钙超载大鼠肠系膜血管平滑肌细胞钙离子稳态调节的改变
张晓春 徐晓蓉 文允镒
摘 要 目的 探讨钙超大型载模型大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)胞内是否存在钙离子(Ca2+)稳态调节异常，方法 以Fluo-3/AM作为Ca2+指未剂，应用激光扫描共聚焦显微镜技术，比较钙喜好载模型大鼠肠系膜VSMC(CaOMV)与正常Wistar大鼠肠系膜VSMC(WNV)静息态的胞浆与核内Ca2+水平([Ca2+]i，[Ca2+]n)，以及在多种药物刺激下Ca2+稳态调节的差异.结果 两种VSMC静息态[Ca2+]i及[Ca2+]n并无显著性差异，但在KCl、Vay-k8644、Ang-Ⅱ、IP3、CHCl3和CPA等药物作用下，CaOMV[Ca2+]i与 [Ca2+]n的升高幅度较WMV显著增大(P<0.01).结论 (1)CaOMV对激动剂作用的敏感性增强，存在Ca2+稳态调节异常，提示胞内钙超大型载与胞外钙超载同时共丰，是血管硬化和老化机制的两个方面；(2)血管钙超载时，VSMC无论质膜上的Ca2+门控系统还是胞内钙池的释放与重储均有异常；(3)在CaOMV，胞浆与核内钙的调节均存在异常.
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关键词：钙超载Fluo-3/M 肠系膜血管平滑肌细胞钙离子稳态调节胞浆Ca2+核内Ca2+
在人类自然的血管增龄过程中和与年龄相关的血管病理进程中，产生多种血管床结构的变化，其中最显著的是血管钙超载[1，2]。广义的血管钙超载包括两个方面：细胞外超载和细胞内超载，前者指钙在弹力层的沉积，后者则指血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)胞内钙稳态的异常。许多学者认为胞内钙超载与胞外钙超载相伴发生[3，4]，但目前直接的实验证据尚较少。给正常大鼠以维生素D3(Vit D3)同时辅以照射紫外线或口服尼古丁处理，可以较快地建立钙超载模型[1]。由于胞外钙超载最显著的部位是肠系膜血管，故本研究以培养的钙超载模型大鼠和正常Wistar大鼠的肠系膜VSMC为研究对象进行观察，以探讨血管增龄进程中胞内钙超载是否与胞外钙超载并存。
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材料和方法
实验动物 雄性Wistar 大鼠40只，体重180～220 g,年龄为2月龄，随机分为钙超载组和正常对照组。
主要试剂 Vit D3为Merck 公司产品，胎牛血清和DMEM为Gibico公司产品，胰蛋白酶、胶原酶、1，4，5-三磷酸肌醇(inositol-1，4，5-trisphosphate,IP3)、cyclopiazonic acid (CPA)、血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)、Bay-k8644为Sigma 公司产品，acetoxymenthyl esters of fluo-3 (Fluo-3/AM)为Moleculluar Probes公司产品。
主要溶液的配制 (1) 无钙液(Ca-Free,Ca-F):D-Hand's液加入1.00 g/L葡萄糖；(2) 含钙液(Ca-Normal,Ca-N):D-Hand's液中加入1.00 g/L葡萄糖，0.14 g/L CaCl2；(3) DMEM液：DMEM培养基10.0 g溶于950 ml去离子水中，-20℃保存；(4) 消化液：将100 mg胶原酶，100 mg小牛血清白蛋白，1.6 g胰蛋白酶，5 mg链霉素，5000 U青霉素，加至50 ml DMEM中，用孔径为0.22 μm的滤膜过滤。
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钙超载模型的建立 参照文献[1，5]方法，给Wistar大鼠腹腔注射3×106 U/kg Vit D3，于给药后的第2、7、12天进行紫外线照射，每次20 min。在给药后第16天断头处死动物，作细胞培养。
原代培养肠系膜血管平滑肌细胞 参照文献[6]方法，将大鼠断头处死，分离肠系膜动脉 ，于37℃消化，镜下见大量圆形厚壁细胞时终止消化，以100目细胞筛过滤，滤液离心后加入原代培养基，转入培养瓶中于37 ℃，含5%CO2和95%空气的孵箱内孵育。3～5 d后细胞基本汇合，即可传代培养。钙超载组在加入原代培养基后直接转入35 mm塑料培养皿培养，待细胞贴壁后直接负载。
激光扫描共聚焦显微镜观察不同药物作用下VSMC[Ca2+]i和 [Ca2+]n的变化 参照文献[7，8]的方法。 (1) 实验对象：钙超载模型组大鼠肠系膜VSMC (CaOMV)，实验采用原代细胞；正常对照组大鼠肠系膜VSMC(WMV)，实验采用1～3代细胞；(2)负载：将VSMC接种于35 mm塑料培养皿，继续培养24 h，弃培养基，以D-Hank′s 液洗2次，然后以含3 ng/ml Fluo-3/AM的DMEM营养液1 ml负载细胞，37 ℃避光30 min后，吸去负载液，用D-Hank′s 液洗2次，即可进行扫描分析；(3) 测定方法：在细胞外液含钙离子的条件下分别以60 mmol/L KCl、10-6 mol/L Bay-k8644和10-5 mol/L Ang-Ⅱ刺激前述两种VSMC，主要观察细胞膜门控系统的反应。在不含钙离子的条件下，分别加入10-5 mol/L IP3、70 mmol/L CHCl3及1.5×10-5 mol/L CPA，观察胞内与核内钙池的释放。具体测定步骤：加药之前先扫描数次，记录细胞静息态胞浆和核内游离Ca2+荧光强度。随后加入1种药物刺激，连续记录荧光强度的变化，并以达到的最大荧光强度代表该药物的作用，进行组间比较。荧光强度与游离Ca2+浓度成正比，从而反映胞浆及核内游离Ca2+浓度([Ca2+]i，[Ca2+]n)的变化；
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(4) 共聚焦显微镜的测定参数：负载后细胞在ACAS MeridianTM Ultima 212型激光扫描共聚焦显微镜下进行测定，具体参数为激光强度420 mW，扫描强度22%，步长0.5 μm，针孔孔径400 μm。
统计学处理 各组实验数据以平均值±标准误(x±s)表示，组间差异的显著性检验采用t检验。
结 果
钙超载对VSMC静息态[Ca2+]i和[Ca2+]n的影响 与WMV相比，CaOMV静息态胞浆及核内游离Ca2+荧光强度无明显升高，前者分别为(241.25±32.90)和(739.33±131.93)AU，后者分别为(291.92±30.55)和(635.08±88.51)AU，两者比较差异无显著性(P>0.05，n=20)。
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钙超载对VSMC胞浆及核内Ca2+稳态调节的影响 激光扫描共聚焦显微镜下可见，负载后的VSMC轮廓清晰，核区与胞浆界限分明(图1)。在Ca-N液中，以KCl、Bay-k8644和Ang-Ⅱ刺激两种VSMC，均导致胞浆及核内 Ca2+荧光强度迅速升高，与静息态比较，差异具有显著性(P<0.01)。达到峰值后，荧光强度又逐渐降低回至静息水平(图2)，且CaOMV组[Ca2+]i和[Ca2+]n升高的幅度均显著高于WMV组(附表)。在Ca-F液中，IP3、CHCl3及CPA均导致VSMC[Ca2+]i和[Ca2+]n显著升高，而且CaOMV组升高的幅度显著高于WMV (P<0.01，附表)。
图 1 激光扫描共聚焦显微镜下以Fluo-3/AM负载的钙超载大鼠肠系膜血管平滑肌细胞
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Fig 1 Image of mesenteric vascular smooth muscle cell from calcium overload rat load with Fluo-3/AM
Psedocolor scale indicates fluorescence intensity in arbitrary units ×400
图 2 60 mmol/L KCl 对钙超载大鼠肠系膜血管平滑肌细胞胞浆及核内钙离子荧光强度的影响
Fig 2 Effect of KCl(60 mmol/L) on cytosolic and nuclear Ca2+fluorescence intensity of mesenteric vascular smooth muscle cell from calcium overload rat (Ca-normal buffer)
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1.whole cell; 2.nucleus; 3.cytoplasm; Line:mark of adding KCl
附表 不同药物刺激下两组肠系膜血管平滑肌细胞胞浆及核内游离钙离子荧光强度变化
Table Changes of cytosolic and nuclear Ca2+ fluorescence intensity induced by different
drugs between two groups of mesenteric vascular smooth muscle cell
Group
n
Changes of Ca2+ fluorescence intensity (times)
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Bay-k8644
(10-6 mol/L)
KCl
(60 mmol/L)
IP3
(10-5 mol/L)
CHCl3
(70 mmol/L)
CPA
(1.5×10-5 mol/L)
Ang-Ⅱ
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(10-5 mol/L)
Cytosolic Ca2+
WMV
6
2.07±0.04##
1.84±0.06##
1.34±0.01##
1.47±0.03##
2.34±0.02##
1.67±0.04##
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CaOMV
6
2.20±0.09##**
1.92±0.10##
1.98±0.03##**
1.72±0.02##**
3.83±0.03##**
2.33±0.01##**
Nuclear Ca2+
WMV
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6
3.59±0.01##
2.48±0.04##
2.16±0.02##
2.05±0.01##
3.24±0.01##
1.70±0.04##
CaOMV
6
3.83±0.08##**
, http://www.100md.com
3.63±0.08##**
3.52±0.02##**
3.21±0.08##**
3.97±0.03##**
3.38±0.06##**
##P<0.01 compared with resting condition,**P<0.01 CaOMV vs WMV;CaOMV:mesenteric VSMC of calcium overload rat;WMV:mesenteric VSMC of wistar rat讨 论
钙超载大鼠血管组织钙含量约为对照组的20～40倍，其主要的血管病变及血液动力学改变与人类极为相似，是研究人类增龄过程中血管硬化机制的良好模型[5，9]。但目前对钙超载模型的研究主要集中于胞外改变，对于钙超载大鼠是否同时伴有胞内钙超载，尚不十分清楚。本研究表明，静息态钙超载大鼠VSMC[Ca2+]i及[Ca2+]n与对照组相比并不存在显著性差异；但在激动剂作用下，钙超载大鼠的VSMC反应性较对照组明显增强，[Ca2+]i与[Ca2+]n升高的幅度均明显高于正常大鼠。提示钙超载大鼠VSMC在无刺激时，通过代偿机制，[Ca2+]i与[Ca2+]n尚能维持在正常水平，但实质上已存在胞内钙稳态调节的异常，故在激动剂作用下即表现出来。由此认为在血管硬化和老化过程中，胞内钙超载与胞外钙超载同时并存。
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进一步的分析还可见，在CaOMV无论是质膜上的Ca2+门控系统还是胞内钙池的调节均存在异常。Bay-k8644是VSMC质膜上的L型电压依赖性Ca2+通道(L-VDC)的特异性激动剂，通过刺激Ca2+经L-VDC的内流，在两种VSMC均导致[Ca2+]i和[Ca2+]n的显著升高，且CaOMV组升高的幅度显著高于WMV。KCl诱发的胞内Ca2+浓度升高由两相组成：最初短暂的L-VDC的开放和随后较持久的R型电压依赖性Ca2+通道(R-VDC)的开放[10]，同样CaOMV组升高更显著。这表明在激动剂作用下CaOMV较WMV胞外Ca2+内流明显增加，伴随血管钙超载，VSMC质膜上的Ca2+门控调节出现异常。
IP3和CHCl3分别为VSMC胞内两类不同钙池，即IP3敏感钙池和Ryanodine敏感钙池的激动剂。结果表明，在Ca-F液中IP3、CHCl3可分别通过诱发胞内两类不同钙池的释放，导致[Ca2+]i和[Ca2+]n的显著升高，而且CaOMV组升高的幅度显著高于WMV，提示与WMV相比，CaOMV胞内钙池的调节出现了显著改变。CPA为VSMC胞内钙池质膜上的特异性Ca2+泵(SR-Ca2+-ATPase)抑制剂，在Ca-F液中CPA可明显抑制SR-Ca2+-ATPase活性，阻断Ca2+向胞内钙池的转运，导致[Ca2+]i和[Ca2+]n显著升高，同样CaOMV组升高更明显，即同样剂量的CPA对CaOMV SR-Ca2+-ATPase的活性抑制更显著，提示CaOMV SR-Ca2+-ATPase可能存在异常。
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本实验结果还表明，钙超载时VSMC胞浆及核内Ca2+稳态调节均存在异常。激动剂作用下，CaOMV[Ca2+]i升高的幅度显著高于正常大鼠，导致VSMC对缩血管物质敏感性增高，血管持续收缩，这可能也是钙超载模型外周阻力增高的一个重要因素。[Ca2+]n调控着细胞周期及基因表达，与细胞的增殖及凋亡密切相关[11]。在药物刺激下，钙超载大鼠VSMC[Ca2+]n升高的幅度显著高于正常大鼠，提示CaOMV更易在药物或内源性因子(如Ang-Ⅱ)的诱导下发生凋亡和细胞异常增殖，由此可能在血管增龄和与年龄有关的血管病理进程中的血管壁结构重塑中起着重要作用。
中国医学科学院重点基金资助
张晓春(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所生理室，北京100005)
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徐晓蓉(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所生理室，北京100005)
文允镒(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所生理室，北京100005)
参考文献
[1]Jeffrey A,Pierre P,Jean MC,et al.Vascular calcium overload produced by vitamin D3 plus nicotine diminishes arterial distensibity in rats.Am J Physiol,1994,266:H540-H547
[2]Daniel H,Jean MC,Gaston G,et al.The consequences of aortic calcium overload following vitamin D3 plus nicotine treatment in young rats.J Hypertens,1991,9:919-926
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[3]Lartaud I,Niederhoffer N,Debets JJ,et al.Cardiac function in a rat model of chronic aortic stiffness.Am J Physiol,1997,272:H2218
[4]Carvajal K, Hafidi M,Banos G.Myocardial damage due to ischemia and reperfusion in hypertriglyceridemic and hypertensive rats:participation of free radicals and calcium overload.J Hypertens,1999,17:1607-1616
[5]Stain M.Vascular calcium overload produced by vitamin D3.Cadiovascular Res,1995,30:1038-1043
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[6] Rhian M,Tony Z ,Barbara T,et al.Blunted attenuation of angiotensionⅡ-mediated Ca2+ transsicents by insulin in cultured unpassaged VSMC from spontanious hypertensive rat.Am J Hypertens,1995,8:104-108
[7]Micheal B,Gabriel C,Ernst B,et al.Confocal microscophy to analyze cytosolic and nuclear calcium in cultured vascular cells.Am J Physiol,1995,266:C1118-C1127
[8]Ikeda M,Ariyoshi H,Kambayashi J, et al.Separate analysis of nuclear and cytosolic Ca2+concentrations in human ambilical vein endothelial cells.J Cell Biochem,1996,63:23-36
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[9]Fleekenstein G,Frey M.Calcium overload—an important celluar machanism in hypertension and arteriosclearosis.Drugs,1992,44:23-29
[10]Javors MA,King TS,chang X,et al.Characterization of K+ induced increase in [Ca2+] cyt and GnRH relasein GTl-7 neurons.Brain Res,1995,694:49-54
[11]Hardingham GE,Gruzalegui FH,Chawla S,et al.Mechanisms controlling gene expression by nuclear signals.Cell Calcium,1998,23:131-134, 百拇医药
摘 要 目的 探讨钙超大型载模型大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)胞内是否存在钙离子(Ca2+)稳态调节异常，方法 以Fluo-3/AM作为Ca2+指未剂，应用激光扫描共聚焦显微镜技术，比较钙喜好载模型大鼠肠系膜VSMC(CaOMV)与正常Wistar大鼠肠系膜VSMC(WNV)静息态的胞浆与核内Ca2+水平([Ca2+]i，[Ca2+]n)，以及在多种药物刺激下Ca2+稳态调节的差异.结果 两种VSMC静息态[Ca2+]i及[Ca2+]n并无显著性差异，但在KCl、Vay-k8644、Ang-Ⅱ、IP3、CHCl3和CPA等药物作用下，CaOMV[Ca2+]i与 [Ca2+]n的升高幅度较WMV显著增大(P<0.01).结论 (1)CaOMV对激动剂作用的敏感性增强，存在Ca2+稳态调节异常，提示胞内钙超大型载与胞外钙超载同时共丰，是血管硬化和老化机制的两个方面；(2)血管钙超载时，VSMC无论质膜上的Ca2+门控系统还是胞内钙池的释放与重储均有异常；(3)在CaOMV，胞浆与核内钙的调节均存在异常.
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关键词：钙超载Fluo-3/M 肠系膜血管平滑肌细胞钙离子稳态调节胞浆Ca2+核内Ca2+
在人类自然的血管增龄过程中和与年龄相关的血管病理进程中，产生多种血管床结构的变化，其中最显著的是血管钙超载[1，2]。广义的血管钙超载包括两个方面：细胞外超载和细胞内超载，前者指钙在弹力层的沉积，后者则指血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)胞内钙稳态的异常。许多学者认为胞内钙超载与胞外钙超载相伴发生[3，4]，但目前直接的实验证据尚较少。给正常大鼠以维生素D3(Vit D3)同时辅以照射紫外线或口服尼古丁处理，可以较快地建立钙超载模型[1]。由于胞外钙超载最显著的部位是肠系膜血管，故本研究以培养的钙超载模型大鼠和正常Wistar大鼠的肠系膜VSMC为研究对象进行观察，以探讨血管增龄进程中胞内钙超载是否与胞外钙超载并存。
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材料和方法
实验动物 雄性Wistar 大鼠40只，体重180～220 g,年龄为2月龄，随机分为钙超载组和正常对照组。
主要试剂 Vit D3为Merck 公司产品，胎牛血清和DMEM为Gibico公司产品，胰蛋白酶、胶原酶、1，4，5-三磷酸肌醇(inositol-1，4，5-trisphosphate,IP3)、cyclopiazonic acid (CPA)、血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)、Bay-k8644为Sigma 公司产品，acetoxymenthyl esters of fluo-3 (Fluo-3/AM)为Moleculluar Probes公司产品。
主要溶液的配制 (1) 无钙液(Ca-Free,Ca-F):D-Hand's液加入1.00 g/L葡萄糖；(2) 含钙液(Ca-Normal,Ca-N):D-Hand's液中加入1.00 g/L葡萄糖，0.14 g/L CaCl2；(3) DMEM液：DMEM培养基10.0 g溶于950 ml去离子水中，-20℃保存；(4) 消化液：将100 mg胶原酶，100 mg小牛血清白蛋白，1.6 g胰蛋白酶，5 mg链霉素，5000 U青霉素，加至50 ml DMEM中，用孔径为0.22 μm的滤膜过滤。
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钙超载模型的建立 参照文献[1，5]方法，给Wistar大鼠腹腔注射3×106 U/kg Vit D3，于给药后的第2、7、12天进行紫外线照射，每次20 min。在给药后第16天断头处死动物，作细胞培养。
原代培养肠系膜血管平滑肌细胞 参照文献[6]方法，将大鼠断头处死，分离肠系膜动脉 ，于37℃消化，镜下见大量圆形厚壁细胞时终止消化，以100目细胞筛过滤，滤液离心后加入原代培养基，转入培养瓶中于37 ℃，含5%CO2和95%空气的孵箱内孵育。3～5 d后细胞基本汇合，即可传代培养。钙超载组在加入原代培养基后直接转入35 mm塑料培养皿培养，待细胞贴壁后直接负载。
激光扫描共聚焦显微镜观察不同药物作用下VSMC[Ca2+]i和 [Ca2+]n的变化 参照文献[7，8]的方法。 (1) 实验对象：钙超载模型组大鼠肠系膜VSMC (CaOMV)，实验采用原代细胞；正常对照组大鼠肠系膜VSMC(WMV)，实验采用1～3代细胞；(2)负载：将VSMC接种于35 mm塑料培养皿，继续培养24 h，弃培养基，以D-Hank′s 液洗2次，然后以含3 ng/ml Fluo-3/AM的DMEM营养液1 ml负载细胞，37 ℃避光30 min后，吸去负载液，用D-Hank′s 液洗2次，即可进行扫描分析；(3) 测定方法：在细胞外液含钙离子的条件下分别以60 mmol/L KCl、10-6 mol/L Bay-k8644和10-5 mol/L Ang-Ⅱ刺激前述两种VSMC，主要观察细胞膜门控系统的反应。在不含钙离子的条件下，分别加入10-5 mol/L IP3、70 mmol/L CHCl3及1.5×10-5 mol/L CPA，观察胞内与核内钙池的释放。具体测定步骤：加药之前先扫描数次，记录细胞静息态胞浆和核内游离Ca2+荧光强度。随后加入1种药物刺激，连续记录荧光强度的变化，并以达到的最大荧光强度代表该药物的作用，进行组间比较。荧光强度与游离Ca2+浓度成正比，从而反映胞浆及核内游离Ca2+浓度([Ca2+]i，[Ca2+]n)的变化；
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(4) 共聚焦显微镜的测定参数：负载后细胞在ACAS MeridianTM Ultima 212型激光扫描共聚焦显微镜下进行测定，具体参数为激光强度420 mW，扫描强度22%，步长0.5 μm，针孔孔径400 μm。
统计学处理 各组实验数据以平均值±标准误(x±s)表示，组间差异的显著性检验采用t检验。
结 果
钙超载对VSMC静息态[Ca2+]i和[Ca2+]n的影响 与WMV相比，CaOMV静息态胞浆及核内游离Ca2+荧光强度无明显升高，前者分别为(241.25±32.90)和(739.33±131.93)AU，后者分别为(291.92±30.55)和(635.08±88.51)AU，两者比较差异无显著性(P>0.05，n=20)。
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钙超载对VSMC胞浆及核内Ca2+稳态调节的影响 激光扫描共聚焦显微镜下可见，负载后的VSMC轮廓清晰，核区与胞浆界限分明(图1)。在Ca-N液中，以KCl、Bay-k8644和Ang-Ⅱ刺激两种VSMC，均导致胞浆及核内 Ca2+荧光强度迅速升高，与静息态比较，差异具有显著性(P<0.01)。达到峰值后，荧光强度又逐渐降低回至静息水平(图2)，且CaOMV组[Ca2+]i和[Ca2+]n升高的幅度均显著高于WMV组(附表)。在Ca-F液中，IP3、CHCl3及CPA均导致VSMC[Ca2+]i和[Ca2+]n显著升高，而且CaOMV组升高的幅度显著高于WMV (P<0.01，附表)。
图 1 激光扫描共聚焦显微镜下以Fluo-3/AM负载的钙超载大鼠肠系膜血管平滑肌细胞
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Fig 1 Image of mesenteric vascular smooth muscle cell from calcium overload rat load with Fluo-3/AM
Psedocolor scale indicates fluorescence intensity in arbitrary units ×400
图 2 60 mmol/L KCl 对钙超载大鼠肠系膜血管平滑肌细胞胞浆及核内钙离子荧光强度的影响
Fig 2 Effect of KCl(60 mmol/L) on cytosolic and nuclear Ca2+fluorescence intensity of mesenteric vascular smooth muscle cell from calcium overload rat (Ca-normal buffer)
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1.whole cell; 2.nucleus; 3.cytoplasm; Line:mark of adding KCl
附表 不同药物刺激下两组肠系膜血管平滑肌细胞胞浆及核内游离钙离子荧光强度变化
Table Changes of cytosolic and nuclear Ca2+ fluorescence intensity induced by different
drugs between two groups of mesenteric vascular smooth muscle cell
Group
n
Changes of Ca2+ fluorescence intensity (times)
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Bay-k8644
(10-6 mol/L)
KCl
(60 mmol/L)
IP3
(10-5 mol/L)
CHCl3
(70 mmol/L)
CPA
(1.5×10-5 mol/L)
Ang-Ⅱ
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(10-5 mol/L)
Cytosolic Ca2+
WMV
6
2.07±0.04##
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1.47±0.03##
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1.67±0.04##
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CaOMV
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2.20±0.09##**
1.92±0.10##
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1.72±0.02##**
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2.33±0.01##**
Nuclear Ca2+
WMV
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3.59±0.01##
2.48±0.04##
2.16±0.02##
2.05±0.01##
3.24±0.01##
1.70±0.04##
CaOMV
6
3.83±0.08##**
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3.63±0.08##**
3.52±0.02##**
3.21±0.08##**
3.97±0.03##**
3.38±0.06##**
##P<0.01 compared with resting condition,**P<0.01 CaOMV vs WMV;CaOMV:mesenteric VSMC of calcium overload rat;WMV:mesenteric VSMC of wistar rat讨 论
钙超载大鼠血管组织钙含量约为对照组的20～40倍，其主要的血管病变及血液动力学改变与人类极为相似，是研究人类增龄过程中血管硬化机制的良好模型[5，9]。但目前对钙超载模型的研究主要集中于胞外改变，对于钙超载大鼠是否同时伴有胞内钙超载，尚不十分清楚。本研究表明，静息态钙超载大鼠VSMC[Ca2+]i及[Ca2+]n与对照组相比并不存在显著性差异；但在激动剂作用下，钙超载大鼠的VSMC反应性较对照组明显增强，[Ca2+]i与[Ca2+]n升高的幅度均明显高于正常大鼠。提示钙超载大鼠VSMC在无刺激时，通过代偿机制，[Ca2+]i与[Ca2+]n尚能维持在正常水平，但实质上已存在胞内钙稳态调节的异常，故在激动剂作用下即表现出来。由此认为在血管硬化和老化过程中，胞内钙超载与胞外钙超载同时并存。
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进一步的分析还可见，在CaOMV无论是质膜上的Ca2+门控系统还是胞内钙池的调节均存在异常。Bay-k8644是VSMC质膜上的L型电压依赖性Ca2+通道(L-VDC)的特异性激动剂，通过刺激Ca2+经L-VDC的内流，在两种VSMC均导致[Ca2+]i和[Ca2+]n的显著升高，且CaOMV组升高的幅度显著高于WMV。KCl诱发的胞内Ca2+浓度升高由两相组成：最初短暂的L-VDC的开放和随后较持久的R型电压依赖性Ca2+通道(R-VDC)的开放[10]，同样CaOMV组升高更显著。这表明在激动剂作用下CaOMV较WMV胞外Ca2+内流明显增加，伴随血管钙超载，VSMC质膜上的Ca2+门控调节出现异常。
IP3和CHCl3分别为VSMC胞内两类不同钙池，即IP3敏感钙池和Ryanodine敏感钙池的激动剂。结果表明，在Ca-F液中IP3、CHCl3可分别通过诱发胞内两类不同钙池的释放，导致[Ca2+]i和[Ca2+]n的显著升高，而且CaOMV组升高的幅度显著高于WMV，提示与WMV相比，CaOMV胞内钙池的调节出现了显著改变。CPA为VSMC胞内钙池质膜上的特异性Ca2+泵(SR-Ca2+-ATPase)抑制剂，在Ca-F液中CPA可明显抑制SR-Ca2+-ATPase活性，阻断Ca2+向胞内钙池的转运，导致[Ca2+]i和[Ca2+]n显著升高，同样CaOMV组升高更明显，即同样剂量的CPA对CaOMV SR-Ca2+-ATPase的活性抑制更显著，提示CaOMV SR-Ca2+-ATPase可能存在异常。
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本实验结果还表明，钙超载时VSMC胞浆及核内Ca2+稳态调节均存在异常。激动剂作用下，CaOMV[Ca2+]i升高的幅度显著高于正常大鼠，导致VSMC对缩血管物质敏感性增高，血管持续收缩，这可能也是钙超载模型外周阻力增高的一个重要因素。[Ca2+]n调控着细胞周期及基因表达，与细胞的增殖及凋亡密切相关[11]。在药物刺激下，钙超载大鼠VSMC[Ca2+]n升高的幅度显著高于正常大鼠，提示CaOMV更易在药物或内源性因子(如Ang-Ⅱ)的诱导下发生凋亡和细胞异常增殖，由此可能在血管增龄和与年龄有关的血管病理进程中的血管壁结构重塑中起着重要作用。
中国医学科学院重点基金资助
张晓春(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所生理室，北京100005)
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徐晓蓉(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所生理室，北京100005)
文允镒(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所生理室，北京100005)
参考文献
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