克班宁对耐药细胞K562/HHT逆转作用的研究
赵春景 史曦凯
摘 要 目的 对克班宁(CRE)逆转白血病耐药细胞系K562/HHT的耐药性进行研究。方法 细胞毒试验采用MTT法，细胞内柔红霉素(DNR)积累采用荧光分光光度法测定。结果 克班宁5 μmol.L-1时显著增加高三尖杉酯碱(HHT)对K562/HHT的细胞毒，细胞毒作用增强13.0倍，同等条件下8 μmol.L-1 维拉帕米为19.4倍。克班宁能显著增加K562/HHT细胞内DNR浓度。结论 克班宁通过增加多药耐药细胞内药物积累而调节多药耐药性。
关键词：克班宁 维拉帕米 培养的肿瘤细胞 多药耐药性
多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因之一，涉及多种结构和功能不同的药物，包括蒽环类、长春碱类、表鬼臼毒素类等。MDR的原因与肿瘤细胞膜上的P-糖蛋白(P-gp)的高表达有关。P-gp为一能量依赖的单向药物外排泵，可以将进入细胞内的药物排出细胞外，引起细胞内药物积聚减少，是MDR的主要原因。很多化合物体外能增加MDR细胞内药物蓄积，最早揭示维拉帕米和环孢霉素A能逆转MDR，不过它们的心脏毒性或免疫抑制作用，限制了其临床应用，寻找毒性小作用强的MDR逆转剂有重要意义。中草药有着丰富资源，已发现双苄基异喹啉类生物碱千金藤碱[1]、轮环藤碱、海南轮环藤碱[2]、粉防已碱[3]、阿朴菲型异喹啉生物碱thaliblastine[4 ]均表现了一定的逆转肿瘤细胞耐药的作用。同类阿朴菲型异喹啉类生物碱克班宁(creba nine)具有镇痛镇静[5]，抗心律失常[6]，松驰平滑肌[7]等作用 ，体外有极弱的抗肿瘤活性[8]。本文对其逆转多药耐药细胞系K562/HHT的耐药性 进行了初步研究。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 K 562，K 562/HHT 均由中国医学科学院天津血液研究所提供，K 562细胞P-gp表达阴性，K 562/HHT系通过逐渐递增高三尖杉酯碱(HHT)剂量的方法克隆获得的耐药细胞株， P-gp表达阳性[9]。
1.1.2 药物及试剂 柔红霉素(DNR)(意大利Farmitalia Carlo Erba公司)；克班宁(crebanine,CRE)由云南中医学院药学系提供 ，溶于1 mol.L-1盐酸后，用1 mol.L-1NaOH调至pH 6左右，高温灭菌，培养 液稀释成不同浓度备用；MTT(Sigma)；维拉帕米(VER)(德国Knoll公司)；二甲亚砜(DMSO)( 分析纯，上海化学试剂厂)。
, 百拇医药
1.1.3 主要仪器 酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)；荧光分光光度计(Hitachi F3010型)；超声破碎仪(无锡超声电子仪器 厂，H6025)。
1.2 方法
1.2.1 细胞毒试验 取对数生长期K 562和K 562/HHT细胞接种于96孔培养板(细胞数为5×104.well-1，100 μl.wel l-1)，加入相应浓度的用细胞培养液配制的柔红霉素，克班宁或维拉帕米，每孔终体积为200 μl ，5% CO2孵箱中培养72 h后，每孔加入MTT溶液(5 g.L-1)20 μl ，继续培养4 h后，离心(1 000 r.min-1,5 min)，弃去孔内培养液， 每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使其充分溶解，酶联免疫检测仪540 nm波长处测定光 吸收度A值。细胞存活率=(药物组光吸收A值/无药组光吸收A值) ×100%。
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1.2.2 DNR的蓄积 按文献[10]进行，采用荧光分光光度法。
1.2.3 统计处理 细胞毒试验结果取3次实验的均值，组间显著性检验采用医学统计软件POMS-17处理，半抑制浓度IC50采用医学统计软件POMS-36处理。
耐药倍数=耐药株IC50/敏感株IC50
逆转倍数=耐药株IC50/耐药株加逆转剂时IC50
2 结果
2.1 克班宁对HHT细胞毒的影响 克班宁对K 562及K 562/HHT的细胞毒作用较弱，克班宁20 μmol.L-1 时抑制率为23.40%和21.76%，5 μmol.L-1时为14.8%和8.6%。维拉帕米8 μmol.L-1时对K 562和K 562/HHT细胞存活率几无影响。HHT单用及与维拉帕米或克班宁 合用对K 562，K 562/HHT的杀伤效应见表1、2、3，产生半数杀伤作用HHT浓度IC50见表4。统计处理表明克班宁及维拉帕米与HHT合用对敏感株K 562的影响与单用HHT时变化不大 ，而对耐药株K 562/HHT的影响有显著变化，合用逆转剂产生杀伤作用的浓度明显降低。克班宁组和维拉帕米组对K 562/HHT的杀伤作用差性无显著性。
, 百拇医药
Tab 1 Effect of drugs on the surviving rate(%) of K 562 cells
Concentration of HHT/mg.L-1
2
4
6
8
10
HHT
80.7±2.5
74.3±2.4
48.7±2.1
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16.7±2.6
2.3±1.5
8 μmol.L-1
VER+HHT
73±4.1
59±3.2
44±2.6
17±1.9
3.0±1.4
5 μmol.L-1
CRE+HHT
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82±4.6
76±3.7
50±2.1
18±1.67
3.0±1.4
n=3 experiments(each 6 wells)Tab 2 Effect of homoharringtonine(HHT) on
the surviving rate(%) of K 562/HHT cells
Concentration of HHT/mg.L-1
Surviving rate/%
, 百拇医药
200
81.7±3.5
400
70.3±2.5
600
37.7±3.0
800
18.0±4.2
1000
3.3±1.6
n=3 experiments(each 6 wells)Tab 3 Effect of drugs on the surviving
, 百拇医药
rate(%) of K 562/HHT cells
Concentration of HHT/mg.L-1
20
40
60
80
100
120
8 μmol.L-1
VER+HHT
52±3.6
, 百拇医药
41±3.2
29±3.7
22±2.6
20±3.0
16±2.2
5 μmol.L-1
CRE+HHT
64±3.4
49±2.9
33±3.3
26±2.4
22±2.8
, 百拇医药
17±2.0
n=3 experiments(each 6 wells)Tab 4 Effect of crebanine on the reversing fold
of K 562/HHT cells to homoharringtonine(HHT)
IC50 of HHT/mg.L-1
Reversing fold
Control
447.72±12.34
0
8 μmol.L-1VER
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23.11±0.95
19.4
5 μmol.L-1CRE
34.40±1.72
13.0
2.2 克班宁对DNR在耐药株K 562/HHT细胞内蓄积的影响 从表5可见，在0.2 μmol.L-1柔红霉素作用下，克班宁可以使耐药株K562/HHT摄取柔红霉素量增加。虽不能使其蓄积水平达到敏感株水平，但仍显示了逆转剂克班宁具有较强的抑制耐药株外排药物的作用。
Tab 5 Effect of crebanine on intracellular DNR accumulation
, 百拇医药
in K562/HHT cells(ng/5×105 cells)to 0.2 μmol.L-1
DN R in different time(min)
30
40
90
120
K562
61.10
69.13
86.03
96.88
, 百拇医药
K562/HHT
16.88
19.83
20.16
22.85
5 μmol.L-1
CRE+K562/HHT
40.27
57.36
60.42
73.54
n=2 experiments3 讨论
, 百拇医药
K 562/HHT为mdr-1基因表达增高，其基因表达产物P-gp增加的多药耐药细胞株[9] 。P-gp糖蛋白是一种能量泵，可主动将细胞内药物泵出，从而使细胞内药物减少，产生 多种药物的耐药性。大量研究已表明，钙离子拮抗剂通过竞争性抑制P-gp的外排功能而逆转MDR。克班宁是钙拮抗活性较弱的钙拮抗剂，它能阻断电位依赖性Ca2+通道，抑制组织胺引起的钙释放。本研究中发现克班宁能增强高三尖杉酯碱对耐药株K 562/HHT的杀伤作用，其增强作用不及维拉帕米，而对敏感株K 562影响均不明显。通过测定细胞内柔红霉素含量作为细胞内药物蓄积和外排的指标，发现克班宁显著增加K 562/HHT细胞株内柔红霉素蓄积量，但仍不能完全达到敏感株细胞内蓄积量。基于上述结果，认为克班宁和其它钙离 子通道拮抗剂一样，通过抑制P-gp功能而达到逆转作用，可能是其主要机制。克班宁未能 使K 562/HHT细胞内DNR浓度上升至K 562敏感株水平，即未能完全逆转MDR，可能是因K 562/ HHT细胞还存在其它耐药机制。K 562/HHT有GST-α，GST-π基因表达水平提高，其中GST -π增强对自然来源的抗肿瘤药物产生的耐药性有一定作用，但GST-π总活性没有明显改 变，GST-π不是K 562/HHT细胞MDR的主要机制[9]。克班宁在云南千金藤中含量较 高，提取方法简便，对该药作进一步研究是有意义的。
, 百拇医药
*重庆市科委1998年度应用基础基金资助项目
作者简介：赵春景，男，35岁，博士，1998年获首届中国药师杰出新秀奖
赵春景(重庆医科大学附属二院药剂科，重庆 400038)
史曦凯(第三军医大学西南医院药理基地，重庆 400038)
参考文献
1，Shiraishi N, Akiyama S, Nakagawa M et al. Effect of bisbenzylisoquinoline alkaloids on multidrug resistance in KB human cancer cells. Cancer Res， 1987;47:2413～6
, 百拇医药
2，田 晖，潘启超.三种双苄基异喹啉类生物碱调节多药耐药性的作用及与维拉帕米的比较.中国药理学报，1997;18(5):455～8
3，Pan QC, Tian H. Reversal of multidrug resistance by various principles from Chinese herbal medicine. Clin Sci Bull，1996;41:410～4
4，Chen G, Ramachandran C， Krishan A. Thaliblastine,a plant alkaloid, circumvents multidrug resistance by direct binding to P-glycoprotein.Cancer Res，1993;53:2544～7, 百拇医药
摘 要 目的 对克班宁(CRE)逆转白血病耐药细胞系K562/HHT的耐药性进行研究。方法 细胞毒试验采用MTT法，细胞内柔红霉素(DNR)积累采用荧光分光光度法测定。结果 克班宁5 μmol.L-1时显著增加高三尖杉酯碱(HHT)对K562/HHT的细胞毒，细胞毒作用增强13.0倍，同等条件下8 μmol.L-1 维拉帕米为19.4倍。克班宁能显著增加K562/HHT细胞内DNR浓度。结论 克班宁通过增加多药耐药细胞内药物积累而调节多药耐药性。
关键词：克班宁 维拉帕米 培养的肿瘤细胞 多药耐药性
多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因之一，涉及多种结构和功能不同的药物，包括蒽环类、长春碱类、表鬼臼毒素类等。MDR的原因与肿瘤细胞膜上的P-糖蛋白(P-gp)的高表达有关。P-gp为一能量依赖的单向药物外排泵，可以将进入细胞内的药物排出细胞外，引起细胞内药物积聚减少，是MDR的主要原因。很多化合物体外能增加MDR细胞内药物蓄积，最早揭示维拉帕米和环孢霉素A能逆转MDR，不过它们的心脏毒性或免疫抑制作用，限制了其临床应用，寻找毒性小作用强的MDR逆转剂有重要意义。中草药有着丰富资源，已发现双苄基异喹啉类生物碱千金藤碱[1]、轮环藤碱、海南轮环藤碱[2]、粉防已碱[3]、阿朴菲型异喹啉生物碱thaliblastine[4 ]均表现了一定的逆转肿瘤细胞耐药的作用。同类阿朴菲型异喹啉类生物碱克班宁(creba nine)具有镇痛镇静[5]，抗心律失常[6]，松驰平滑肌[7]等作用 ，体外有极弱的抗肿瘤活性[8]。本文对其逆转多药耐药细胞系K562/HHT的耐药性 进行了初步研究。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 K 562，K 562/HHT 均由中国医学科学院天津血液研究所提供，K 562细胞P-gp表达阴性，K 562/HHT系通过逐渐递增高三尖杉酯碱(HHT)剂量的方法克隆获得的耐药细胞株， P-gp表达阳性[9]。
1.1.2 药物及试剂 柔红霉素(DNR)(意大利Farmitalia Carlo Erba公司)；克班宁(crebanine,CRE)由云南中医学院药学系提供 ，溶于1 mol.L-1盐酸后，用1 mol.L-1NaOH调至pH 6左右，高温灭菌，培养 液稀释成不同浓度备用；MTT(Sigma)；维拉帕米(VER)(德国Knoll公司)；二甲亚砜(DMSO)( 分析纯，上海化学试剂厂)。
, 百拇医药
1.1.3 主要仪器 酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)；荧光分光光度计(Hitachi F3010型)；超声破碎仪(无锡超声电子仪器 厂，H6025)。
1.2 方法
1.2.1 细胞毒试验 取对数生长期K 562和K 562/HHT细胞接种于96孔培养板(细胞数为5×104.well-1，100 μl.wel l-1)，加入相应浓度的用细胞培养液配制的柔红霉素，克班宁或维拉帕米，每孔终体积为200 μl ，5% CO2孵箱中培养72 h后，每孔加入MTT溶液(5 g.L-1)20 μl ，继续培养4 h后，离心(1 000 r.min-1,5 min)，弃去孔内培养液， 每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使其充分溶解，酶联免疫检测仪540 nm波长处测定光 吸收度A值。细胞存活率=(药物组光吸收A值/无药组光吸收A值) ×100%。
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1.2.2 DNR的蓄积 按文献[10]进行，采用荧光分光光度法。
1.2.3 统计处理 细胞毒试验结果取3次实验的均值，组间显著性检验采用医学统计软件POMS-17处理，半抑制浓度IC50采用医学统计软件POMS-36处理。
耐药倍数=耐药株IC50/敏感株IC50
逆转倍数=耐药株IC50/耐药株加逆转剂时IC50
2 结果
2.1 克班宁对HHT细胞毒的影响 克班宁对K 562及K 562/HHT的细胞毒作用较弱，克班宁20 μmol.L-1 时抑制率为23.40%和21.76%，5 μmol.L-1时为14.8%和8.6%。维拉帕米8 μmol.L-1时对K 562和K 562/HHT细胞存活率几无影响。HHT单用及与维拉帕米或克班宁 合用对K 562，K 562/HHT的杀伤效应见表1、2、3，产生半数杀伤作用HHT浓度IC50见表4。统计处理表明克班宁及维拉帕米与HHT合用对敏感株K 562的影响与单用HHT时变化不大 ，而对耐药株K 562/HHT的影响有显著变化，合用逆转剂产生杀伤作用的浓度明显降低。克班宁组和维拉帕米组对K 562/HHT的杀伤作用差性无显著性。
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Tab 1 Effect of drugs on the surviving rate(%) of K 562 cells
Concentration of HHT/mg.L-1
2
4
6
8
10
HHT
80.7±2.5
74.3±2.4
48.7±2.1
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16.7±2.6
2.3±1.5
8 μmol.L-1
VER+HHT
73±4.1
59±3.2
44±2.6
17±1.9
3.0±1.4
5 μmol.L-1
CRE+HHT
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82±4.6
76±3.7
50±2.1
18±1.67
3.0±1.4
n=3 experiments(each 6 wells)Tab 2 Effect of homoharringtonine(HHT) on
the surviving rate(%) of K 562/HHT cells
Concentration of HHT/mg.L-1
Surviving rate/%
, 百拇医药
200
81.7±3.5
400
70.3±2.5
600
37.7±3.0
800
18.0±4.2
1000
3.3±1.6
n=3 experiments(each 6 wells)Tab 3 Effect of drugs on the surviving
, 百拇医药
rate(%) of K 562/HHT cells
Concentration of HHT/mg.L-1
20
40
60
80
100
120
8 μmol.L-1
VER+HHT
52±3.6
, 百拇医药
41±3.2
29±3.7
22±2.6
20±3.0
16±2.2
5 μmol.L-1
CRE+HHT
64±3.4
49±2.9
33±3.3
26±2.4
22±2.8
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17±2.0
n=3 experiments(each 6 wells)Tab 4 Effect of crebanine on the reversing fold
of K 562/HHT cells to homoharringtonine(HHT)
IC50 of HHT/mg.L-1
Reversing fold
Control
447.72±12.34
0
8 μmol.L-1VER
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23.11±0.95
19.4
5 μmol.L-1CRE
34.40±1.72
13.0
2.2 克班宁对DNR在耐药株K 562/HHT细胞内蓄积的影响 从表5可见，在0.2 μmol.L-1柔红霉素作用下，克班宁可以使耐药株K562/HHT摄取柔红霉素量增加。虽不能使其蓄积水平达到敏感株水平，但仍显示了逆转剂克班宁具有较强的抑制耐药株外排药物的作用。
Tab 5 Effect of crebanine on intracellular DNR accumulation
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in K562/HHT cells(ng/5×105 cells)to 0.2 μmol.L-1
DN R in different time(min)
30
40
90
120
K562
61.10
69.13
86.03
96.88
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K562/HHT
16.88
19.83
20.16
22.85
5 μmol.L-1
CRE+K562/HHT
40.27
57.36
60.42
73.54
n=2 experiments3 讨论
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K 562/HHT为mdr-1基因表达增高，其基因表达产物P-gp增加的多药耐药细胞株[9] 。P-gp糖蛋白是一种能量泵，可主动将细胞内药物泵出，从而使细胞内药物减少，产生 多种药物的耐药性。大量研究已表明，钙离子拮抗剂通过竞争性抑制P-gp的外排功能而逆转MDR。克班宁是钙拮抗活性较弱的钙拮抗剂，它能阻断电位依赖性Ca2+通道，抑制组织胺引起的钙释放。本研究中发现克班宁能增强高三尖杉酯碱对耐药株K 562/HHT的杀伤作用，其增强作用不及维拉帕米，而对敏感株K 562影响均不明显。通过测定细胞内柔红霉素含量作为细胞内药物蓄积和外排的指标，发现克班宁显著增加K 562/HHT细胞株内柔红霉素蓄积量，但仍不能完全达到敏感株细胞内蓄积量。基于上述结果，认为克班宁和其它钙离 子通道拮抗剂一样，通过抑制P-gp功能而达到逆转作用，可能是其主要机制。克班宁未能 使K 562/HHT细胞内DNR浓度上升至K 562敏感株水平，即未能完全逆转MDR，可能是因K 562/ HHT细胞还存在其它耐药机制。K 562/HHT有GST-α，GST-π基因表达水平提高，其中GST -π增强对自然来源的抗肿瘤药物产生的耐药性有一定作用，但GST-π总活性没有明显改 变，GST-π不是K 562/HHT细胞MDR的主要机制[9]。克班宁在云南千金藤中含量较 高，提取方法简便，对该药作进一步研究是有意义的。
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*重庆市科委1998年度应用基础基金资助项目
作者简介：赵春景，男，35岁，博士，1998年获首届中国药师杰出新秀奖
赵春景(重庆医科大学附属二院药剂科，重庆 400038)
史曦凯(第三军医大学西南医院药理基地，重庆 400038)
参考文献
1，Shiraishi N, Akiyama S, Nakagawa M et al. Effect of bisbenzylisoquinoline alkaloids on multidrug resistance in KB human cancer cells. Cancer Res， 1987;47:2413～6
, 百拇医药
2，田 晖，潘启超.三种双苄基异喹啉类生物碱调节多药耐药性的作用及与维拉帕米的比较.中国药理学报，1997;18(5):455～8
3，Pan QC, Tian H. Reversal of multidrug resistance by various principles from Chinese herbal medicine. Clin Sci Bull，1996;41:410～4
4，Chen G, Ramachandran C， Krishan A. Thaliblastine,a plant alkaloid, circumvents multidrug resistance by direct binding to P-glycoprotein.Cancer Res，1993;53:2544～7, 百拇医药