福建省艾滋病分子流行病学的初步调查
严延生 陈舸 郑兆双
关键词；福建省 艾滋病 分子流行病学 艾滋病病毒(HIV)基因的高度变异性，使其在传播过程中产生出许多具有基因序列特性的亚型(subtype)，并在全球范围流行蔓延过程中形成一定的地区性分布特点。根据HIV-l基因组中变异性最大、同时也被研究最多的膜蛋白基因(env)核酸和氨基酸序列的同源性，目前已确定了由A～J和O至少11种HIV-1亚型。各亚型间基因核苷酸序列的差异较大，A～J亚型间的差异一般在22%～35%，而O亚型与A～J各亚型间的差异则高达50%以上[1～3]。
HIV-l基因的高度变异性是研制AIDS疫苗的一个较大障碍。分析和鉴定感染人群中HIV-l亚型的分布及其变化过程，是研制有针对性HIV-l疫苗的重要课题，同时也是研究HIV-1生物学特性的分子基础；另一方面，对HIV-1基因变异和地区分布的分析，又是分子流行病学研究的重要内容。通过这些研究，使我们有可能追踪传染源、传播途径和发展趋势，为决策部门制定相应的预防控制措施提供科学依据。
, 百拇医药
1987年1月，福建发现首例外籍华人AIDS病例，90年代起，感染人数增多，目前已发现100多例感染者。境外感染是福建省HIV抗体阳性者产生的主要特点,其中多数感染地点系在东南亚国家，其它感染地点为美国和非洲一些国家[4]；1996年以来福建境内感染者明显增多，1998年发现的HIV感染者就占累计发现数的32%，其中近一半系在国内经性接触感染。由于福建卖淫嫖娼活动仍很严重，HIV经性接触传播扩大流行将难以避免，为了对流行于福建境内艾滋病病原及流行发展趋势有一定的了解，我们采用基因测序法进行本省HIV分子流行病学的初步调查，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 对象和样品 研究对象为9名经性途径感染HIV-l抗体阳性者(见表1)，其中2人为夫妻关系，女方可能系被其夫传染。6名男性感染者均有涉外史，其中1人曾到过美国，其余3名女性纯属境内感染。每名对象采集静脉血3～5ml，肝素抗凝(20U/ml)，用淋巴细胞分离液分离周围血单核细胞(PBMC)，PBS洗2遍，加入含6μg/ml蛋白酶K的裂解液(10mmol/LT ris-HCl pH8.4，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.1%gelatin，0.45%NP40，0.45%Tween-20)，使成6×106细胞浓度，60℃温育2h后，95℃15min灭活蛋白酶K，样品置-20℃保存。
, 百拇医药
表1 9例HIV-1抗体阳性者基本特征
标本代码
性别
年龄
职业
确认时状态
可能感染途径
可能感染地点
HIV-1亚型
FJ1U
女
27
干部
, 百拇医药
感染者
性接触
本省
E
FJ2U
男
37
海员
感染者
性接触
毛里求斯、新加坡
E
FJ3U
, 百拇医药
女
32
工人
感染者
性接触
本省
C
FJ4U
女
24
待业
感染者
性接触
本省
, http://www.100md.com
E
FJ5U
男
42
农民
感染者
性接触
泰国、马来西亚
E
FJ6U
男
29
海员
, 百拇医药 艾滋病病人
性接触
泰国、日本等
E
FJ7U
男
18
待业
感染者
性接触
柬埔寨
E
FJ8U
, 百拇医药 男
51
经理
感染者
血途径
美国
B
FJ10U
男
32
农民
感染者
性接触
新加坡
, 百拇医药
E
1.2 PCR按nested-PCR方法设计合成多对PCR引物(表2)，扩增HIV-l env基因。以env-L/env-i为外侧扩增引物，进行第一次PCR反应，条件为：95℃1min变性；94℃30sec，55℃30sec，72℃120sec，30个循环；72℃10min。取1/10 PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，按上述条件进行第二次PCR扩增env基因C2-V3区。 表2 PCR和测序引物
引物
用途
序列(5’～3’)
在env基因
的定位
env-L
, http://www.100md.com
PCR
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
PCR
TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
PCR
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
1536
env-C
, http://www.100md.com
PCR
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D
Seq
GGGAGTCTAGCAGAAGAAGAG
788
env-f
Seq
GATTATTGTTTTATTATTAA
1077
1.3 PCR产物的纯化 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与Marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiagen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-l DNA片段。回收的DNA溶于10mmol/L Tris-HCl pH8.7,经琼脂糖凝胶电泳后,与分子量标准比较估算核酸浓度。
, 百拇医药
1.4 核苷酸序列测定分别使用env-D和env-f为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约lμg，引物用量为6pmol/L,反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
1.5 序列分析测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校核后确定。序列的排列、比较和同源性等分析，使用威斯康星比GCG公司软件包完成，具体包括：用Piluep程序对样品及国际标准序列的排列和比较；用Pretty程序计算一组序列的共享序列(Consensus sequence)；用Distances计算一组序列间的基因离散率；用Groutree程序做系统树(Phylogenetic tree)分析。
2 结果
经Nested-PCR扩增后，从9份HIV-l阳性者PBMCs样品中获得可用于序列测定的HIV-1 env基因的目的片段。将由env-D和env-f引物测序结果进行编辑整理后，采用引物内侧247核苷酸序列，应用Pileup和Pretty程序进行有关排列和比较，计算出其共享序列。将9个毒株核苷酸序列分别与6个国际标准亚型(A～F)和其他4个参考毒株[SF2-ENV(B)、AF067155-ENV(C)、CM240X(E)和GX-ECOM(E)]的共享序列进行比较，计算彼此间的基因离散率，结果FJ1、FJ2、FJ4、FJ5、FJ6、FJ7和FJ10U 7份标本的序列接近E亚型代表株Econ、GX- Econ和CM240X，其离散率介于5.0%～5.1%，组内基因离散率为6.5±2.6，而与A、B、C、D和F亚型共享序列间的离散率至少高于21%以上(见表3)；其余2份标本，FJ3序列接近C亚型代表株CCON和 AF067155-ENV，离散率分别为13.0%和11.5%,而与其他亚型的离散率至少超过23.0%；FJ8序列接近B亚型代表株BCON和SF2-ENV,离散率分别为7.8%及13.0%，而与其他亚型的离散率至少超过20.0%。
, 百拇医药
表3 福建HIV-1 E亚型毒株与A-E国际亚型和部分参考毒株基因离散率的比较
亚型
基因离散率(X±s%)
本型内
Acon
Bcon
Ccon
Dcon
E
Fcon
Econ
GX-Econ
, 百拇医药
CM240
fE
6.5±2.6
22.3±1.9
22.1±2.1
23.4±2.6
26.7±2.7
5.1±2.1
5.9±2.3
5.3±2.4
21.7±2.4
图1 福建省HIV-1毒株的系统树分析
, 百拇医药
FJ1-8,FJ10U分别代表福建9个HIV-1毒株C2-V3区序列.ACON为A亚型参考序列;BCON和SF2ENV为B亚型参考序列;CCON和AF067155ENV为C亚型参考序列;DCON为D亚型参考序列;ECON,GX-ECON和CM240X为E亚型参考序列;FCON为F亚型参考序列.
进一步的系统树分析(见图1)证实，FJ8与B亚型代表株聚集，FJ3与C亚型代表株聚集，FJ1，FJ2，FJ4～FJ7,FJ10U 7个毒株与E亚型代表株聚集而远离其它国际亚型毒株序列，因此，根据离散率计算及系统树分析结果，确定FJ8为B亚型，FJ3为C亚型，其他7个毒株均为E亚型。
3 讨论
流行病学资料表明，本研究中9名感染者中6名为男性，均有涉外史，除1例(FJ8U)否认有嫖娼行为，并称在美国有拔牙史外，其余5例均有与当地妓女发生性关系；而3名女性或为感染者的配偶或为暗娼，也是从性途径获得感染，因此从标本的属性来说，基本上可以反映福建HIV-1流行毒株的状况，具有一定的代表性。
, http://www.100md.com
核苷酸序列分析证实E亚型有7份，占分析总数的77.8%(7/9),而B、C亚型各只占1例，说明福建HIV-1流行株目前系以E亚型为主。由于福建HIV的流行现状主要以性接触途径缓慢传播扩散，因此，如果在新感染者中，其他型别尤其是B亚型增多时，则应考虑其他传播方式的发生，如静脉吸毒人群中发生HIV-1的流行。
经血传播HIV-1速度快，在一定时间内，相同亚型毒株之间基因组核苷酸序列差异小，离散率低，如云南、新疆、四川和湖北等地静脉吸毒人群中流行的B、C亚型，彼此间基因离散率一般不超过2%[5～8]。本研究中E亚型与国际或参考毒株比较，离散率介于5.1%～5.9%之间，且组内基因离散率也相对较大，为6.5±2.6，表明各株间核苷酸序列存在一定差异，但由于HIV-1经性接触传播是一种散发流行的过程，与血源性传播可造成局部暴发流行过程不同，因此不能单一地用离散率来推测HIV-1E亚型在福建流行的时间，E亚型流行株离散率间的差异可能是不同感染地点、不同感染毒株以及流行时间不同三个综合因素的结果。
, http://www.100md.com
福建省自然科学基金资助项目(项目编号：C9910017)
严延生(福建省卫生防疫站 福州，350001)
陈舸(福建省卫生防疫站 福州，350001)
郑兆双(福建省卫生防疫站 福州，350001)
参考文献
1，Myers G,Korber B,Smith RF,et al.Human Retroviruses and AIDS,l993〔M〕，Los Alamos,New Mexico:Los Alamos National Laboratory,1993
2，Weniger BG，Yutaka Takebe,Ou CY,et al.The molecular epidemiology of HIV in Asia〔J〕.AIDS,1994,8(suppl 2)∶1.
, 百拇医药
3，Janssons W,Fransen K,Loussert A,et al.Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa〔J〕.AIDS Res Hum Rtroviruses,1994,10∶877.
4，严延生，郑兆双，邵一鸣，等.福建省艾滋病的流行特征及流行趋势分析〔J〕.中华流行病学杂志，1999,20∶23.
5，邵一鸣，赵全壁，管永军.1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析〔J〕.病毒学报，1996，12.
6，白旭华，管永军，张远志，等.新疆乌鲁木齐HIV-1流行毒株膜蛋白基因C2-V3区序列测定和亚型分析〔J〕.病毒学报，1997,13∶339.
7，李允文，邵一鸣，罗小光，等.湖北省HIV-1 流行毒株的基因序列测定和亚型分析〔J〕.中华流行病学杂志.1997,18∶217.
8，秦光明，邵一鸣，刘刚，等.四川省HIV-1流行毒株的基因序列测定和亚型分析〔J〕.中华流行病学杂志.1998,19∶39～42., 百拇医药
关键词；福建省 艾滋病 分子流行病学 艾滋病病毒(HIV)基因的高度变异性，使其在传播过程中产生出许多具有基因序列特性的亚型(subtype)，并在全球范围流行蔓延过程中形成一定的地区性分布特点。根据HIV-l基因组中变异性最大、同时也被研究最多的膜蛋白基因(env)核酸和氨基酸序列的同源性，目前已确定了由A～J和O至少11种HIV-1亚型。各亚型间基因核苷酸序列的差异较大，A～J亚型间的差异一般在22%～35%，而O亚型与A～J各亚型间的差异则高达50%以上[1～3]。
HIV-l基因的高度变异性是研制AIDS疫苗的一个较大障碍。分析和鉴定感染人群中HIV-l亚型的分布及其变化过程，是研制有针对性HIV-l疫苗的重要课题，同时也是研究HIV-1生物学特性的分子基础；另一方面，对HIV-1基因变异和地区分布的分析，又是分子流行病学研究的重要内容。通过这些研究，使我们有可能追踪传染源、传播途径和发展趋势，为决策部门制定相应的预防控制措施提供科学依据。
, 百拇医药
1987年1月，福建发现首例外籍华人AIDS病例，90年代起，感染人数增多，目前已发现100多例感染者。境外感染是福建省HIV抗体阳性者产生的主要特点,其中多数感染地点系在东南亚国家，其它感染地点为美国和非洲一些国家[4]；1996年以来福建境内感染者明显增多，1998年发现的HIV感染者就占累计发现数的32%，其中近一半系在国内经性接触感染。由于福建卖淫嫖娼活动仍很严重，HIV经性接触传播扩大流行将难以避免，为了对流行于福建境内艾滋病病原及流行发展趋势有一定的了解，我们采用基因测序法进行本省HIV分子流行病学的初步调查，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 对象和样品 研究对象为9名经性途径感染HIV-l抗体阳性者(见表1)，其中2人为夫妻关系，女方可能系被其夫传染。6名男性感染者均有涉外史，其中1人曾到过美国，其余3名女性纯属境内感染。每名对象采集静脉血3～5ml，肝素抗凝(20U/ml)，用淋巴细胞分离液分离周围血单核细胞(PBMC)，PBS洗2遍，加入含6μg/ml蛋白酶K的裂解液(10mmol/LT ris-HCl pH8.4，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.1%gelatin，0.45%NP40，0.45%Tween-20)，使成6×106细胞浓度，60℃温育2h后，95℃15min灭活蛋白酶K，样品置-20℃保存。
, 百拇医药
表1 9例HIV-1抗体阳性者基本特征
标本代码
性别
年龄
职业
确认时状态
可能感染途径
可能感染地点
HIV-1亚型
FJ1U
女
27
干部
, 百拇医药
感染者
性接触
本省
E
FJ2U
男
37
海员
感染者
性接触
毛里求斯、新加坡
E
FJ3U
, 百拇医药
女
32
工人
感染者
性接触
本省
C
FJ4U
女
24
待业
感染者
性接触
本省
, http://www.100md.com
E
FJ5U
男
42
农民
感染者
性接触
泰国、马来西亚
E
FJ6U
男
29
海员
, 百拇医药 艾滋病病人
性接触
泰国、日本等
E
FJ7U
男
18
待业
感染者
性接触
柬埔寨
E
FJ8U
, 百拇医药 男
51
经理
感染者
血途径
美国
B
FJ10U
男
32
农民
感染者
性接触
新加坡
, 百拇医药
E
1.2 PCR按nested-PCR方法设计合成多对PCR引物(表2)，扩增HIV-l env基因。以env-L/env-i为外侧扩增引物，进行第一次PCR反应，条件为：95℃1min变性；94℃30sec，55℃30sec，72℃120sec，30个循环；72℃10min。取1/10 PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，按上述条件进行第二次PCR扩增env基因C2-V3区。 表2 PCR和测序引物
引物
用途
序列(5’～3’)
在env基因
的定位
env-L
, http://www.100md.com
PCR
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
PCR
TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
PCR
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
1536
env-C
, http://www.100md.com
PCR
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D
Seq
GGGAGTCTAGCAGAAGAAGAG
788
env-f
Seq
GATTATTGTTTTATTATTAA
1077
1.3 PCR产物的纯化 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与Marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiagen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-l DNA片段。回收的DNA溶于10mmol/L Tris-HCl pH8.7,经琼脂糖凝胶电泳后,与分子量标准比较估算核酸浓度。
, 百拇医药
1.4 核苷酸序列测定分别使用env-D和env-f为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约lμg，引物用量为6pmol/L,反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
1.5 序列分析测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校核后确定。序列的排列、比较和同源性等分析，使用威斯康星比GCG公司软件包完成，具体包括：用Piluep程序对样品及国际标准序列的排列和比较；用Pretty程序计算一组序列的共享序列(Consensus sequence)；用Distances计算一组序列间的基因离散率；用Groutree程序做系统树(Phylogenetic tree)分析。
2 结果
经Nested-PCR扩增后，从9份HIV-l阳性者PBMCs样品中获得可用于序列测定的HIV-1 env基因的目的片段。将由env-D和env-f引物测序结果进行编辑整理后，采用引物内侧247核苷酸序列，应用Pileup和Pretty程序进行有关排列和比较，计算出其共享序列。将9个毒株核苷酸序列分别与6个国际标准亚型(A～F)和其他4个参考毒株[SF2-ENV(B)、AF067155-ENV(C)、CM240X(E)和GX-ECOM(E)]的共享序列进行比较，计算彼此间的基因离散率，结果FJ1、FJ2、FJ4、FJ5、FJ6、FJ7和FJ10U 7份标本的序列接近E亚型代表株Econ、GX- Econ和CM240X，其离散率介于5.0%～5.1%，组内基因离散率为6.5±2.6，而与A、B、C、D和F亚型共享序列间的离散率至少高于21%以上(见表3)；其余2份标本，FJ3序列接近C亚型代表株CCON和 AF067155-ENV，离散率分别为13.0%和11.5%,而与其他亚型的离散率至少超过23.0%；FJ8序列接近B亚型代表株BCON和SF2-ENV,离散率分别为7.8%及13.0%，而与其他亚型的离散率至少超过20.0%。
, 百拇医药
表3 福建HIV-1 E亚型毒株与A-E国际亚型和部分参考毒株基因离散率的比较
亚型
基因离散率(X±s%)
本型内
Acon
Bcon
Ccon
Dcon
E
Fcon
Econ
GX-Econ
, 百拇医药
CM240
fE
6.5±2.6
22.3±1.9
22.1±2.1
23.4±2.6
26.7±2.7
5.1±2.1
5.9±2.3
5.3±2.4
21.7±2.4
图1 福建省HIV-1毒株的系统树分析
, 百拇医药
FJ1-8,FJ10U分别代表福建9个HIV-1毒株C2-V3区序列.ACON为A亚型参考序列;BCON和SF2ENV为B亚型参考序列;CCON和AF067155ENV为C亚型参考序列;DCON为D亚型参考序列;ECON,GX-ECON和CM240X为E亚型参考序列;FCON为F亚型参考序列.
进一步的系统树分析(见图1)证实，FJ8与B亚型代表株聚集，FJ3与C亚型代表株聚集，FJ1，FJ2，FJ4～FJ7,FJ10U 7个毒株与E亚型代表株聚集而远离其它国际亚型毒株序列，因此，根据离散率计算及系统树分析结果，确定FJ8为B亚型，FJ3为C亚型，其他7个毒株均为E亚型。
3 讨论
流行病学资料表明，本研究中9名感染者中6名为男性，均有涉外史，除1例(FJ8U)否认有嫖娼行为，并称在美国有拔牙史外，其余5例均有与当地妓女发生性关系；而3名女性或为感染者的配偶或为暗娼，也是从性途径获得感染，因此从标本的属性来说，基本上可以反映福建HIV-1流行毒株的状况，具有一定的代表性。
, http://www.100md.com
核苷酸序列分析证实E亚型有7份，占分析总数的77.8%(7/9),而B、C亚型各只占1例，说明福建HIV-1流行株目前系以E亚型为主。由于福建HIV的流行现状主要以性接触途径缓慢传播扩散，因此，如果在新感染者中，其他型别尤其是B亚型增多时，则应考虑其他传播方式的发生，如静脉吸毒人群中发生HIV-1的流行。
经血传播HIV-1速度快，在一定时间内，相同亚型毒株之间基因组核苷酸序列差异小，离散率低，如云南、新疆、四川和湖北等地静脉吸毒人群中流行的B、C亚型，彼此间基因离散率一般不超过2%[5～8]。本研究中E亚型与国际或参考毒株比较，离散率介于5.1%～5.9%之间，且组内基因离散率也相对较大，为6.5±2.6，表明各株间核苷酸序列存在一定差异，但由于HIV-1经性接触传播是一种散发流行的过程，与血源性传播可造成局部暴发流行过程不同，因此不能单一地用离散率来推测HIV-1E亚型在福建流行的时间，E亚型流行株离散率间的差异可能是不同感染地点、不同感染毒株以及流行时间不同三个综合因素的结果。
, http://www.100md.com
福建省自然科学基金资助项目(项目编号：C9910017)
严延生(福建省卫生防疫站 福州，350001)
陈舸(福建省卫生防疫站 福州，350001)
郑兆双(福建省卫生防疫站 福州，350001)
参考文献
1，Myers G,Korber B,Smith RF,et al.Human Retroviruses and AIDS,l993〔M〕，Los Alamos,New Mexico:Los Alamos National Laboratory,1993
2，Weniger BG，Yutaka Takebe,Ou CY,et al.The molecular epidemiology of HIV in Asia〔J〕.AIDS,1994,8(suppl 2)∶1.
, 百拇医药
3，Janssons W,Fransen K,Loussert A,et al.Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa〔J〕.AIDS Res Hum Rtroviruses,1994,10∶877.
4，严延生，郑兆双，邵一鸣，等.福建省艾滋病的流行特征及流行趋势分析〔J〕.中华流行病学杂志，1999,20∶23.
5，邵一鸣，赵全壁，管永军.1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析〔J〕.病毒学报，1996，12.
6，白旭华，管永军，张远志，等.新疆乌鲁木齐HIV-1流行毒株膜蛋白基因C2-V3区序列测定和亚型分析〔J〕.病毒学报，1997,13∶339.
7，李允文，邵一鸣，罗小光，等.湖北省HIV-1 流行毒株的基因序列测定和亚型分析〔J〕.中华流行病学杂志.1997,18∶217.
8，秦光明，邵一鸣，刘刚，等.四川省HIV-1流行毒株的基因序列测定和亚型分析〔J〕.中华流行病学杂志.1998,19∶39～42., 百拇医药