基因芯片技术在癌症研究中的应用
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国外医学肿瘤学分册 2000年6月第27卷第3期
基因芯片技术在癌症研究中的应用
军事医学科学院放射医学研究所(北京 100850) 吴岚军 王升启 毛秉智(综述)
摘 要 新近发展的高通量的基因表达分析平台——基因芯片技术具有多样品并行处理能力、分析速度快、所需样品量少、污染少等优点，近年来在临床诊断、药物筛选、寻找新基因等研究领域带来革新性的影响。本文综述用基因芯片技术进行肿瘤研究的新策略和模式。
关键词：基因芯片 肿瘤基因表达 检测 cDNA微陈列
cDNA微陈列(基因芯片技术)是将cDNA文库中的已知和未知序列固定于玻片上，同时检测比较生物样品中多个已知或未知序列的表达状况。近年来被越来越多肿瘤生物学家用来分析比较肿瘤组织与相应正常组织之间基因表达的差异，以期发现肿瘤组织中表达的特异基因和药物治疗的靶序列。本文对用基因芯片技术进行肿瘤研究的新策略和模式作一综述。
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一、基因芯片技术的基本原理
探针DNA是指要被有序地点样固定在玻片或硅晶片上的DNA片段，这些片段可通过PCR反应扩增细菌质粒上插入的基因组片段或用通过引物从cDNA文库中PCR扩增得到。这些大小和序列不同的片段分别经过纯化后，机械手高速将它们高密度有序地点样固定在玻片或硅晶片上从而制备成DNA微阵列，用于检测待测样品中是否有与之互补的序列。待测样品中的mRNA被提取后，通过反转录反应过程获得标记荧光的cDNA，与包含上千个基因的DNA微阵列进行杂交反应30分钟到20小时后，将玻片上未互补结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定微阵列上各点的荧光强度，推算出待测样品中各种基因的表达水平。若要比较不同的两个细胞系或不同组织来源的细胞中基因表达的差异，则从不同的两个细胞系或不同的组织来源的细胞中提取mRNA。反转录反应过程中标记上同颜色的荧光，等量混合后，与包含上千个基因的DNA微阵列进行杂交反应，对玻片进行激光共聚焦扫描。比较两种荧光在各点阵上的强度，推算出各基因在不同细胞系中的相对表达水平[1]。
, 百拇医药
二、基因芯片平行检测某种肿瘤组织的基因表达谱
华盛顿大学的分子生物学系与病理系联合研究了卵巢癌中基因表达谱的变化[2]，他们将5766个基因探针固定于芯片上，其中5376个分别选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞及正常卵巢的cDNA文库中；另外还有342个来自EST克隆，包括一些已知确定的看家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受体基因、与细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿瘤相关基因。从正常卵巢组织中获得Cy3-标记的cDNA和卵巢癌组织中获得的Cy5-标记的cDNA与芯片杂交结果显示，两者之间有30%的cDNA表达水平表现出2倍的差别，9%的cDNA表达水平表现出3倍以上的差别。根据这些差别，研究小组从中挑选出726个cDNA克隆作进一步测序和比较分析，找出在卵巢癌组织中过度表达的30个有GenBank收录的基因，如高表达的有CD9(GenBank录入号：M38690)、Epithelial glycoprotein (GenBank录入号：M32306)、P27(GenBank录入号：X67325)等，另外还发现曾经报道过的卵巢癌标志物之一HE4蛋白激酶抑制物基因在基因芯片上也表现出过度表达信号。这些数据不但为以前其他方法获得的研究结果提供了进一步参照，而且有助于研究肿瘤发展过程中参与的分子机制及寻找肿瘤诊断和治疗的靶分子，同时也证明了利用基因芯片分析复杂生物体系中分子变化的可行性，与其他的分析方法的比较，基因芯片还具有平行、快速的优越性。
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三、基因芯片在抗肿瘤药物筛选中的应用
NCI(美国国立癌症研究所)在癌症治疗发展计划中观察了65000种以上化合物对9种肿瘤组织来源的60个肿瘤细胞系的作用效应，所得数据为癌症药物的开发和研究提供了很有价值的参考作用，在此基础上，肿瘤生物学家利用基因芯片评估药物对肿瘤治疗的可行性。Scherf用含10000个基因的微阵列对60个肿瘤细胞系的基因表达谱进行分析，获得了一系列标准曲线，发现大部分细胞系保留了其原代分离组织的特征基因表达；又进一步评价122种药物对这些细胞系基因表达的影响，从中筛选出抗肿瘤药物候选化合物，并对其作临床药效评价。又如对cisplatin的疗效观察。Marton等[3]利用基因芯片技术快速检测肿瘤患者样品对ciplatin作用后的反应，发现肿瘤细胞受到药物作用24小时后mRNA的表达发生改变，推断出该药物的药理作用及对不同肿瘤细胞的杀伤效应。
四、问题与结语
, 百拇医药
cDNA微阵列技术被称之为新近发展的高通量的基因表达分析平台，利用它可对特殊的细胞群进行精确的量化基因表达谱的测定，并获得大量的基因表达数据。但由此产生的大量数据却难以管理并引发许多问题。如观察到的基因表达量变的有效值和精确值是多少？哪些基因要被优选作为进一步研究的靶点？如何确定某个基因的表达的是肿瘤发生的起因还是后果？如何将多种样品和许多专家获得的知识组成的数据库发挥作用以供生物医学咨询？
利用基因微阵列研究人类肿瘤学将会有助于肿瘤发生过程中相应的分子事件的研究，更深刻地了解肿瘤及其它疾病的基因变化路径和机制[4，5]。
参考文献
1 Duggan DJ, Bittner M, Chen Y, et al. Nat Genet,1999;21(1 Suppl):10～14
, 百拇医药
2 Wang K, Gan, L,Jeffery E, et al. Gene,1999,229(1-2):101～108
3 Marton MJ,Dekisi JL, Bennett HA, et al. 1998;4(11):1293 ～1301
4 Schena M, Shalon D, Heller R,et al. Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(20):10614～10619
5 Chee M, Yang R, Hubbell E, et al. Science 1996,274(5287):610～614, http://www.100md.com
军事医学科学院放射医学研究所(北京 100850) 吴岚军 王升启 毛秉智(综述)
摘 要 新近发展的高通量的基因表达分析平台——基因芯片技术具有多样品并行处理能力、分析速度快、所需样品量少、污染少等优点，近年来在临床诊断、药物筛选、寻找新基因等研究领域带来革新性的影响。本文综述用基因芯片技术进行肿瘤研究的新策略和模式。
关键词：基因芯片 肿瘤基因表达 检测 cDNA微陈列
cDNA微陈列(基因芯片技术)是将cDNA文库中的已知和未知序列固定于玻片上，同时检测比较生物样品中多个已知或未知序列的表达状况。近年来被越来越多肿瘤生物学家用来分析比较肿瘤组织与相应正常组织之间基因表达的差异，以期发现肿瘤组织中表达的特异基因和药物治疗的靶序列。本文对用基因芯片技术进行肿瘤研究的新策略和模式作一综述。
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一、基因芯片技术的基本原理
探针DNA是指要被有序地点样固定在玻片或硅晶片上的DNA片段，这些片段可通过PCR反应扩增细菌质粒上插入的基因组片段或用通过引物从cDNA文库中PCR扩增得到。这些大小和序列不同的片段分别经过纯化后，机械手高速将它们高密度有序地点样固定在玻片或硅晶片上从而制备成DNA微阵列，用于检测待测样品中是否有与之互补的序列。待测样品中的mRNA被提取后，通过反转录反应过程获得标记荧光的cDNA，与包含上千个基因的DNA微阵列进行杂交反应30分钟到20小时后，将玻片上未互补结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定微阵列上各点的荧光强度，推算出待测样品中各种基因的表达水平。若要比较不同的两个细胞系或不同组织来源的细胞中基因表达的差异，则从不同的两个细胞系或不同的组织来源的细胞中提取mRNA。反转录反应过程中标记上同颜色的荧光，等量混合后，与包含上千个基因的DNA微阵列进行杂交反应，对玻片进行激光共聚焦扫描。比较两种荧光在各点阵上的强度，推算出各基因在不同细胞系中的相对表达水平[1]。
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二、基因芯片平行检测某种肿瘤组织的基因表达谱
华盛顿大学的分子生物学系与病理系联合研究了卵巢癌中基因表达谱的变化[2]，他们将5766个基因探针固定于芯片上，其中5376个分别选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞及正常卵巢的cDNA文库中；另外还有342个来自EST克隆，包括一些已知确定的看家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受体基因、与细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿瘤相关基因。从正常卵巢组织中获得Cy3-标记的cDNA和卵巢癌组织中获得的Cy5-标记的cDNA与芯片杂交结果显示，两者之间有30%的cDNA表达水平表现出2倍的差别，9%的cDNA表达水平表现出3倍以上的差别。根据这些差别，研究小组从中挑选出726个cDNA克隆作进一步测序和比较分析，找出在卵巢癌组织中过度表达的30个有GenBank收录的基因，如高表达的有CD9(GenBank录入号：M38690)、Epithelial glycoprotein (GenBank录入号：M32306)、P27(GenBank录入号：X67325)等，另外还发现曾经报道过的卵巢癌标志物之一HE4蛋白激酶抑制物基因在基因芯片上也表现出过度表达信号。这些数据不但为以前其他方法获得的研究结果提供了进一步参照，而且有助于研究肿瘤发展过程中参与的分子机制及寻找肿瘤诊断和治疗的靶分子，同时也证明了利用基因芯片分析复杂生物体系中分子变化的可行性，与其他的分析方法的比较，基因芯片还具有平行、快速的优越性。
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三、基因芯片在抗肿瘤药物筛选中的应用
NCI(美国国立癌症研究所)在癌症治疗发展计划中观察了65000种以上化合物对9种肿瘤组织来源的60个肿瘤细胞系的作用效应，所得数据为癌症药物的开发和研究提供了很有价值的参考作用，在此基础上，肿瘤生物学家利用基因芯片评估药物对肿瘤治疗的可行性。Scherf用含10000个基因的微阵列对60个肿瘤细胞系的基因表达谱进行分析，获得了一系列标准曲线，发现大部分细胞系保留了其原代分离组织的特征基因表达；又进一步评价122种药物对这些细胞系基因表达的影响，从中筛选出抗肿瘤药物候选化合物，并对其作临床药效评价。又如对cisplatin的疗效观察。Marton等[3]利用基因芯片技术快速检测肿瘤患者样品对ciplatin作用后的反应，发现肿瘤细胞受到药物作用24小时后mRNA的表达发生改变，推断出该药物的药理作用及对不同肿瘤细胞的杀伤效应。
四、问题与结语
, 百拇医药
cDNA微阵列技术被称之为新近发展的高通量的基因表达分析平台，利用它可对特殊的细胞群进行精确的量化基因表达谱的测定，并获得大量的基因表达数据。但由此产生的大量数据却难以管理并引发许多问题。如观察到的基因表达量变的有效值和精确值是多少？哪些基因要被优选作为进一步研究的靶点？如何确定某个基因的表达的是肿瘤发生的起因还是后果？如何将多种样品和许多专家获得的知识组成的数据库发挥作用以供生物医学咨询？
利用基因微阵列研究人类肿瘤学将会有助于肿瘤发生过程中相应的分子事件的研究，更深刻地了解肿瘤及其它疾病的基因变化路径和机制[4，5]。
参考文献
1 Duggan DJ, Bittner M, Chen Y, et al. Nat Genet,1999;21(1 Suppl):10～14
, 百拇医药
2 Wang K, Gan, L,Jeffery E, et al. Gene,1999,229(1-2):101～108
3 Marton MJ,Dekisi JL, Bennett HA, et al. 1998;4(11):1293 ～1301
4 Schena M, Shalon D, Heller R,et al. Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(20):10614～10619
5 Chee M, Yang R, Hubbell E, et al. Science 1996,274(5287):610～614, http://www.100md.com