造血干细胞冻存时间与细胞活性关系的初步探讨
作者：常伟荣 夏学鸣 吴德沛 岑建农
单位：苏州医学院附属一院血液科，江苏省血液研究所，苏州，215006
关键词：恶性血液病；造血干细胞；冷冻保存；细胞活力
苏州医学院学报000910 摘要 目的 探讨造血干细胞冷冻保存时间与细胞活性之间的关系。方法 造血干细胞中加入细胞冷冻保护剂，通过程控冷冻，放入液氮保存。根据保存的时间不同，复苏后测定细胞活力的变化。结果 细胞液氮保存复苏后，绝大部分的细胞活力得以保存。结论 造血干细胞贮存在液氮中，深低温阻断了酶的活性和细胞代谢，贮存时间长短与细胞活性无关。
中图法分类号 R318.52；R733
Study on the Relationship between Duration of Hemotopoietic Stem Cell Freezing Preservation and Cell Viability
, http://www.100md.com
Chang Weirong, Xia Xueming, Wu Depei, et al
(The First Hospital Affiliated to Suzhou University,Jiangsu Institute of Hematology,Suzhou,215006)
Abstract Objective To explore the correlation between the duration of hemotopoietic stem cell freezing preservation and cell viability.Method Hemotopoietic stem cell were mixed with protective agent of freezing and preseved in liquid nitrogen with programmed freezing.The cell viability was determined after different time of preservation.Results After freezing preservation,the viability of the most of the cells was preserved.Conclusion During freezing preservation of hemotopoietis stem cells in liquid nitrogen,deep hypotemperature blocks the activity of enzyme and cell metabolism and there is no relationship between preservation time and cell viability.
, 百拇医药
Key words hemotologic malignancies;hemotopoietic stem cell;freezing preservation;cell viability
自体外周血干细胞移植是治疗恶性血液病的有效手段之一，但细胞冷冻后的活力是移植成功的关键。如把细胞进行适当有效的冷冻，则细胞活力保持完整，损伤较少，移植后造血功能早期得到重建；反之则相对延迟，甚至失败。本文统计了17例自体干细胞移植患者不同时期冻存后细胞活力、CFU-GM及CD34+细胞之间的关系。结果报告于下。
1 资料与方法
1.1 病例 男11例，女6例，年龄15～53岁。急性非淋巴细胞白血病8例，其中M2 2例，M3 3例，M5 2例；急性淋巴细胞白血病2例；恶性淋巴瘤5例；杂合型白血病1例；多发性骨髓瘤1例。全部患者入净化仓前行颈内静脉留置导管，用以采集造血干细胞及输注液体。
, http://www.100md.com
1.2 冷冻保护剂 TC199培养基9.8g,EDTA-Na2 2.0g,加双蒸水至1000ml，pH6.8～7.0，正压过滤除菌，细菌、热源检测合格，冰箱备用。使用前取上述培养液7份，加入二甲亚砜(DMSO)2份，人类同型血清1份混合。
1.3 方法
1.3.1 动员方案 所有患者均采用MAG方案，米妥蒽醌10mg/m2*d-1×2d，阿糖胞苷2g/m2*12h-1×4次，动员后待WBC下降至<1.0×109/L时，皮下注射惠尔血(G-CSF)300μg,qd。
1.3.2 采集 WBC开始回升时，用流式细胞术监测CD34+细胞，当CD34+细胞量明显升高时，用CS-3000 PLUS血细胞分离机采集造血干细胞，每次采集血量8～14L，血流量55ml/min,采集终点量按单个核细胞(MNC)达到(4～6)×108/kg,CD34+细胞(2～4)×106/kg。
, 百拇医药
1.3.3 冷冻 采集之造血干细胞在超净台中按(0.5～1.0)×108细胞浓度分装入200ml深低温冷冻袋，先作单个核细胞计数、细胞活力、CFU-GM、CD34+细胞检测，然后在冰浴中缓慢加入等量的细胞冷冻液，封口后立即放入CRYOMED程控冷冻仪内冷冻至-90℃后移入液氮内保存1～18个月。
1.4 结果 17例患者细胞冷冻复苏后的活力大部分>60%，与保存时间的长短无关，且造血功能早期得到重建，中性粒细胞≥0.5×109/L需8～29d，平均11d；血小板≥30×109/L需10～120d,平均为21d，见附表。
附表 冷冻不同时间后细胞活力及造血功能恢复所需时间 冷冻时间
n
细胞活力(%)
, http://www.100md.com
冷冻后细胞百分率
造血功能恢复所需时间(d)
CD34+
CFU-GM
N≥0.5×109/L
Plt≥30×109/L
1个月
2
58.5
60.2
59
10
, http://www.100md.com
16
2个月
8
80.5
61.8
63
10
13
3个月
4
54.0
54.0
46
, 百拇医药 9
13
4个月
3
65.0
75.0
60
15
48#
18个月*
1
72.0
68.0
, 百拇医药
61
*移植患者留存标本，#其中1例回输细胞数较正常偏低
2 讨论
影响造血干细胞的活力主要来自冷冻过程中的2个因素：①细胞从液态转为固态时液态水中“融合热”的释放，可使样品中温度很快升高，冷冻曲线发生明显改变，引起细胞大量死亡；②冰晶的形成，可使细胞器移位，蛋白质功能发生改变，最终导致细胞损伤。为把上述2个因素减少到最小，在“相变”发生时，程控冷冻仪喷出大量液氮进行“超冷”，保证细胞理想的冷冻速率，从而保持细胞有较高的活力。另外冷冻时细胞的浓度也跟活力密切相关。有文献[1]报道，最合适的细胞浓度为1.0×108/ml，当细胞浓度增加至2.0×108/ml和3.0×108/ml时，CD34+细胞的活力和CFU-GM无明显改变，但BFU-E则只有1.0×108/ml浓度的73%和51%。样品冷冻结束移入液氮中保存后，由于深低温阻断了各种酶的活性及细胞代谢，可以较长地贮存细胞且保持细胞的活力。有文献[2，3]报道，液氮中保存的造血干细胞，最长达12年，复苏后细胞活力未见明显影响。本文冷冻4个月的3例中，有1例由于回输CD34+细胞的量较正常偏低，造血功能恢复较慢，和有关报道相符[4]，细胞活力等各项指标与保存时间无明显差异。但本文细胞保存时间较短，且例数较少，有待于继续观察探讨。 参考文献
, 百拇医药
1，Odriozola J,Ramos P,Villalon L,et al.An amplified scope of concentrations and Dimethylsulphoxide (DMSO) percentages for the cryopreservation of Peripheral Blood Stem Cells (PBSC).Bone Marrow Transplantation,2000,25(1)∶S253
2，Harris DT,Schumacher MJ,Rychlik S,et al.Collection,separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation.Bone Marrow,1994,13∶135
3，Mugishima H,Harada K,Chin M,et al.Effects of long-term cryopreservation on hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood.Bone Marrow,1999,23∶395
4，Perez-Simon JA,Martin A,Caballero D,et al.Clinical significance of CD34+ cell dose in long-term engraftment following autologous peripheral blood stem cell transplantation.Bone Marrow,1999,24∶1279
2000年4月28日收稿, 百拇医药
单位：苏州医学院附属一院血液科，江苏省血液研究所，苏州，215006
关键词：恶性血液病；造血干细胞；冷冻保存；细胞活力
苏州医学院学报000910 摘要 目的 探讨造血干细胞冷冻保存时间与细胞活性之间的关系。方法 造血干细胞中加入细胞冷冻保护剂，通过程控冷冻，放入液氮保存。根据保存的时间不同，复苏后测定细胞活力的变化。结果 细胞液氮保存复苏后，绝大部分的细胞活力得以保存。结论 造血干细胞贮存在液氮中，深低温阻断了酶的活性和细胞代谢，贮存时间长短与细胞活性无关。
中图法分类号 R318.52；R733
Study on the Relationship between Duration of Hemotopoietic Stem Cell Freezing Preservation and Cell Viability
, http://www.100md.com
Chang Weirong, Xia Xueming, Wu Depei, et al
(The First Hospital Affiliated to Suzhou University,Jiangsu Institute of Hematology,Suzhou,215006)
Abstract Objective To explore the correlation between the duration of hemotopoietic stem cell freezing preservation and cell viability.Method Hemotopoietic stem cell were mixed with protective agent of freezing and preseved in liquid nitrogen with programmed freezing.The cell viability was determined after different time of preservation.Results After freezing preservation,the viability of the most of the cells was preserved.Conclusion During freezing preservation of hemotopoietis stem cells in liquid nitrogen,deep hypotemperature blocks the activity of enzyme and cell metabolism and there is no relationship between preservation time and cell viability.
, 百拇医药
Key words hemotologic malignancies;hemotopoietic stem cell;freezing preservation;cell viability
自体外周血干细胞移植是治疗恶性血液病的有效手段之一，但细胞冷冻后的活力是移植成功的关键。如把细胞进行适当有效的冷冻，则细胞活力保持完整，损伤较少，移植后造血功能早期得到重建；反之则相对延迟，甚至失败。本文统计了17例自体干细胞移植患者不同时期冻存后细胞活力、CFU-GM及CD34+细胞之间的关系。结果报告于下。
1 资料与方法
1.1 病例 男11例，女6例，年龄15～53岁。急性非淋巴细胞白血病8例，其中M2 2例，M3 3例，M5 2例；急性淋巴细胞白血病2例；恶性淋巴瘤5例；杂合型白血病1例；多发性骨髓瘤1例。全部患者入净化仓前行颈内静脉留置导管，用以采集造血干细胞及输注液体。
, http://www.100md.com
1.2 冷冻保护剂 TC199培养基9.8g,EDTA-Na2 2.0g,加双蒸水至1000ml，pH6.8～7.0，正压过滤除菌，细菌、热源检测合格，冰箱备用。使用前取上述培养液7份，加入二甲亚砜(DMSO)2份，人类同型血清1份混合。
1.3 方法
1.3.1 动员方案 所有患者均采用MAG方案，米妥蒽醌10mg/m2*d-1×2d，阿糖胞苷2g/m2*12h-1×4次，动员后待WBC下降至<1.0×109/L时，皮下注射惠尔血(G-CSF)300μg,qd。
1.3.2 采集 WBC开始回升时，用流式细胞术监测CD34+细胞，当CD34+细胞量明显升高时，用CS-3000 PLUS血细胞分离机采集造血干细胞，每次采集血量8～14L，血流量55ml/min,采集终点量按单个核细胞(MNC)达到(4～6)×108/kg,CD34+细胞(2～4)×106/kg。
, 百拇医药
1.3.3 冷冻 采集之造血干细胞在超净台中按(0.5～1.0)×108细胞浓度分装入200ml深低温冷冻袋，先作单个核细胞计数、细胞活力、CFU-GM、CD34+细胞检测，然后在冰浴中缓慢加入等量的细胞冷冻液，封口后立即放入CRYOMED程控冷冻仪内冷冻至-90℃后移入液氮内保存1～18个月。
1.4 结果 17例患者细胞冷冻复苏后的活力大部分>60%，与保存时间的长短无关，且造血功能早期得到重建，中性粒细胞≥0.5×109/L需8～29d，平均11d；血小板≥30×109/L需10～120d,平均为21d，见附表。
附表 冷冻不同时间后细胞活力及造血功能恢复所需时间 冷冻时间
n
细胞活力(%)
, http://www.100md.com
冷冻后细胞百分率
造血功能恢复所需时间(d)
CD34+
CFU-GM
N≥0.5×109/L
Plt≥30×109/L
1个月
2
58.5
60.2
59
10
, http://www.100md.com
16
2个月
8
80.5
61.8
63
10
13
3个月
4
54.0
54.0
46
, 百拇医药 9
13
4个月
3
65.0
75.0
60
15
48#
18个月*
1
72.0
68.0
, 百拇医药
61
*移植患者留存标本，#其中1例回输细胞数较正常偏低
2 讨论
影响造血干细胞的活力主要来自冷冻过程中的2个因素：①细胞从液态转为固态时液态水中“融合热”的释放，可使样品中温度很快升高，冷冻曲线发生明显改变，引起细胞大量死亡；②冰晶的形成，可使细胞器移位，蛋白质功能发生改变，最终导致细胞损伤。为把上述2个因素减少到最小，在“相变”发生时，程控冷冻仪喷出大量液氮进行“超冷”，保证细胞理想的冷冻速率，从而保持细胞有较高的活力。另外冷冻时细胞的浓度也跟活力密切相关。有文献[1]报道，最合适的细胞浓度为1.0×108/ml，当细胞浓度增加至2.0×108/ml和3.0×108/ml时，CD34+细胞的活力和CFU-GM无明显改变，但BFU-E则只有1.0×108/ml浓度的73%和51%。样品冷冻结束移入液氮中保存后，由于深低温阻断了各种酶的活性及细胞代谢，可以较长地贮存细胞且保持细胞的活力。有文献[2，3]报道，液氮中保存的造血干细胞，最长达12年，复苏后细胞活力未见明显影响。本文冷冻4个月的3例中，有1例由于回输CD34+细胞的量较正常偏低，造血功能恢复较慢，和有关报道相符[4]，细胞活力等各项指标与保存时间无明显差异。但本文细胞保存时间较短，且例数较少，有待于继续观察探讨。 参考文献
, 百拇医药
1，Odriozola J,Ramos P,Villalon L,et al.An amplified scope of concentrations and Dimethylsulphoxide (DMSO) percentages for the cryopreservation of Peripheral Blood Stem Cells (PBSC).Bone Marrow Transplantation,2000,25(1)∶S253
2，Harris DT,Schumacher MJ,Rychlik S,et al.Collection,separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation.Bone Marrow,1994,13∶135
3，Mugishima H,Harada K,Chin M,et al.Effects of long-term cryopreservation on hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood.Bone Marrow,1999,23∶395
4，Perez-Simon JA,Martin A,Caballero D,et al.Clinical significance of CD34+ cell dose in long-term engraftment following autologous peripheral blood stem cell transplantation.Bone Marrow,1999,24∶1279
2000年4月28日收稿, 百拇医药