氨甲酰胆碱对子宫平滑肌内三磷酸肌醇水平的影响
作者：尚涛 魏敏杰
单位：尚涛(110001 沈阳，中国医科大学第二临床医院妇产科)；魏敏杰(基础医学院药理教研室)
关键词：
中华医学杂志000917 子宫平滑肌细胞膜毒蕈碱受体(muscarinic acetylcholine receptor，M受体)激动后引起人子宫平滑肌细胞(HMC)收缩等作用已明确，其收缩作用及机制的研究已引起相关学者的关注。有关M受体激动剂氨甲酰胆碱(CCh)增加细胞内三磷酸肌醇(IP3)合成的作用，在大鼠及豚鼠子宫平滑肌细胞已有报道，但对人子宫平滑肌的作用及与未妊娠时的异同等研究尚少见报道。我们通过检测HMC内IP3水平，并比较妊娠与未妊娠的异同，以探讨M受体及亚型在调节IP3生成中的作用。
一、对象与方法
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1.对象：未妊娠子宫平肌组织取自本院7例38～41岁子宫肌瘤患者手术切除的子宫峡部非瘤体组织；妊娠子宫平滑肌组织取自本院7例足月妊娠38～40孕周的产妇(均行剖腹产手术)。
2.方法：(1)试剂：3H-IP3测试系统，CCh、阿托品(Atr)、哌仑西平(PZ)及HEPES购自美国Sigma公司，其他为市售分析纯试剂。(2)标本切取方法：取标本时沿手术切口边缘的子宫峡部上缘平行于切口取10 mm×30 mm的肌条。(3)标本处理：按照Pijuan V等[1]实验方法，在冰浴下迅速将子宫平滑肌切成12 mm×2 mm×2 mm的肌条，将制备好的标本放入盛有2 ml Hank液的试管中，试管置于37℃恒温振荡水域，向试管内加入终浓度25 mmol/L的LiCl稳定1 h后，向Atr预处理管中加入10 μmol/L的Atr，向PZ预处理管加入10 μmol/L的PZ，作用10 min后，连同对照组一起分别加入10 μmol/L的CCh，反应分别于0、1、3、5和10 min时用液氮终止，-70℃保存。测IP3前将上述冷冻保存的标本，于0℃下机械研磨成粉末，再加入体积分数为15%冰乙酸2 ml，旋涡震荡器充分混匀，静置5 min后，离心(500 r/min，40 min，4℃，Lowry法测定蛋白含量)，然后取上清1 ml，加入3 ml水饱和乙酸，充分混匀，离心(500 r/min，10 min，4℃)，弃上层油相，再加入水饱和乙酸，离心重复3次后，下层水相用2 mol/L的NaHCO3调节pH为7.5后-20℃保存。以备测定IP3用。(4)IP3测定：按照3H-IP3测试系统操作要求进行。加样后置于含10 ml闪烁液的液闪瓶中暗化过夜，用Backman液闪仪测放射活性，记录cpm值。
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3.统计学处理：实验数据以±s表示，组间差异检验采用t检验。
二、结果
1.CCh升高IP3的作用：基础状态下未妊娠与妊娠子宫峡部平滑肌中的IP3含量分别为93 nmol/g蛋白±12 nmol/g蛋白和116 nmol/g蛋白±20 nmol/g蛋白，两者比较P<0.05，t=2.99。10 μmol/L CCh使未妊娠与妊娠子宫峡部平滑肌IP3合成均增加，在CCh作用5 min时促IP3合成达高峰，分别为159 nmol/g蛋白±30 nmol/g蛋白和191 nmol/g蛋白±37 nmol/g蛋白，两者比较t=3.02，P<0.05，但IP3增高的百分数无统计学意义(P>0.05)。
2.Atr和PZ对CCh升高IP3的影响：10 μmol/L Atr可明显抑制10 μmol/L CCh升高IP3的作用，但10 μmol/L的PZ则对CCh促IP3生成作用无明显影响。Atr和PZ对CCh作用的影响见表1。
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表1 阿托品和哌仑西平对氨甲酰胆碱升高
三磷酸肌醇作用的影响(nmol/g蛋白，±s) 组别
例数
三磷酸肌醇水平
未妊娠
妊娠
对照组
7
93±12
116±20△
CCh组
7
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159±30*
191±37**△△
Atr+CCh组
7
108±24▲
130±31▲
PZ+CCh组
7
154±36*
187±40**
注：本实验为10 μmol/L的氨甲酰胆碱孵育5 min；与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与未妊娠组比较△P<0.05，△△P<0.01；与CCh组比较▲P<0.01 三、讨论
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平滑肌收缩与细胞内游离Ca2+浓度密切相关，IP3是促进细胞内钙释放的重要第二信使[2，3]。在豚鼠的子宫平滑肌，其M受体激动后，可使细胞内IP3水平升高，通过IP3作用于SR上的IP3受体，使细胞内Ca2+从钙库中释放增加，从而激活Ca2+依赖性钙调蛋白的肌球蛋白轻链激酶，使其磷酸化，引起子宫平滑肌收缩[4]。表明IP3在子宫平滑肌某些膜受体兴奋引起游离Ca2+增加信号转导的过程，同样起着重要作用。因此，准确、特异地检测细胞内IP3生成量是阐明膜磷脂代谢及游离Ca2+调节机制的重要指标。本研究结果表明，基础状态下妊娠子宫平滑肌IP3的含量高于未妊娠时的水平，CCh可使人子宫峡部平滑肌细胞内IP3升高，虽然未妊娠与妊娠相比IP3水平增高百分数差异无显著意义，但由于基础状态时妊娠子宫峡部平滑肌IP3水平高于未妊娠时，所以，CCh作用后妊娠子宫峡部平滑肌IP3水平仍高于未妊娠时。此外，M受体阻断剂Atr可拮抗CCh促进IP3生成作用，但M1受体阻断剂PZ则不能拮抗CCh促进IP3生成作用，说明CCh激动M受体后可使子宫平滑肌细胞内合成IP3作用增加，但不是由于激动M1受体所致。有关M受体亚型在升高IP3以及游离Ca2+水平的作用，将在今后的研究中继续探讨。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600178)
参考文献
1，Pijuan V, Litosch I. Norepinephrine stimulates the production of inostol trisphate and inositol tetrakisphosphate in rat aorta. Biochem Biophys Res Commu, 1988,156：240-245.
2，C.Randriamampita, R.Y.Tsien. Emptying of intracellular Ca2+ stores rileases a novel small messenger that stimulates Ca2+ influx. Nature, 1993,364：809-814.
3，M.J.Berridge. Inositol Triphosphate and Calcium Signaling. Nature, 1993,361：315-325.
4，Marcs DL, Leiber D, Harbon S, Carbachol and oxytocin stimulate the generation lf inositol phosphates in the guinea pig myometrium. FEBS Lett, 1986,201：9-14.
(收稿日期：1999-11-02), 百拇医药
单位：尚涛(110001 沈阳，中国医科大学第二临床医院妇产科)；魏敏杰(基础医学院药理教研室)
关键词：
中华医学杂志000917 子宫平滑肌细胞膜毒蕈碱受体(muscarinic acetylcholine receptor，M受体)激动后引起人子宫平滑肌细胞(HMC)收缩等作用已明确，其收缩作用及机制的研究已引起相关学者的关注。有关M受体激动剂氨甲酰胆碱(CCh)增加细胞内三磷酸肌醇(IP3)合成的作用，在大鼠及豚鼠子宫平滑肌细胞已有报道，但对人子宫平滑肌的作用及与未妊娠时的异同等研究尚少见报道。我们通过检测HMC内IP3水平，并比较妊娠与未妊娠的异同，以探讨M受体及亚型在调节IP3生成中的作用。
一、对象与方法
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1.对象：未妊娠子宫平肌组织取自本院7例38～41岁子宫肌瘤患者手术切除的子宫峡部非瘤体组织；妊娠子宫平滑肌组织取自本院7例足月妊娠38～40孕周的产妇(均行剖腹产手术)。
2.方法：(1)试剂：3H-IP3测试系统，CCh、阿托品(Atr)、哌仑西平(PZ)及HEPES购自美国Sigma公司，其他为市售分析纯试剂。(2)标本切取方法：取标本时沿手术切口边缘的子宫峡部上缘平行于切口取10 mm×30 mm的肌条。(3)标本处理：按照Pijuan V等[1]实验方法，在冰浴下迅速将子宫平滑肌切成12 mm×2 mm×2 mm的肌条，将制备好的标本放入盛有2 ml Hank液的试管中，试管置于37℃恒温振荡水域，向试管内加入终浓度25 mmol/L的LiCl稳定1 h后，向Atr预处理管中加入10 μmol/L的Atr，向PZ预处理管加入10 μmol/L的PZ，作用10 min后，连同对照组一起分别加入10 μmol/L的CCh，反应分别于0、1、3、5和10 min时用液氮终止，-70℃保存。测IP3前将上述冷冻保存的标本，于0℃下机械研磨成粉末，再加入体积分数为15%冰乙酸2 ml，旋涡震荡器充分混匀，静置5 min后，离心(500 r/min，40 min，4℃，Lowry法测定蛋白含量)，然后取上清1 ml，加入3 ml水饱和乙酸，充分混匀，离心(500 r/min，10 min，4℃)，弃上层油相，再加入水饱和乙酸，离心重复3次后，下层水相用2 mol/L的NaHCO3调节pH为7.5后-20℃保存。以备测定IP3用。(4)IP3测定：按照3H-IP3测试系统操作要求进行。加样后置于含10 ml闪烁液的液闪瓶中暗化过夜，用Backman液闪仪测放射活性，记录cpm值。
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3.统计学处理：实验数据以±s表示，组间差异检验采用t检验。
二、结果
1.CCh升高IP3的作用：基础状态下未妊娠与妊娠子宫峡部平滑肌中的IP3含量分别为93 nmol/g蛋白±12 nmol/g蛋白和116 nmol/g蛋白±20 nmol/g蛋白，两者比较P<0.05，t=2.99。10 μmol/L CCh使未妊娠与妊娠子宫峡部平滑肌IP3合成均增加，在CCh作用5 min时促IP3合成达高峰，分别为159 nmol/g蛋白±30 nmol/g蛋白和191 nmol/g蛋白±37 nmol/g蛋白，两者比较t=3.02，P<0.05，但IP3增高的百分数无统计学意义(P>0.05)。
2.Atr和PZ对CCh升高IP3的影响：10 μmol/L Atr可明显抑制10 μmol/L CCh升高IP3的作用，但10 μmol/L的PZ则对CCh促IP3生成作用无明显影响。Atr和PZ对CCh作用的影响见表1。
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表1 阿托品和哌仑西平对氨甲酰胆碱升高
三磷酸肌醇作用的影响(nmol/g蛋白，±s) 组别
例数
三磷酸肌醇水平
未妊娠
妊娠
对照组
7
93±12
116±20△
CCh组
7
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159±30*
191±37**△△
Atr+CCh组
7
108±24▲
130±31▲
PZ+CCh组
7
154±36*
187±40**
注：本实验为10 μmol/L的氨甲酰胆碱孵育5 min；与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与未妊娠组比较△P<0.05，△△P<0.01；与CCh组比较▲P<0.01 三、讨论
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平滑肌收缩与细胞内游离Ca2+浓度密切相关，IP3是促进细胞内钙释放的重要第二信使[2，3]。在豚鼠的子宫平滑肌，其M受体激动后，可使细胞内IP3水平升高，通过IP3作用于SR上的IP3受体，使细胞内Ca2+从钙库中释放增加，从而激活Ca2+依赖性钙调蛋白的肌球蛋白轻链激酶，使其磷酸化，引起子宫平滑肌收缩[4]。表明IP3在子宫平滑肌某些膜受体兴奋引起游离Ca2+增加信号转导的过程，同样起着重要作用。因此，准确、特异地检测细胞内IP3生成量是阐明膜磷脂代谢及游离Ca2+调节机制的重要指标。本研究结果表明，基础状态下妊娠子宫平滑肌IP3的含量高于未妊娠时的水平，CCh可使人子宫峡部平滑肌细胞内IP3升高，虽然未妊娠与妊娠相比IP3水平增高百分数差异无显著意义，但由于基础状态时妊娠子宫峡部平滑肌IP3水平高于未妊娠时，所以，CCh作用后妊娠子宫峡部平滑肌IP3水平仍高于未妊娠时。此外，M受体阻断剂Atr可拮抗CCh促进IP3生成作用，但M1受体阻断剂PZ则不能拮抗CCh促进IP3生成作用，说明CCh激动M受体后可使子宫平滑肌细胞内合成IP3作用增加，但不是由于激动M1受体所致。有关M受体亚型在升高IP3以及游离Ca2+水平的作用，将在今后的研究中继续探讨。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600178)
参考文献
1，Pijuan V, Litosch I. Norepinephrine stimulates the production of inostol trisphate and inositol tetrakisphosphate in rat aorta. Biochem Biophys Res Commu, 1988,156：240-245.
2，C.Randriamampita, R.Y.Tsien. Emptying of intracellular Ca2+ stores rileases a novel small messenger that stimulates Ca2+ influx. Nature, 1993,364：809-814.
3，M.J.Berridge. Inositol Triphosphate and Calcium Signaling. Nature, 1993,361：315-325.
4，Marcs DL, Leiber D, Harbon S, Carbachol and oxytocin stimulate the generation lf inositol phosphates in the guinea pig myometrium. FEBS Lett, 1986,201：9-14.
(收稿日期：1999-11-02), 百拇医药