人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立
人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立
屠亚军 琦祖和 杨鹏 潘燕 于树玉 杜淼 李光三
摘 要 目的 建立人乙型肝炎病毒x(HBx)基因转基因小鼠模型。方法 用显微注射法制备转基因小鼠，用分子杂交法鉴定转基因小鼠HBx的整合与表达。 结果 建立了人HBx基因转基因小鼠模型。经Southern杂交鉴定得到17只转基因首建鼠。自肝脏提取总RNA进行Northern杂交，结果显示17只首建鼠肝脏中均有HBx表达。结论 为从整体水平研究慢性乙型肝炎患者诱发肝癌的作用机制及HBx的反式激活作用机制提供了理想的动物模型。
关键词：乙型肝炎病毒 转基因小鼠 模型
, 百拇医药
据文献报道[1，2]，与乙型肝炎相关的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)都出现HBV DNA序列在宿主细胞染色体上的整合。其中乙型肝炎病毒x(HBx)基因又是常见的整合序列，且整合的HBx基因仍可表达有活性的蛋白质。HBx基因的表达被认为与乙型肝炎病毒感染后导致的肝细胞恶变有密切的关系。为研究乙型肝炎病毒的感染与肝癌发生的关系以及为寻找有效的预防和治疗手段提供理想的研究模型，本研究制备了重组HBx基因，并用显微注射法制备了转基因小鼠。
材料和方法
菌种和质粒 大肠杆菌DH5α，重组质粒pXKS(含自身HBx基因启动子)为本室自备。
试剂 T4DNA连接酶，各种限制性内切酶购自Promega公司及本所友谊医学开发公司，蛋白酶K为德国Merck公司产品，Nick-Translation Kit购自华美公司，α-32P购自亚辉生物医学工程公司。
, http://www.100md.com
实验动物 卵供体母鼠、假孕母鼠、正常公鼠及结扎公鼠均为昆明种小鼠，由中国医学科学院实验动物繁育中心提供。
常规分子生物学方法 质粒DNA提取、鉴定、重组克隆，Southern印迹杂交法，Northern印迹杂交法等按文献[3]方法。
组织总RNA提取 按文献[4]方法。
显微注射法制备转基因小鼠 显微注射DNA样品的制备，超排卵、取卵及卵的培养，注射DNA到受精卵的雄性原核，注射过的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生4周后自鼠尾提取基因组DNA，Southern杂交鉴定转基因小鼠，以含人HBx基因的1 800 bp显微注射片段为探针，以未经转基因处理的正常小鼠基因组DNA作为阴性对照，所有样品DNA的量都为20 μg，经XhoⅠ酶切完全后电泳。具体方法参照文献[5]进行。
转基因鼠肝脏中HBx表达的测定 经过20个月的观察，将17只整合有人HBx基因的仔鼠处死，一步法从肝脏提取总RNA，各取20 μg进行Northern杂交，以含人HBx基因的1 800 bp显微注射片段为探针，以未经转基因处理的正常小鼠总RNA作为阴性对照。
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结 果
重组质粒的鉴定 重组质粒pXKS经XhoⅠ酶切后产生预期的1 800 bp和4 000 bp两个片段，其中1 800 bp片段为含自身HBx启动子的HBx基因注射片段(图 1)。
图 1 重组人pXKS质粒的酶切鉴定电泳图
Fig 1 Identification of pXKS
Lane1: pXKS plasmid DNA;Lane2: pXKS digested with XhoⅠ;Lane3: 1.8 kb injected fragment;Lane4: λ DNA/HindⅢ marker
显微注射后仔鼠出生情况 共移植338枚经显微注射过的受精卵于16只假孕母鼠的输卵管中，其中12只怀孕，共产仔鼠74只，73只成活。输卵管移植后假孕鼠妊娠率75%，假孕鼠平均产仔数5仔/只，仔鼠出生率21.9%，仔鼠存活率98.6%。
, 百拇医药
Southern杂交鉴定HBx基因在小鼠染色体上的整合 经Southern杂交证实，在73只仔鼠中，17只仔鼠整合有人HBx基因(图 2)。
图 2 仔鼠基因组DNA Southern杂交分析
Fig 2 Southern blot hybridization of the mouse tail DNA
1,19.negtive control;2～18.positive samples
图 3 转基因小鼠肝脏RNA Northern杂交分析
Fig 3 Northern blot hybridization of the mouse hepatic RNA
4～12,17～24.positive samples;1～3,13～16.negtive control
, 百拇医药
Northern杂交鉴定HBx基因在转基因小鼠肝脏的表达 经Northern杂交证实，17只转基因小鼠均在肝脏有HBx基因的表达(图 3)。
讨 论
在过去10年中，对X蛋白(pX)的研究主要集中在揭示pX在HBV感染中与致癌相关的功能。pX是一种影响转录活性的多功能调控蛋白，它可以与不同的宿主靶基因直接或间接作用来调节宿主功能。pX通过调节转录因子或蛋白激酶信号传导系统，反式激活许多与细胞增殖、细胞通讯、急性免疫应答和管家功能等相关的宿主基因。与反式激活截然不同，pX通过与p53或修复酶相互作用来调节DNA修复过程。pX还能影响细胞周期进程、细胞转化和肿瘤发生等。pX的这些生物学功能还有待进一步研究[6，7]。
转基因动物技术目前已经广泛应用于基因在整体水平的表达。按基因导入方式划分，建立转基因动物主要有显微注射法、反转录病毒感染法与胚胎干细胞法。由于反转录病毒的长末端重复(LTR)的甲基化状态常使转基因的表达缺失，因此这种方法较少使用，应用较多的是显微注射法[8]。HBV全基因组、S基因、X基因的转基因小鼠，国际上均有报道。关于HBx转基因小鼠的表达情况，目前的报道并不一致：有的实验没有检测到X蛋白的表达；有的检测到X蛋白的表达，但表达量很低；有的检测到X蛋白的高表达，并观察到癌变[9]。迄今的研究结果表明，HBx基因在转基因小鼠体内的表达与否，表达量的差异，与不同的小鼠品系、基因构建的不同，导入基因的整合位点不同以及不同的HBV亚型均有关系[8，9]。本文用昆明种小鼠，以HBV adrNC-1亚型的HBx基因为注射片段，且保留了HBx自身启动子，成功构建了人HBx转基因小鼠模型，并在小鼠肝脏检测到了HBx基因的表达。为后续研究提供了理想的动物模型。
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国家自然科学基金(39470611)
屠亚军(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
琦祖和(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
杨鹏(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
潘燕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
于树玉(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
杜淼(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
, 百拇医药
李光三(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
参考文献
[1]Urashima T,Saigo K,Kobayashi J,et al.Identification of hepatitis B virus integration in hepatitis C virusinfected hepatocellular carcinoma tissues.J Hepatol,1997,26:771-778
[2]Takeuchi M,Fujimoto J,Niwamoto H,et al.Frequent detection of hepatitis B virus X-gene DNA in hepatocellular carcinoma and adjacent liver tissue in hepatitis B surface antigen-negtive patients.Dig Dis Sci,1997,42:2264-2269
, 百拇医药
[3]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning. New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1989.363-371,474-491
[4]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156-159
[5]Hogan B,Costantini F,Lacy E.Manipulating the mouse embryo.New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1986.89-180
[6]Murakami S.Hepatitis B virus X protein:structure,function and biology.Intervirology,1999,42:81-99
, 百拇医药
[7]Andrisani OM,Barnabas S.The transcriptional function of the heptitis B virus X protein and its role in hepatocarcinogenesis.Int J Oncol,1999,15:373-379
[8]Lee TH,Finegold MJ,Shen RF,et al.Hepatitis B virus transactivator x protein is not tumorigenic in transgenic mice.J Vird,1990,64:5939-5947
[9]Koike K,Moriya K,Iino S,et al.High-level expression of hepatitis B virus HBx gene and hepatocarcinogenesis in transgenic mice. Hepatology,1994,19:810-819, 百拇医药
屠亚军 琦祖和 杨鹏 潘燕 于树玉 杜淼 李光三
摘 要 目的 建立人乙型肝炎病毒x(HBx)基因转基因小鼠模型。方法 用显微注射法制备转基因小鼠，用分子杂交法鉴定转基因小鼠HBx的整合与表达。 结果 建立了人HBx基因转基因小鼠模型。经Southern杂交鉴定得到17只转基因首建鼠。自肝脏提取总RNA进行Northern杂交，结果显示17只首建鼠肝脏中均有HBx表达。结论 为从整体水平研究慢性乙型肝炎患者诱发肝癌的作用机制及HBx的反式激活作用机制提供了理想的动物模型。
关键词：乙型肝炎病毒 转基因小鼠 模型
, 百拇医药
据文献报道[1，2]，与乙型肝炎相关的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)都出现HBV DNA序列在宿主细胞染色体上的整合。其中乙型肝炎病毒x(HBx)基因又是常见的整合序列，且整合的HBx基因仍可表达有活性的蛋白质。HBx基因的表达被认为与乙型肝炎病毒感染后导致的肝细胞恶变有密切的关系。为研究乙型肝炎病毒的感染与肝癌发生的关系以及为寻找有效的预防和治疗手段提供理想的研究模型，本研究制备了重组HBx基因，并用显微注射法制备了转基因小鼠。
材料和方法
菌种和质粒 大肠杆菌DH5α，重组质粒pXKS(含自身HBx基因启动子)为本室自备。
试剂 T4DNA连接酶，各种限制性内切酶购自Promega公司及本所友谊医学开发公司，蛋白酶K为德国Merck公司产品，Nick-Translation Kit购自华美公司，α-32P购自亚辉生物医学工程公司。
, http://www.100md.com
实验动物 卵供体母鼠、假孕母鼠、正常公鼠及结扎公鼠均为昆明种小鼠，由中国医学科学院实验动物繁育中心提供。
常规分子生物学方法 质粒DNA提取、鉴定、重组克隆，Southern印迹杂交法，Northern印迹杂交法等按文献[3]方法。
组织总RNA提取 按文献[4]方法。
显微注射法制备转基因小鼠 显微注射DNA样品的制备，超排卵、取卵及卵的培养，注射DNA到受精卵的雄性原核，注射过的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生4周后自鼠尾提取基因组DNA，Southern杂交鉴定转基因小鼠，以含人HBx基因的1 800 bp显微注射片段为探针，以未经转基因处理的正常小鼠基因组DNA作为阴性对照，所有样品DNA的量都为20 μg，经XhoⅠ酶切完全后电泳。具体方法参照文献[5]进行。
转基因鼠肝脏中HBx表达的测定 经过20个月的观察，将17只整合有人HBx基因的仔鼠处死，一步法从肝脏提取总RNA，各取20 μg进行Northern杂交，以含人HBx基因的1 800 bp显微注射片段为探针，以未经转基因处理的正常小鼠总RNA作为阴性对照。
, http://www.100md.com
结 果
重组质粒的鉴定 重组质粒pXKS经XhoⅠ酶切后产生预期的1 800 bp和4 000 bp两个片段，其中1 800 bp片段为含自身HBx启动子的HBx基因注射片段(图 1)。
图 1 重组人pXKS质粒的酶切鉴定电泳图
Fig 1 Identification of pXKS
Lane1: pXKS plasmid DNA;Lane2: pXKS digested with XhoⅠ;Lane3: 1.8 kb injected fragment;Lane4: λ DNA/HindⅢ marker
显微注射后仔鼠出生情况 共移植338枚经显微注射过的受精卵于16只假孕母鼠的输卵管中，其中12只怀孕，共产仔鼠74只，73只成活。输卵管移植后假孕鼠妊娠率75%，假孕鼠平均产仔数5仔/只，仔鼠出生率21.9%，仔鼠存活率98.6%。
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Southern杂交鉴定HBx基因在小鼠染色体上的整合 经Southern杂交证实，在73只仔鼠中，17只仔鼠整合有人HBx基因(图 2)。
图 2 仔鼠基因组DNA Southern杂交分析
Fig 2 Southern blot hybridization of the mouse tail DNA
1,19.negtive control;2～18.positive samples
图 3 转基因小鼠肝脏RNA Northern杂交分析
Fig 3 Northern blot hybridization of the mouse hepatic RNA
4～12,17～24.positive samples;1～3,13～16.negtive control
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Northern杂交鉴定HBx基因在转基因小鼠肝脏的表达 经Northern杂交证实，17只转基因小鼠均在肝脏有HBx基因的表达(图 3)。
讨 论
在过去10年中，对X蛋白(pX)的研究主要集中在揭示pX在HBV感染中与致癌相关的功能。pX是一种影响转录活性的多功能调控蛋白，它可以与不同的宿主靶基因直接或间接作用来调节宿主功能。pX通过调节转录因子或蛋白激酶信号传导系统，反式激活许多与细胞增殖、细胞通讯、急性免疫应答和管家功能等相关的宿主基因。与反式激活截然不同，pX通过与p53或修复酶相互作用来调节DNA修复过程。pX还能影响细胞周期进程、细胞转化和肿瘤发生等。pX的这些生物学功能还有待进一步研究[6，7]。
转基因动物技术目前已经广泛应用于基因在整体水平的表达。按基因导入方式划分，建立转基因动物主要有显微注射法、反转录病毒感染法与胚胎干细胞法。由于反转录病毒的长末端重复(LTR)的甲基化状态常使转基因的表达缺失，因此这种方法较少使用，应用较多的是显微注射法[8]。HBV全基因组、S基因、X基因的转基因小鼠，国际上均有报道。关于HBx转基因小鼠的表达情况，目前的报道并不一致：有的实验没有检测到X蛋白的表达；有的检测到X蛋白的表达，但表达量很低；有的检测到X蛋白的高表达，并观察到癌变[9]。迄今的研究结果表明，HBx基因在转基因小鼠体内的表达与否，表达量的差异，与不同的小鼠品系、基因构建的不同，导入基因的整合位点不同以及不同的HBV亚型均有关系[8，9]。本文用昆明种小鼠，以HBV adrNC-1亚型的HBx基因为注射片段，且保留了HBx自身启动子，成功构建了人HBx转基因小鼠模型，并在小鼠肝脏检测到了HBx基因的表达。为后续研究提供了理想的动物模型。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金(39470611)
屠亚军(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
琦祖和(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
杨鹏(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
潘燕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
于树玉(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
杜淼(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
, 百拇医药
李光三(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
参考文献
[1]Urashima T,Saigo K,Kobayashi J,et al.Identification of hepatitis B virus integration in hepatitis C virusinfected hepatocellular carcinoma tissues.J Hepatol,1997,26:771-778
[2]Takeuchi M,Fujimoto J,Niwamoto H,et al.Frequent detection of hepatitis B virus X-gene DNA in hepatocellular carcinoma and adjacent liver tissue in hepatitis B surface antigen-negtive patients.Dig Dis Sci,1997,42:2264-2269
, 百拇医药
[3]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning. New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1989.363-371,474-491
[4]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156-159
[5]Hogan B,Costantini F,Lacy E.Manipulating the mouse embryo.New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1986.89-180
[6]Murakami S.Hepatitis B virus X protein:structure,function and biology.Intervirology,1999,42:81-99
, 百拇医药
[7]Andrisani OM,Barnabas S.The transcriptional function of the heptitis B virus X protein and its role in hepatocarcinogenesis.Int J Oncol,1999,15:373-379
[8]Lee TH,Finegold MJ,Shen RF,et al.Hepatitis B virus transactivator x protein is not tumorigenic in transgenic mice.J Vird,1990,64:5939-5947
[9]Koike K,Moriya K,Iino S,et al.High-level expression of hepatitis B virus HBx gene and hepatocarcinogenesis in transgenic mice. Hepatology,1994,19:810-819, 百拇医药