法)和原位核酸杂交等方法，对66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症进行研究，探讨子宫内膜腺癌中细菌及其L型感染与肿瘤发生的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集本院病理科1996～1997年外检档案中66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症标本，所有标本连续切片10张备用。
1.2 革兰氏染色 每份标本各取切片1张作革兰氏染色，油镜观察100个视野的腺体和间质。观察子宫内膜腺癌和子宫内膜增生症组织中的细菌型及L型。
1.3 免疫组化染色(S-P法) 取每份标本切片各1张作免疫组化检查。免疫组化第一抗体为自制的金葡菌CowanI株稳定L型的特异性抗体，使用浓度1∶200；第二抗体及S-P复合物购自福州迈新公司，使用浓度1∶100；DAB显色。每组试验均设阳性、阴性及省略一抗对照，阳性结果为细胞浆或核内见棕黄色颗粒。
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1.4 核酸原位杂交 随机抽取20例子宫内膜腺癌组织切片，以地高辛标记的金葡菌L型DNA探针，用ECOR I酶切后作原位杂交。(地高辛试剂盒为Bochring Mannheim公司产品，DNA系用稳定的金葡菌Cowan I株L型，由北京医科大学附属三院分子生物学实验室制备)。原位杂交主要步骤如下：①切片脱腊、水化、常规处理。②消化：加蛋白酶K25μg/ml 37℃ 20min。③固定：0.1%戊二醛固定30min。④预杂交：加入预杂交液，置42℃，4h。⑤杂交：切片滴加预先变性的金葡菌DNA地高辛探针20μl/片，95℃±2℃ 3～5min后置湿盒中42℃过夜，缓冲液Ⅰ、Ⅱ充分清洗，浸泡⑥杂交后检测：加用缓冲液Ⅰ稀释的抗体复合物(1∶1000)，37℃作用1h；充分洗涤⑦显色后水洗，透明，封片。阳性对照为金葡菌L型培养物涂片，阴性对照为不加变性DNA探针的组织切片，阳性切片细胞核内呈紫兰色颗粒。
2 结果
2.1 革兰氏染色 66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症组织中细菌L型感染率分别为54.5%(36/66)、56.7%(17/30)。子宫内膜间质中可见有细菌L型巨形体、圆球体和原生小体，常聚集成堆。在腺癌和增生症的腺腔内及腺上皮细胞浆内亦可查见L型菌体。腺癌组织出血区红细胞表面可见有细菌L型菌体粘附。
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2.2 免疫组化染色 66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症的组织切片经金葡菌L型特异性抗体免疫组化染色，阳性率分别为56.1%、60.6%。阳性颗粒呈棕黄色，主要分布于子宫内膜间质和腺上皮细胞浆内(见封三图1)。革兰氏染色与免疫组化阳性结果基本一致。
2.3 核酸原位杂交 在66例子宫内膜腺癌中随机抽取20例，用金葡菌L型DNA探针进行核酸原位杂交，其中9例(45%)癌细胞核内显示有金葡菌L型DNA杂交阳性信号，细胞核内见紫蓝色细小颗粒，分布均匀，细胞浆内也可见有少量阳性颗粒(见封三图2)。
夏佩莹等：原位杂交检测子宫内膜癌中金黄色葡萄球菌L型DNA
XIA peiying et al ,Detecting of Staphylococcus aureus L-form DNA in endometrial adenocarcinoma with in situ hybridization technique
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3 讨论
细菌侵入机体后，常在一定条件下被诱导为L型。L型菌可在体内长期存在，不仅使炎症转为慢性，还可侵入细胞内生长繁殖，并与病毒同样具有致癌的可能[3]。有关细菌L型感染与肿瘤的关系，国内外均有少量报道[1，2，4]，笔者近年来曾对实验动物及大量回顾性病例进行了研究。发现在多种肿瘤组织中可查到细菌L型，用金葡菌L型DNA探针与子宫颈癌切片进行原位杂交，发现83.3%宫颈癌细胞核内有金葡菌L型DNA表达[1]。先后用金葡菌、结核菌及其L型感染小鼠，引起小鼠自发性肿瘤发生率达6.3%～12.5%[5，6]。Brook在91例实体瘤中，63例分离到病原菌，其中大多为金葡菌和溶血性链球菌[4]。本文对66例子宫内膜腺癌和30例子宫内膜增生症组织作革兰氏染色，细菌L型检出率达54.5%和56.7%；免疫组化染色在内膜腺癌细胞浆及增生症的腺上皮细胞和间质内亦查见大量金葡菌L型抗原成分(见封三图1)；其中对20例子宫内膜腺癌组织与金葡菌L型DNA探针进行原位杂交显示：45%癌细胞核及浆内均有杂交阳性颗粒，主要位于细胞核内(见封三图2)。提示细菌及其L型可侵入子宫内膜腺上皮细胞，导致细胞异常增生甚至肿瘤发生。证明子宫内膜腺癌的发生与细菌L型感染有一定的相关性。
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细菌及其L型感染在临床上极为常见，L型菌在体内长期定居，有可能通过阻断溶酶体的杀菌作用或抵抗酸性环境而居留在巨噬细胞空泡内，在细胞内不断增殖，借助宿主细胞提供营养而长期存活。L型感染后可引起炎症灶内巨噬细胞发生呼吸爆发和酶促化学反应，产生大量的自由基，造成组织细胞的损伤，使细胞产生小分子量的断裂因子，导致DNA损伤、断裂甚至错误修复，引起细胞突变或癌变[6]。本文进一步通过对子宫内膜腺癌及内膜增生症的病理学研究证明了细菌L型感染与肿瘤发生的相关性。如果细菌及其L型感染确实为致癌的因素之一，只要彻底治疗感染性疾病，将对肿瘤的防治具有重要意义。
本课题由安徽省教委重点科研基金资助，课题号：97JL1472
夏佩莹(蚌埠医学院微生物学教研室 蚌埠，233003)
汪万英(蚌埠医学院附属医院病理科)
, http://www.100md.com 赵发英(蚌埠医学院附属医院妇产科)
郭才(蚌埠医学院附属医院妇产科)
何杰(蚌埠医学院附属医院病理科)
参考文献
1，何杰，汪万英，张世馥，等.原位核酸杂交检测宫颈癌中金黄色葡萄球菌L型DNA[J].中国微生态学杂志，1997，9(5)：41.
2，汪万英，夏佩莹，张世馥，等.金黄色葡萄球菌及其L型感染对小鼠妊娠的影响[J].中华病理学杂志，1994，23(3)：175.
3，黄谷良，林特夫.细菌L型与疾病[M].北京：学苑出版社，1991：180.
4，Brook I.Bacteria in substantiol tumor[J].J Med Microbial，1990，32：207.
5，汪万英，何杰，张世馥，等.细菌及其L型感染荷瘤小鼠肿瘤发生的研究[J].中国微生态学杂志，1997，9(1)：40.
6，汪万英，张世馥，何杰.金葡菌及其L型感染荷瘤小鼠肿瘤内及非荷瘤小鼠肝脏内MDA和SOD的研究[J].中国微生态学杂志，1997，9(4)：51., 百拇医药