神经干细胞及其临床应用前景
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国外医学神经病学神经外科学分册 2000年第27卷第1期
神经干细胞及其临床应用前景
天津医科大学总医院神经外科(300052) 刘辉(综述) 杨树源(审校)
摘 要 近年研究证实胚胎期和成年哺乳动物的神经组织及人脑中可以分离出神经干细胞。干细胞可被生长因子诱导而增殖并保持分化成神经元及胶质细胞的潜能，移植后能在宿主的神经组织中良好地生存、整和及分化，并且通过基因操作可表达外源性基因。本文就神经干细胞的生物学特性及其在颅脑损伤和其它神经系统疾病中的基因治疗前景进行综述。
关键词：神经干细胞 生长因子 细胞移植 基因转染
神经干细胞是一种终身具有自我更新能力的细胞，其子细胞能分化产生神经系统的各类细胞，干细胞经过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞具有有限的自我更新能力，并自发分化产生成神经元细胞和成胶质细胞等，从而生成神经元及神经胶质细胞。
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以往认为中枢神经系统的神经元再生于出生前或出生后不久就停止了。近年的一些研究表明成年哺乳动物的脑组织仍然可不断产生新的神经元，并且证实在人脑组织中同样存在神经干细胞[1-3]。因此，人们对神经系统再生的机理和神经系统疾病的治疗均有新的认识。
1 神经干细胞
1.1 胎鼠及成鼠的神经干细胞
近年Reynolds等[1]使用表皮生长因子(EGF)诱导胎鼠纹状体的神经细胞分裂增殖、产生细胞团，并发现这些细胞表达神经干细胞特有的生物学标记神经巢蛋白(nestin)，经过多次的细胞分裂产生神经元及胶质细胞。这些EGF相关性细胞具有自我更新和增殖的能力，能够产生大量的各类子细胞。另有学者报告，从中枢神经系统其它部位也可分离出神经干细胞，如胎鼠的小脑半球、海马、皮层脑室区等[14,15]。
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值得注意的是，Reynolds和Richards[6,7]先后从成鼠的纹状体及海马中分离出相似的多能干细胞。从胎鼠及成鼠脑组织中分离出的干细胞具有同样的增殖能力并能够产生神经元和神经胶质细胞，这表明胎鼠的一部分神经干细胞以非增殖的静止方式长期存在。
1.2 神经生长因子与神经干细胞的关系
碱性成纤维生长因子(FGF-2)对于神经干细胞的分裂增殖起着关键性作用。FGF-2能够刺激胎鼠纹状体、海马，成年鼠海马及人胎脑的多能干细胞，使其分裂增殖[7～9]。同时FGF-2对神经干细胞存活及增殖的作用有剂量依赖性的特点。子细胞中绝大多数表达神经元特异性标记物，如神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP-2)、神经细丝(NF)等。由此可见，FGF-2有促进干细胞分化的作用，并使未分化的祖细胞向着生成神经元的方向分化。表皮生长因子(EGF)是促进有丝分裂的因子，对神经干细胞也有促进分裂增殖的作用，Reynolds利用EGF分别从胎鼠及成年鼠的纹状体中分离出具有神经干细胞特征的神经细胞[1,6]。Kornblum[10]发现FGF-2可以维持最初由EGF激发的神经干细胞的存活及增殖，并发现FGF-2的刺激作用可维持较长时间。但FGF-2及EGF的相互作用仍不完全清楚。环境因素即一些外源性信号对于干细胞的发生和发展具有重要作用，特别是生长因子对于干细胞的生长及分化起着关键作用。因此，目前可利用生长因子从脑组织中分离干细胞，使干细胞在离体状态下进一步增殖分化，为研究神经干细胞的生物学特征和干细胞移植提供大量的细胞来源，为建立细胞系提供可靠保证。
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1.3 神经干细胞系
为保持神经多能干细胞在体外长时间生存、分裂和增殖，目前使用基因转移的方法建成神经干细胞系，即诱导干细胞的细胞周期不断循环往复，从而阻止细胞分化过程。导入外源性癌蛋白基因是促使神经干细胞永生化最常用的方法，V-myc[11]和large-T抗原[4]的使用最广泛。在引入原癌基因V-myc的细胞系中，原癌基因的有丝分裂作用在不断表达，干细胞不断增殖。据Hoshimaru M[12]报道，在培养基中加入四环素后使得V-myc蛋白减少并导致细胞停止增殖，并出现神经元的分化。不死的神经干细胞有较好的生物学特性：能够自我复制并在体外增殖大量的细胞；在移植人体内后仍具有多向分化潜能；可以被转染并稳定地表达外源性基因。因此，不死细胞系具有广泛的应用前景，可作为颅内神经细胞移植及作为基因转移的工具。
2 神经干细胞的应用前景
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2.1 细胞移植
细胞移植对于修复脑组织是有效的治疗方法，但目前使用的细胞多取自胎儿，细胞来源有限，还存在异体免疫排斥作用。使用神经干细胞可以克服这些问题，首先神经干细胞可以在体外大量增殖，其次由于干细胞可以来源于患者本人，经过体外扩增，然后再移植到病损脑组织，因而可以避免免疫排斥反应的发生。
有学者分别将HiB5细胞和取自小脑的干细胞移植于新生鼠的海马及小脑，发现这些移植细胞能存活并分化为与移植部位相对应的细胞。Renfrart[4]发现HiB5细胞在海马齿状回及小脑皮层能够分化成具有内源性粒细胞特征的神经元。Synder[2]发现被植入到内粒层、分子层及白质区域的干细胞所分化细胞的形态分别与粒细胞、星形细胞和少枝细胞的形态相似。22个月后发现干细胞产生的神经元与宿主的神经纤维建立突触联系，移植细胞可以良好地生长、分化并整和于宿主的神经组织，移植细胞的分化表型由移植部位的局部特征性信号决定。因而干细胞可从解剖和功能上修复受损脑组织。
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近年研究发现原代神经干细胞也可以直接用于神经细胞移植，Gage[13]将FGF-2扩增的成鼠干细胞移植到成年鼠的海马中，存活的细胞在移植后三个月仍能清晰可见，在齿状回中存活细胞分化成与宿主神经元相似的神经元。
神经干细胞不仅修复神经元缺失而且可以修复损伤的神经胶质，Groves[14]将O-2A干细胞注入成鼠发生脱髓鞘病变的脊髓后，移植细胞可以修复受损的髓鞘。多能干细胞系及原代干细胞均具有在植入部位产生分化并产生具有局部特异性细胞的能力。因此，神经干细胞用于损伤及病变脑组织的细胞移植是很有前途的。
Craig[15]将EGF连续六天注入成年鼠的侧脑室中，发现被标记的室管膜下细胞增加了17倍，并从侧脑室壁转移至邻近的皮层、纹状体和透明隔，七周后发现一部分细胞分化成新的神经元、星形细胞和少枝胶质细胞。由引可见，通过诱导神经系统中的原位神经干细胞增殖、迁移和分化也可达到修复受损神经元的目的。
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应用病人自身的多能干细胞治疗颅脑损伤或其它疾病引起的神经元缺失主要有两种设想：一诱导病变部位本身的干细胞增殖分化，二从病人体内分离出神经干细胞，然后在体外进行增殖和加工，再移植到相应的病变部位。
2.2 干细胞作为基因治疗的载体
目前神经多能干细胞被用于体外基因转导实验：转导报告基因(LacZ基因)，转导神经递质合成酶(酪氨酸羟化酶)的基因用于治疗帕金森疾病，转导一种代谢性酶(β-葡萄苷酸酶)的基因用于治疗粘多糖病等[16,17]。
Price[18]将神经干细胞在体外用于报告基因的转导实验，使用的逆转录病毒载体是BAG病毒，这种病毒含有大肠杆菌LacZ基因(半乳糖苷酶基因)，此基因可整和到增殖细胞的DNA中，并且能够遗传至子细胞。通过免疫组化法可将LacZ基因定位。因此，使用LacZ基因可以跟踪移植后的干细胞及其子细胞，并且LacZ基因移植后的稳定表达证实干细胞作为外源基因载体的可行性。
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近来Martinez-Serrano A[19]利用条件温度敏感性HiB5永生化细胞系建立高效神经生长因子(NGF)分泌细胞系，分泌NGF的细胞系含有NGF基因的多重拷贝并在体外以2ng/hr/105细胞的速率分泌具有生物活性的NGF。这种细胞在移植到被完全切断穹隆的鼠纹状体及中隔后，仍能持续分泌NGF，并使90%胆碱能神经元得到恢复。同时，移植细胞能良好地存活于脑组织中，主要分化成胶质形态的细胞，并迁移1～1.5mm且整和于宿主的脑组织。经观察这些部位并未发生过度生长和产生肿瘤。因此，神经干细胞的细胞系可以作为基因转移的多功能载体，植入病变的神经组织，使外源性基因得到表达。
神经干细胞作为外源基因的载体也可应用于颅内肿瘤的基因治疗。目前胶质瘤的基因治疗已经受到病毒载体的限制，在临床实验性治疗中常需要在肿瘤周围多点注射。而神经干细胞能够弥补病毒载体的一些不足，所以神经干细胞可成为颅内肿瘤基因治疗更理想的载体。
, http://www.100md.com 综上所述，有关神经干细胞的研究于近十年开始，目前的研究成果已经使神经科医师产生了极大的兴趣。Svendsen[20]和Flaz[8]已经从人胎儿的大脑皮质中分离出中枢神经干细胞，使用EGF和FGF-2扩增出细胞团，并用底物诱导细胞分化出神经元及星形细胞。Flax等还将人脑的干细胞移植到幼鼠脑的生发区，移植后的细胞能良好地生存、分化及迁移，并且移植细胞经过基因操作可以表达外源基因。因此，将中枢神经干细胞移植入受损脑组织不仅可以补充、替代受损的神经元，而且还可以将外源性基因导入神经组织，使其在体内有效表达。因而神经干细胞对于颅脑损伤的修复及其它疾病的治疗有着广泛的应用前景。
参考文献
1 Reynolds BA,et al.J Neurosci,1992;12:4564
2 Snyder EY,et al.Cell,1992;68:33
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3 Svendsen CN,et al.Exp Neurol,1996;137:376
4 Renfranz PJ,et al.Cell,1991;66:713
5 Davis AA,et al.Nature,1994;372:263
6 Reynolds BA,et al.Science,1992;255:1707
7 Richards LJ,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:8591
8 Flax JD,et al.Nat Biotechnol,1998;16:10337
9 Ray J,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1993;90:3602
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10 Kornblum HI,et al.Brain Research,1990;535:255
11 Bartlwtt PF,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1988;85:3255
12 Hoshimaru M,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93:1518
13 Gage FH,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:11879
14 Groves AK,et al.Nature,1993;362:453
15 Craig CG,et al.J Neurosci,1996;16:2649
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16 Raymon HK,et al.Exp Neurol,1997;144:82
17 Snyder EY,et al.Nature,1996;374:367
18 Prince J,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1987;84:156
19 Martinez-Serrano A,et al.J Neurosci,1995;15:5668
20 Svendsen CN,et al.J Neurosci,1998;85:141, 百拇医药
天津医科大学总医院神经外科(300052) 刘辉(综述) 杨树源(审校)
摘 要 近年研究证实胚胎期和成年哺乳动物的神经组织及人脑中可以分离出神经干细胞。干细胞可被生长因子诱导而增殖并保持分化成神经元及胶质细胞的潜能，移植后能在宿主的神经组织中良好地生存、整和及分化，并且通过基因操作可表达外源性基因。本文就神经干细胞的生物学特性及其在颅脑损伤和其它神经系统疾病中的基因治疗前景进行综述。
关键词：神经干细胞 生长因子 细胞移植 基因转染
神经干细胞是一种终身具有自我更新能力的细胞，其子细胞能分化产生神经系统的各类细胞，干细胞经过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞具有有限的自我更新能力，并自发分化产生成神经元细胞和成胶质细胞等，从而生成神经元及神经胶质细胞。
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以往认为中枢神经系统的神经元再生于出生前或出生后不久就停止了。近年的一些研究表明成年哺乳动物的脑组织仍然可不断产生新的神经元，并且证实在人脑组织中同样存在神经干细胞[1-3]。因此，人们对神经系统再生的机理和神经系统疾病的治疗均有新的认识。
1 神经干细胞
1.1 胎鼠及成鼠的神经干细胞
近年Reynolds等[1]使用表皮生长因子(EGF)诱导胎鼠纹状体的神经细胞分裂增殖、产生细胞团，并发现这些细胞表达神经干细胞特有的生物学标记神经巢蛋白(nestin)，经过多次的细胞分裂产生神经元及胶质细胞。这些EGF相关性细胞具有自我更新和增殖的能力，能够产生大量的各类子细胞。另有学者报告，从中枢神经系统其它部位也可分离出神经干细胞，如胎鼠的小脑半球、海马、皮层脑室区等[14,15]。
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值得注意的是，Reynolds和Richards[6,7]先后从成鼠的纹状体及海马中分离出相似的多能干细胞。从胎鼠及成鼠脑组织中分离出的干细胞具有同样的增殖能力并能够产生神经元和神经胶质细胞，这表明胎鼠的一部分神经干细胞以非增殖的静止方式长期存在。
1.2 神经生长因子与神经干细胞的关系
碱性成纤维生长因子(FGF-2)对于神经干细胞的分裂增殖起着关键性作用。FGF-2能够刺激胎鼠纹状体、海马，成年鼠海马及人胎脑的多能干细胞，使其分裂增殖[7～9]。同时FGF-2对神经干细胞存活及增殖的作用有剂量依赖性的特点。子细胞中绝大多数表达神经元特异性标记物，如神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP-2)、神经细丝(NF)等。由此可见，FGF-2有促进干细胞分化的作用，并使未分化的祖细胞向着生成神经元的方向分化。表皮生长因子(EGF)是促进有丝分裂的因子，对神经干细胞也有促进分裂增殖的作用，Reynolds利用EGF分别从胎鼠及成年鼠的纹状体中分离出具有神经干细胞特征的神经细胞[1,6]。Kornblum[10]发现FGF-2可以维持最初由EGF激发的神经干细胞的存活及增殖，并发现FGF-2的刺激作用可维持较长时间。但FGF-2及EGF的相互作用仍不完全清楚。环境因素即一些外源性信号对于干细胞的发生和发展具有重要作用，特别是生长因子对于干细胞的生长及分化起着关键作用。因此，目前可利用生长因子从脑组织中分离干细胞，使干细胞在离体状态下进一步增殖分化，为研究神经干细胞的生物学特征和干细胞移植提供大量的细胞来源，为建立细胞系提供可靠保证。
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1.3 神经干细胞系
为保持神经多能干细胞在体外长时间生存、分裂和增殖，目前使用基因转移的方法建成神经干细胞系，即诱导干细胞的细胞周期不断循环往复，从而阻止细胞分化过程。导入外源性癌蛋白基因是促使神经干细胞永生化最常用的方法，V-myc[11]和large-T抗原[4]的使用最广泛。在引入原癌基因V-myc的细胞系中，原癌基因的有丝分裂作用在不断表达，干细胞不断增殖。据Hoshimaru M[12]报道，在培养基中加入四环素后使得V-myc蛋白减少并导致细胞停止增殖，并出现神经元的分化。不死的神经干细胞有较好的生物学特性：能够自我复制并在体外增殖大量的细胞；在移植人体内后仍具有多向分化潜能；可以被转染并稳定地表达外源性基因。因此，不死细胞系具有广泛的应用前景，可作为颅内神经细胞移植及作为基因转移的工具。
2 神经干细胞的应用前景
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2.1 细胞移植
细胞移植对于修复脑组织是有效的治疗方法，但目前使用的细胞多取自胎儿，细胞来源有限，还存在异体免疫排斥作用。使用神经干细胞可以克服这些问题，首先神经干细胞可以在体外大量增殖，其次由于干细胞可以来源于患者本人，经过体外扩增，然后再移植到病损脑组织，因而可以避免免疫排斥反应的发生。
有学者分别将HiB5细胞和取自小脑的干细胞移植于新生鼠的海马及小脑，发现这些移植细胞能存活并分化为与移植部位相对应的细胞。Renfrart[4]发现HiB5细胞在海马齿状回及小脑皮层能够分化成具有内源性粒细胞特征的神经元。Synder[2]发现被植入到内粒层、分子层及白质区域的干细胞所分化细胞的形态分别与粒细胞、星形细胞和少枝细胞的形态相似。22个月后发现干细胞产生的神经元与宿主的神经纤维建立突触联系，移植细胞可以良好地生长、分化并整和于宿主的神经组织，移植细胞的分化表型由移植部位的局部特征性信号决定。因而干细胞可从解剖和功能上修复受损脑组织。
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近年研究发现原代神经干细胞也可以直接用于神经细胞移植，Gage[13]将FGF-2扩增的成鼠干细胞移植到成年鼠的海马中，存活的细胞在移植后三个月仍能清晰可见，在齿状回中存活细胞分化成与宿主神经元相似的神经元。
神经干细胞不仅修复神经元缺失而且可以修复损伤的神经胶质，Groves[14]将O-2A干细胞注入成鼠发生脱髓鞘病变的脊髓后，移植细胞可以修复受损的髓鞘。多能干细胞系及原代干细胞均具有在植入部位产生分化并产生具有局部特异性细胞的能力。因此，神经干细胞用于损伤及病变脑组织的细胞移植是很有前途的。
Craig[15]将EGF连续六天注入成年鼠的侧脑室中，发现被标记的室管膜下细胞增加了17倍，并从侧脑室壁转移至邻近的皮层、纹状体和透明隔，七周后发现一部分细胞分化成新的神经元、星形细胞和少枝胶质细胞。由引可见，通过诱导神经系统中的原位神经干细胞增殖、迁移和分化也可达到修复受损神经元的目的。
, http://www.100md.com
应用病人自身的多能干细胞治疗颅脑损伤或其它疾病引起的神经元缺失主要有两种设想：一诱导病变部位本身的干细胞增殖分化，二从病人体内分离出神经干细胞，然后在体外进行增殖和加工，再移植到相应的病变部位。
2.2 干细胞作为基因治疗的载体
目前神经多能干细胞被用于体外基因转导实验：转导报告基因(LacZ基因)，转导神经递质合成酶(酪氨酸羟化酶)的基因用于治疗帕金森疾病，转导一种代谢性酶(β-葡萄苷酸酶)的基因用于治疗粘多糖病等[16,17]。
Price[18]将神经干细胞在体外用于报告基因的转导实验，使用的逆转录病毒载体是BAG病毒，这种病毒含有大肠杆菌LacZ基因(半乳糖苷酶基因)，此基因可整和到增殖细胞的DNA中，并且能够遗传至子细胞。通过免疫组化法可将LacZ基因定位。因此，使用LacZ基因可以跟踪移植后的干细胞及其子细胞，并且LacZ基因移植后的稳定表达证实干细胞作为外源基因载体的可行性。
, 百拇医药
近来Martinez-Serrano A[19]利用条件温度敏感性HiB5永生化细胞系建立高效神经生长因子(NGF)分泌细胞系，分泌NGF的细胞系含有NGF基因的多重拷贝并在体外以2ng/hr/105细胞的速率分泌具有生物活性的NGF。这种细胞在移植到被完全切断穹隆的鼠纹状体及中隔后，仍能持续分泌NGF，并使90%胆碱能神经元得到恢复。同时，移植细胞能良好地存活于脑组织中，主要分化成胶质形态的细胞，并迁移1～1.5mm且整和于宿主的脑组织。经观察这些部位并未发生过度生长和产生肿瘤。因此，神经干细胞的细胞系可以作为基因转移的多功能载体，植入病变的神经组织，使外源性基因得到表达。
神经干细胞作为外源基因的载体也可应用于颅内肿瘤的基因治疗。目前胶质瘤的基因治疗已经受到病毒载体的限制，在临床实验性治疗中常需要在肿瘤周围多点注射。而神经干细胞能够弥补病毒载体的一些不足，所以神经干细胞可成为颅内肿瘤基因治疗更理想的载体。
, http://www.100md.com 综上所述，有关神经干细胞的研究于近十年开始，目前的研究成果已经使神经科医师产生了极大的兴趣。Svendsen[20]和Flaz[8]已经从人胎儿的大脑皮质中分离出中枢神经干细胞，使用EGF和FGF-2扩增出细胞团，并用底物诱导细胞分化出神经元及星形细胞。Flax等还将人脑的干细胞移植到幼鼠脑的生发区，移植后的细胞能良好地生存、分化及迁移，并且移植细胞经过基因操作可以表达外源基因。因此，将中枢神经干细胞移植入受损脑组织不仅可以补充、替代受损的神经元，而且还可以将外源性基因导入神经组织，使其在体内有效表达。因而神经干细胞对于颅脑损伤的修复及其它疾病的治疗有着广泛的应用前景。
参考文献
1 Reynolds BA,et al.J Neurosci,1992;12:4564
2 Snyder EY,et al.Cell,1992;68:33
, 百拇医药
3 Svendsen CN,et al.Exp Neurol,1996;137:376
4 Renfranz PJ,et al.Cell,1991;66:713
5 Davis AA,et al.Nature,1994;372:263
6 Reynolds BA,et al.Science,1992;255:1707
7 Richards LJ,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:8591
8 Flax JD,et al.Nat Biotechnol,1998;16:10337
9 Ray J,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1993;90:3602
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10 Kornblum HI,et al.Brain Research,1990;535:255
11 Bartlwtt PF,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1988;85:3255
12 Hoshimaru M,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93:1518
13 Gage FH,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:11879
14 Groves AK,et al.Nature,1993;362:453
15 Craig CG,et al.J Neurosci,1996;16:2649
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16 Raymon HK,et al.Exp Neurol,1997;144:82
17 Snyder EY,et al.Nature,1996;374:367
18 Prince J,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1987;84:156
19 Martinez-Serrano A,et al.J Neurosci,1995;15:5668
20 Svendsen CN,et al.J Neurosci,1998;85:141, 百拇医药