抗日本血吸虫膜蛋白单克隆抗体NP11－4轻链可变区基因的分离克隆及测序研究
变区基因的分离克隆及测序研究
俞小淙 蒋欣 尹长城 张众 林晴 管晓虹 黄华梁
摘 要：本文报告了从抗日本血吸虫单抗NP11-4杂交瘤细胞株的基因组DNA中，用PCR技术扩增出抗体轻链可变区基因，并克隆至pUC19质粒中进行测序分析。研究表明：该基因长336 bp， 编码112个氨基酸，经结构分析及与抗体库中一般序列的比较，证实该序列为轻链可变区基因，属κ轻链Subgroup II亚类，由种系基因中的V与Jκ 2基因重排而成。
关键词：抗日本血吸虫单抗 轻链可变区基因 PCR 序列分析
单克隆抗体的出现为血吸虫病的临床诊断和免疫学研究提供了重要的手段，但由于绝大多数单抗均来自鼠源，其异源性所导致的过敏反应极大地限制了单抗在临床治疗中的运用[1，2]。近年来，在分子免疫学领域中随着对抗体基因研究的深入以及基因工程技术的发展，产生了基因工程抗体技术，如嵌合抗体、 改形抗体、以及单链抗体等[3]，在保持抗体特异性的基础上，大大地降低了免疫原性，并具有分子小，穿透能力强，体内半衰期短，易于清除，以及生产成本低等优点。在肿瘤、传染性疾病等多种疾病的临床治疗中具有极大的应用前景。我们试图将基因工程抗体技术运用于血吸虫病的研究，为血吸虫病预防和治疗的研究开辟新的途径。为此，本研究分离克隆了抗日本血吸虫膜蛋白单抗NP11—4的轻链可变区基因(VL)，并经测序分析加以验证，为进一步研制特异性单链抗体奠定了基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验材料 分泌抗日本血吸虫膜蛋白单抗的NP11-4细胞株由南京医科大学寄生虫学教研室管晓虹教授提供。限制性内切酶、连接酶、蛋白酶等购自华美生物工程公司，T7测序试剂盒购自Pharmarcia公司，a-32P dCTP购自亚辉生物医学工程公司，PCR仪及Tag酶为本所产品。
1.2 实验方法 细胞株基因组总DNA提取：参照文献[4]介绍的方法进行，DNA纯度A260nm/A280nm为1.8。
PCR：根据已发表的抗体轻链FR1和FR4区的基因序列[1]，设计了一组用于扩增轻链可变区基因的引物[5]，为便于克隆，引物序列中分别加入XbaI和EcoRI酶切位点。PCR总体积为50μl，以基因组DNA为模板，反应条件为94℃变性1min，68℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环。用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，回收特异性扩增产物。
, 百拇医药
PCR产物的克隆和鉴定：回收的PCR产物与pUC19质粒分别用限制性内切酶Xba I和EcoR I双酶切，然后将片段与载体按4∶1的比例进行连接反应，条件为16℃连接20h。转化E.coli DH5α感受态细胞，在X-gal的显色标志下，筛选具氨苄抗性的白色菌落。用碱变性法提取质粒，琼脂糖电泳筛选变大的重组克隆，并用Xba I 和 EcoR I双酶切鉴定。
DNA序列测定及分析：采用Sanger双脱氧法，按Pharmacia公司T7 Sequencing Kit说明书进行操作，用DNASIS软件分析所测序列。
2 结果和讨论
图1 VL基因PCR扩增产物，重组克隆及双酶切鉴定
Fig 1 Analysis of VL gene PCR，recombinant clone
, 百拇医药
and bi-enzyme digestion.
A：DNA分子量标准III ；B：VL 基因扩增产物；
C：重组质粒双酶切鉴定；D：重组质粒；E：pUC19
A：DNA molecular weight marker III B：Amplified VL gene product .
C：VL recombinant clone digested with Xba I and EcoR I
D：recombinant clone E：pUC19
2.1 NP11-4单抗VL基因的PCR扩增与鉴定 经多对引物的配对扩增后，确定引物L110与CL42的组合在NP11-4基因组DNA中扩增出一条特异性的强荧光带，以DNA分子量III 作对照，发现该扩增带位于125～564bp之间，约为330bp左右(图1)。引物序列为：
, 百拇医药
VL 5端引物5—CCTCTAGAGATGTTTTGATGAACCAAA(T)CC—3
XbaI
VL 3端引物5—CCGAATTCTTTGAT(G)CTCCAGCTTGGTCCCCC—3
EcoRI
2.2 NP11-4 VL基因的克隆和鉴定 用粘端连接法将PCR扩增的DNA片段重组至pUC19,筛选出多个变大的克隆，用XbaI和EcoRI双酶切鉴定，获得与PCR扩增产物相同大小的DNA片段，证明扩增产物已插入到质粒中，从而确定为阳性克隆(图1)。
2.3 NP11-4 VL基因DNA序列及编码的氨基酸序列分析 基因DNA序列和编码的氨基酸序列见图2。该基因全长336bp，编码112个氨基酸，有三个互补决定区(CDR)和四个骨架区(FR)，无起始密码子和终止密码子。其第23位和88位为维持抗体空间结构所必需的半胱氨酸密码子TGC，并位于序列的FR内。与Kabat等发表的抗体基因序列相比较，显示NP11-4VL基因属于κ轻链Subgroup II， 由种系基因中的Vκ与Jκ 2基因重排而成，与之同源性最高的种系成员为19E11，达89%[6]。
, 百拇医药
图2 VL基因核苷酸序列及编码的氨基酸序列
Fig 2 The nucleotide sequences and encoding amino acid sequence of VL genes
本研究用PCR技术从细胞株总DNA中直接扩增出VL基因序列。较以cDNA为模板扩增抗体的可变区基因更为简捷和快速。但值得注意的是，由于杂交瘤细胞基因组或总mRNA中含有亲本骨髓瘤细胞轻链的重排基因或mRNA，PCR过程中有可能扩增出骨髓瘤的轻链序列，因此要确定扩增产物是否为抗体基因序列必须通过测序分析，抗体的VL中第23位和88位必定为半胱氨酸，而骨髓瘤则为酪氨酸[7]。抗体可变区的半胱氨酸所形成的链内二硫键在维持抗体可变区空间结构上具有重要作用。免疫学研究证明，每个淋巴细胞只产生一种类型的抗体，亦即只含有一种抗体的重排基因。我们过去的工作已证明这一点[8]。因此，从分泌抗日本血吸虫膜蛋白单抗的杂交瘤细胞基因组中扩增出的VL基因必定是该单抗的基因。
, 百拇医药
NP11-4是一株抗日本血吸虫膜蛋白的单抗，与成虫表膜、尾蚴膜、童虫膜，虫卵卵壳及卵内毛蚴膜均具有较高的结合力，用化学方法与青蒿琥酯偶联制成的免疫毒素在小鼠体内有一定的杀虫作用，平均减虫率达44.76%，最高可达86.78%，此外还具有较好的预防作用和抗雌虫生殖产卵作用[9]。因此以NP11-4单抗为材料制备scFv具有极大的临床应用前景，而NP11-4VL基因的获得则为该项研究奠定了基础。
俞小淙(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
蒋欣(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
尹长城(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
张众(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
林晴(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
, 百拇医药
管晓虹(南京医科大学寄生虫学教研室)
黄华梁(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
参考文献
1，Shawler D.I. et al. Human immune response to multiple injections of murine monoclonal IgG[J]. J Immunol， 1985，135∶1530.
2， Chatenoud L. et al.Restriction of the human in viro immunoresponse against the mouse monoclonal antibody OKT3[J].J Immunol， 1986， 137∶830.
, 百拇医药
3， 吴朝伟， 等. 基因工程抗体[J].生物学通报，1996， 31(6)∶9.
4， J. 萨姆布鲁克， 等著， 金冬雁， 等译. 分子克隆实验指南[M].第2版， 北京：科学技术出版社，1993， 463～468.
5， 张卫国， 等. 噬菌体呈示单链抗体表达载体及小鼠非特异抗体库的构建[J].遗传学报， 1999，26(2)∶99.
6， Kabat EA， et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest[M].5th ed. U.S. Department of Health and Human services， Bethesda.1991，91～3242.
7， Carroll WL， et al. Hybridoma fusion cell lines contain an aberrant Kappa transcript， [Mol Immunol]，1988，25(10)∶991.
8，王勇， 等. 抗人肺腺癌单克隆抗体重轻链可变区基因的分离克隆和序列测定[J].遗传学报. 1996， 23(2)∶91.
9，冯振卿，等.免疫毒素用于预防日本血吸虫病的初步探索[J].南京医科大学学报，1998，118(1)∶4., 百拇医药
俞小淙 蒋欣 尹长城 张众 林晴 管晓虹 黄华梁
摘 要：本文报告了从抗日本血吸虫单抗NP11-4杂交瘤细胞株的基因组DNA中，用PCR技术扩增出抗体轻链可变区基因，并克隆至pUC19质粒中进行测序分析。研究表明：该基因长336 bp， 编码112个氨基酸，经结构分析及与抗体库中一般序列的比较，证实该序列为轻链可变区基因，属κ轻链Subgroup II亚类，由种系基因中的V与Jκ 2基因重排而成。
关键词：抗日本血吸虫单抗 轻链可变区基因 PCR 序列分析
单克隆抗体的出现为血吸虫病的临床诊断和免疫学研究提供了重要的手段，但由于绝大多数单抗均来自鼠源，其异源性所导致的过敏反应极大地限制了单抗在临床治疗中的运用[1，2]。近年来，在分子免疫学领域中随着对抗体基因研究的深入以及基因工程技术的发展，产生了基因工程抗体技术，如嵌合抗体、 改形抗体、以及单链抗体等[3]，在保持抗体特异性的基础上，大大地降低了免疫原性，并具有分子小，穿透能力强，体内半衰期短，易于清除，以及生产成本低等优点。在肿瘤、传染性疾病等多种疾病的临床治疗中具有极大的应用前景。我们试图将基因工程抗体技术运用于血吸虫病的研究，为血吸虫病预防和治疗的研究开辟新的途径。为此，本研究分离克隆了抗日本血吸虫膜蛋白单抗NP11—4的轻链可变区基因(VL)，并经测序分析加以验证，为进一步研制特异性单链抗体奠定了基础。
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1 材料和方法
1.1 实验材料 分泌抗日本血吸虫膜蛋白单抗的NP11-4细胞株由南京医科大学寄生虫学教研室管晓虹教授提供。限制性内切酶、连接酶、蛋白酶等购自华美生物工程公司，T7测序试剂盒购自Pharmarcia公司，a-32P dCTP购自亚辉生物医学工程公司，PCR仪及Tag酶为本所产品。
1.2 实验方法 细胞株基因组总DNA提取：参照文献[4]介绍的方法进行，DNA纯度A260nm/A280nm为1.8。
PCR：根据已发表的抗体轻链FR1和FR4区的基因序列[1]，设计了一组用于扩增轻链可变区基因的引物[5]，为便于克隆，引物序列中分别加入XbaI和EcoRI酶切位点。PCR总体积为50μl，以基因组DNA为模板，反应条件为94℃变性1min，68℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环。用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，回收特异性扩增产物。
, 百拇医药
PCR产物的克隆和鉴定：回收的PCR产物与pUC19质粒分别用限制性内切酶Xba I和EcoR I双酶切，然后将片段与载体按4∶1的比例进行连接反应，条件为16℃连接20h。转化E.coli DH5α感受态细胞，在X-gal的显色标志下，筛选具氨苄抗性的白色菌落。用碱变性法提取质粒，琼脂糖电泳筛选变大的重组克隆，并用Xba I 和 EcoR I双酶切鉴定。
DNA序列测定及分析：采用Sanger双脱氧法，按Pharmacia公司T7 Sequencing Kit说明书进行操作，用DNASIS软件分析所测序列。
2 结果和讨论
图1 VL基因PCR扩增产物，重组克隆及双酶切鉴定
Fig 1 Analysis of VL gene PCR，recombinant clone
, 百拇医药
and bi-enzyme digestion.
A：DNA分子量标准III ；B：VL 基因扩增产物；
C：重组质粒双酶切鉴定；D：重组质粒；E：pUC19
A：DNA molecular weight marker III B：Amplified VL gene product .
C：VL recombinant clone digested with Xba I and EcoR I
D：recombinant clone E：pUC19
2.1 NP11-4单抗VL基因的PCR扩增与鉴定 经多对引物的配对扩增后，确定引物L110与CL42的组合在NP11-4基因组DNA中扩增出一条特异性的强荧光带，以DNA分子量III 作对照，发现该扩增带位于125～564bp之间，约为330bp左右(图1)。引物序列为：
, 百拇医药
VL 5端引物5—CCTCTAGAGATGTTTTGATGAACCAAA(T)CC—3
XbaI
VL 3端引物5—CCGAATTCTTTGAT(G)CTCCAGCTTGGTCCCCC—3
EcoRI
2.2 NP11-4 VL基因的克隆和鉴定 用粘端连接法将PCR扩增的DNA片段重组至pUC19,筛选出多个变大的克隆，用XbaI和EcoRI双酶切鉴定，获得与PCR扩增产物相同大小的DNA片段，证明扩增产物已插入到质粒中，从而确定为阳性克隆(图1)。
2.3 NP11-4 VL基因DNA序列及编码的氨基酸序列分析 基因DNA序列和编码的氨基酸序列见图2。该基因全长336bp，编码112个氨基酸，有三个互补决定区(CDR)和四个骨架区(FR)，无起始密码子和终止密码子。其第23位和88位为维持抗体空间结构所必需的半胱氨酸密码子TGC，并位于序列的FR内。与Kabat等发表的抗体基因序列相比较，显示NP11-4VL基因属于κ轻链Subgroup II， 由种系基因中的Vκ与Jκ 2基因重排而成，与之同源性最高的种系成员为19E11，达89%[6]。
, 百拇医药
图2 VL基因核苷酸序列及编码的氨基酸序列
Fig 2 The nucleotide sequences and encoding amino acid sequence of VL genes
本研究用PCR技术从细胞株总DNA中直接扩增出VL基因序列。较以cDNA为模板扩增抗体的可变区基因更为简捷和快速。但值得注意的是，由于杂交瘤细胞基因组或总mRNA中含有亲本骨髓瘤细胞轻链的重排基因或mRNA，PCR过程中有可能扩增出骨髓瘤的轻链序列，因此要确定扩增产物是否为抗体基因序列必须通过测序分析，抗体的VL中第23位和88位必定为半胱氨酸，而骨髓瘤则为酪氨酸[7]。抗体可变区的半胱氨酸所形成的链内二硫键在维持抗体可变区空间结构上具有重要作用。免疫学研究证明，每个淋巴细胞只产生一种类型的抗体，亦即只含有一种抗体的重排基因。我们过去的工作已证明这一点[8]。因此，从分泌抗日本血吸虫膜蛋白单抗的杂交瘤细胞基因组中扩增出的VL基因必定是该单抗的基因。
, 百拇医药
NP11-4是一株抗日本血吸虫膜蛋白的单抗，与成虫表膜、尾蚴膜、童虫膜，虫卵卵壳及卵内毛蚴膜均具有较高的结合力，用化学方法与青蒿琥酯偶联制成的免疫毒素在小鼠体内有一定的杀虫作用，平均减虫率达44.76%，最高可达86.78%，此外还具有较好的预防作用和抗雌虫生殖产卵作用[9]。因此以NP11-4单抗为材料制备scFv具有极大的临床应用前景，而NP11-4VL基因的获得则为该项研究奠定了基础。
俞小淙(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
蒋欣(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
尹长城(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
张众(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
林晴(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
, 百拇医药
管晓虹(南京医科大学寄生虫学教研室)
黄华梁(中国科学院遗传研究所 北京，100101)
参考文献
1，Shawler D.I. et al. Human immune response to multiple injections of murine monoclonal IgG[J]. J Immunol， 1985，135∶1530.
2， Chatenoud L. et al.Restriction of the human in viro immunoresponse against the mouse monoclonal antibody OKT3[J].J Immunol， 1986， 137∶830.
, 百拇医药
3， 吴朝伟， 等. 基因工程抗体[J].生物学通报，1996， 31(6)∶9.
4， J. 萨姆布鲁克， 等著， 金冬雁， 等译. 分子克隆实验指南[M].第2版， 北京：科学技术出版社，1993， 463～468.
5， 张卫国， 等. 噬菌体呈示单链抗体表达载体及小鼠非特异抗体库的构建[J].遗传学报， 1999，26(2)∶99.
6， Kabat EA， et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest[M].5th ed. U.S. Department of Health and Human services， Bethesda.1991，91～3242.
7， Carroll WL， et al. Hybridoma fusion cell lines contain an aberrant Kappa transcript， [Mol Immunol]，1988，25(10)∶991.
8，王勇， 等. 抗人肺腺癌单克隆抗体重轻链可变区基因的分离克隆和序列测定[J].遗传学报. 1996， 23(2)∶91.
9，冯振卿，等.免疫毒素用于预防日本血吸虫病的初步探索[J].南京医科大学学报，1998，118(1)∶4., 百拇医药