伤寒杆菌耐药质粒pRST98与细菌在巨噬细胞内存活关系的研究
作者：吴淑燕 黄瑞 林发榕
单位：苏州医学院微生物学教研室，苏州，215007
关键词：伤寒杆菌；耐药质粒；巨噬细胞吞噬试验
苏州医学院学报000905 摘要 目的 研究伤寒杆菌的不相容性C群接合性耐药质粒pRST98对其宿主菌在巨噬细胞内存活的影响。方法 用标准系列稀释法检测3株同源染色体伤寒杆菌——含pRST98的野生型伤寒菌株STpRST98、经SDS人工消除pRST98的突变体菌株ST(R-)及pRST98重新导入突变体的接合子pRST98/ST(R-)，研究它们在BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞MφJ774A.1内的存活情况。结果 巨噬细胞吞噬后60min内大多数待检菌被杀死，但pRST98宿主菌在巨噬细胞内的活菌数明显高于无此质粒的菌株(P<0.05)。结论 pRST98能提高其宿主菌在巨噬细胞内的存活能力。
, 百拇医药
中图法分类号 R378.2
Studies on the Ability of S.typhi Strains Survival within Macrophages Mediated by Drug Resistant Plasmid
Wu Shuyan, Huang Rui, Lin Farong
(Department of Microbiology,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective Whether the conjugational IncC group R plasmid (pRST98),encoding resistance to antimicrobial agents in Salmonella typhi,contribute to the ability of its host bacteria survival within macrophages was studied.Methods With a standard recovery procedure (log dilution of lysed cells),three chromosomally isogenic strains,i.e.plasmid-containing widetype S.typhi strain STpRST98,plasmid artificially cured strain ST(R-) and plasmid-re-introduced into the cured strain pRST98/ST(R-) were compared for their ability to survival within BALB/c mouse macrophage cell MφJ774A.1.Results There was a rapid initial intracellular destruction of the salmonllae during a 1h phagocytosis reaction,but the numbers of viable bacteria of STpRST98 and pRST98/ST(R-) were higher than that of ST(R-).Conclusions pRST98 can enhance the ability of S.typhi strains survival within macrophages.
, 百拇医药
Key words S.typhi;R plasmid;macrophage phagocytosis test
pRST98是从我国多重耐药伤寒杆菌中分离的接合性耐药质粒，分子量为98.6Md,属不相容性C群[1，2]。已证实该质粒不但能编码对多种药物的抗性(如血清抗性)，还使其宿主菌的毒力增强，提高对小鼠的致死率。携带pRST98的鼠伤寒菌株感染小鼠后肠系膜淋巴结、脾和肝脏的活菌数明显高于无此质粒的菌株，且引起脏器严重病变[3]。本研究以IncC群pRST98为对象，检测携带该质粒的野生型伤寒菌株在消除质粒及经接合转移试验再次导入该质粒后，细菌在巨噬细胞(Mφ)内存活力的改变，以探讨pRST98对伤寒杆菌在Mφ内生存能力的影响。结果报道于下。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 细菌及细胞株 携带pRST98的多重耐药伤寒杆菌STpRST98为1988年自临床分离，该菌对氯霉素、链霉素、复方磺胺、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、头孢噻吩、氨苄西林、羧苄西林及四环素耐药；ST(R-)由STpRST98用10%SDS，42℃培养24h后，消除了pRST98；pRST98/ST(R-)系经接合转移将pRST98重新导入ST(R-)的接合子。小鼠腹腔巨噬细胞株MφJ774A.1购自中科院上海细胞所。
1.2 方法 巨噬细胞吞噬实验：以标准系列稀释法[4]检测MφJ774A.1在体外吞噬STpRST98、ST(R-)和pRST98/ST(R-)后，细菌在细胞内的存活情况。待检菌37℃振荡培养16h，用PBS洗涤3次，分光光度计定量，终浓度调整至理论值108CFU/ml，并以实际菌落计数监控。按常规培养MφJ774A.1，将其浓度调整至5×105个细胞/ml，37℃、5%CO2条件下平衡1h后，各加3ml于3个硅化的细胞培养瓶中，每瓶分别加入3ml待检菌液，37℃、5%CO2共同作用1h后，用含阿米卡星50μg/ml的1640培养液离心洗涤3次除去胞外菌，然后重新悬浮于6ml含50μg/ml阿米卡星的培养液中，此时定为0时，分别于0、10、30、60min各取出0.5ml(一式3份)，用含0.5%脱氧胆酸钠的PBS作用10min溶解巨噬细胞，适当稀释后做平板菌落计数。以CFU平均值作为Mφ内的活菌数。
, 百拇医药
试验重复3次后作统计学分析。2 结果
巨噬细胞吞噬伤寒杆菌后起始阶段随时间的推移，细胞内的活菌数逐渐下降，大多数细菌被杀死，但以后随时间延长，活菌数逐渐回升，每个时间段所分离的携带pRST98宿主菌——STpRST98、pRST98/ST(R-)的活菌数均明显高于不含pRST98的菌株——ST(R-)，前者约为后者的3～10倍(P<0.05)，而STpRST98在Mφ内的活菌数与pRST98/ST(R-)则无明显差别(P>0.05，见附图)。
附图 MφJ774A.1,天噬细菌后不同时间段分离的活菌数
3 讨论
, 百拇医药
伤寒杆菌为兼性胞内菌，在宿主体内主要寄居在单核—吞噬细胞内，它们具备抵抗溶酶体酶、抑制吞噬体—溶酶体融合、干扰活性氧中介物(ROI)等逃避Mφ杀伤的防御机制[5]。我们的实验结果显示，在被吞噬后60min内，大多数伤寒杆菌被杀死，这是由于细菌在Mφ的吞噬泡内面临着氧自由基、低pH、毒性多肽和有限的营养成份等抗菌物质[6]，仅一小部分细菌可在这段时间内生存下来。已证实在吞噬了沙门菌的Mφ内存在巨型吞噬体，它能稀释吞噬体内杀菌物质的浓度，且能使细菌与酸性环境缓慢接触，为细菌表达某些有利于生存的基因产物赢得时间[7]。Abshire等发现在Mφ内的沙门菌至少可分为两个群体，一群静止，另一群则快速分裂，多种情况下静止的状态比增殖的状态更重要。当Mφ吞噬细菌后，细菌进入非增殖、却抵抗的状态，以后当条件改善时，细菌再开始增殖[8]。我们的实验结果说明，伤寒杆菌的存活有赖于能在Mφ内生长的一小部分细菌的适应性。
细菌在Mφ内的命运取决于Mφ杀菌活性的诱导和毒力基因的表达两种作用抗争的结果。已证实，在其它沙门菌的毒力质粒上有一系列与细菌侵入宿主网状内皮系统有关的基因[9]。我们的实验结果表明，在不同时间段分离的pRST98宿主菌的活菌数均明显高于不含此质粒的菌株，证实pRST98能提高伤寒杆菌在巨噬细胞内的生存能力。沙门菌毒力基因表达的变化对细菌在Mφ内的存活和(或)增殖是非常重要的，这些基因部分定位于大质粒。有报道[10]认为，细菌处于碳水化合物饥饿或生长处于静止期时，毒力质粒基因被活化。毒力质粒还能引起Mφ功能障碍，影响Mφ的聚集和活化，干扰宿主的免疫调节，并能直接影响Mφ的存活，引起Mφ溶解，且该作用发生于免疫应答的早期。推测这是Mφ吞噬后60min内所回收的pRST98宿主菌的活菌数偏低的另一个理由，因为Mφ溶解后，待检菌将直接暴露于阿米卡星而被杀死。但pRST98究竟是介导其宿主菌抵抗吞噬细胞的吞噬和(或)杀伤，还是与细菌在Mφ内的增殖有关，或是介导某种免疫抑制，需进一步研究证实。
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苏州医学院99青年基金资助课题
吴淑燕，硕士研究生；黄瑞、林发榕，导师
参考文献
1，黄 瑞，穆荣普.伤寒沙门氏菌耐药性及其耐药质粒的监测.中华传染病杂志，1994，12(4)∶204
2，顾国浩，穆荣普.伤寒杆菌R质粒不相容性分群.中华微生物学和免疫学杂志，1992，12(6)∶357
3，黄 瑞，吴淑燕，闻玉梅.细菌接合性耐药质粒与毒力关系的研究.苏州医学院学报，2000，20(1)∶13
4，Raybourne RB,Bunning VK.Bacterium-host cell interactions at the cellular level:fluorescent labeling of bacteria and analysis of short-term bacterium-phagocyte interaction by flow cytometry.Infection and Immunity,1994,62(2)∶665
, http://www.100md.com
5，余传霖，叶天星，陆德源，等.现代医学免疫学.上海∶上海医科大学出版社，1998∶450
6，徐建国，余秀军译.医用细菌遗传学实验指南.北京∶科学出版社，1998∶14
7，林剑国，综述.石淑仙，审校.伤寒发病机理的新认识.国外医学∶流行病学传染病学分册，1995，22(4)∶167
8，Abshire KZ,Neidhardt FC.Growth rate paradox of Salmonella typhimuriam within host macrophages.J Bacteriol,1993,175(12)∶3744
9，Gulig PA,Danbara H,Guiney DG,et al.Molecular analysis of SPV virulence genes of the Salmonella virulence plasmid.Mol.Microliol,1993,7∶825
10，Guilloteau LA,Wallis TS,Gautier AV,et al.The salmonella virulence plasmid enhances salmonella-induced lysis of macrophages and influences inflammatory responses.Infect.Immun,1996,64(8)∶3385
2000年7月7日收稿, http://www.100md.com
单位：苏州医学院微生物学教研室，苏州，215007
关键词：伤寒杆菌；耐药质粒；巨噬细胞吞噬试验
苏州医学院学报000905 摘要 目的 研究伤寒杆菌的不相容性C群接合性耐药质粒pRST98对其宿主菌在巨噬细胞内存活的影响。方法 用标准系列稀释法检测3株同源染色体伤寒杆菌——含pRST98的野生型伤寒菌株STpRST98、经SDS人工消除pRST98的突变体菌株ST(R-)及pRST98重新导入突变体的接合子pRST98/ST(R-)，研究它们在BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞MφJ774A.1内的存活情况。结果 巨噬细胞吞噬后60min内大多数待检菌被杀死，但pRST98宿主菌在巨噬细胞内的活菌数明显高于无此质粒的菌株(P<0.05)。结论 pRST98能提高其宿主菌在巨噬细胞内的存活能力。
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中图法分类号 R378.2
Studies on the Ability of S.typhi Strains Survival within Macrophages Mediated by Drug Resistant Plasmid
Wu Shuyan, Huang Rui, Lin Farong
(Department of Microbiology,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective Whether the conjugational IncC group R plasmid (pRST98),encoding resistance to antimicrobial agents in Salmonella typhi,contribute to the ability of its host bacteria survival within macrophages was studied.Methods With a standard recovery procedure (log dilution of lysed cells),three chromosomally isogenic strains,i.e.plasmid-containing widetype S.typhi strain STpRST98,plasmid artificially cured strain ST(R-) and plasmid-re-introduced into the cured strain pRST98/ST(R-) were compared for their ability to survival within BALB/c mouse macrophage cell MφJ774A.1.Results There was a rapid initial intracellular destruction of the salmonllae during a 1h phagocytosis reaction,but the numbers of viable bacteria of STpRST98 and pRST98/ST(R-) were higher than that of ST(R-).Conclusions pRST98 can enhance the ability of S.typhi strains survival within macrophages.
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Key words S.typhi;R plasmid;macrophage phagocytosis test
pRST98是从我国多重耐药伤寒杆菌中分离的接合性耐药质粒，分子量为98.6Md,属不相容性C群[1，2]。已证实该质粒不但能编码对多种药物的抗性(如血清抗性)，还使其宿主菌的毒力增强，提高对小鼠的致死率。携带pRST98的鼠伤寒菌株感染小鼠后肠系膜淋巴结、脾和肝脏的活菌数明显高于无此质粒的菌株，且引起脏器严重病变[3]。本研究以IncC群pRST98为对象，检测携带该质粒的野生型伤寒菌株在消除质粒及经接合转移试验再次导入该质粒后，细菌在巨噬细胞(Mφ)内存活力的改变，以探讨pRST98对伤寒杆菌在Mφ内生存能力的影响。结果报道于下。
1 材料和方法
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1.1 细菌及细胞株 携带pRST98的多重耐药伤寒杆菌STpRST98为1988年自临床分离，该菌对氯霉素、链霉素、复方磺胺、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、头孢噻吩、氨苄西林、羧苄西林及四环素耐药；ST(R-)由STpRST98用10%SDS，42℃培养24h后，消除了pRST98；pRST98/ST(R-)系经接合转移将pRST98重新导入ST(R-)的接合子。小鼠腹腔巨噬细胞株MφJ774A.1购自中科院上海细胞所。
1.2 方法 巨噬细胞吞噬实验：以标准系列稀释法[4]检测MφJ774A.1在体外吞噬STpRST98、ST(R-)和pRST98/ST(R-)后，细菌在细胞内的存活情况。待检菌37℃振荡培养16h，用PBS洗涤3次，分光光度计定量，终浓度调整至理论值108CFU/ml，并以实际菌落计数监控。按常规培养MφJ774A.1，将其浓度调整至5×105个细胞/ml，37℃、5%CO2条件下平衡1h后，各加3ml于3个硅化的细胞培养瓶中，每瓶分别加入3ml待检菌液，37℃、5%CO2共同作用1h后，用含阿米卡星50μg/ml的1640培养液离心洗涤3次除去胞外菌，然后重新悬浮于6ml含50μg/ml阿米卡星的培养液中，此时定为0时，分别于0、10、30、60min各取出0.5ml(一式3份)，用含0.5%脱氧胆酸钠的PBS作用10min溶解巨噬细胞，适当稀释后做平板菌落计数。以CFU平均值作为Mφ内的活菌数。
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试验重复3次后作统计学分析。2 结果
巨噬细胞吞噬伤寒杆菌后起始阶段随时间的推移，细胞内的活菌数逐渐下降，大多数细菌被杀死，但以后随时间延长，活菌数逐渐回升，每个时间段所分离的携带pRST98宿主菌——STpRST98、pRST98/ST(R-)的活菌数均明显高于不含pRST98的菌株——ST(R-)，前者约为后者的3～10倍(P<0.05)，而STpRST98在Mφ内的活菌数与pRST98/ST(R-)则无明显差别(P>0.05，见附图)。
附图 MφJ774A.1,天噬细菌后不同时间段分离的活菌数
3 讨论
, 百拇医药
伤寒杆菌为兼性胞内菌，在宿主体内主要寄居在单核—吞噬细胞内，它们具备抵抗溶酶体酶、抑制吞噬体—溶酶体融合、干扰活性氧中介物(ROI)等逃避Mφ杀伤的防御机制[5]。我们的实验结果显示，在被吞噬后60min内，大多数伤寒杆菌被杀死，这是由于细菌在Mφ的吞噬泡内面临着氧自由基、低pH、毒性多肽和有限的营养成份等抗菌物质[6]，仅一小部分细菌可在这段时间内生存下来。已证实在吞噬了沙门菌的Mφ内存在巨型吞噬体，它能稀释吞噬体内杀菌物质的浓度，且能使细菌与酸性环境缓慢接触，为细菌表达某些有利于生存的基因产物赢得时间[7]。Abshire等发现在Mφ内的沙门菌至少可分为两个群体，一群静止，另一群则快速分裂，多种情况下静止的状态比增殖的状态更重要。当Mφ吞噬细菌后，细菌进入非增殖、却抵抗的状态，以后当条件改善时，细菌再开始增殖[8]。我们的实验结果说明，伤寒杆菌的存活有赖于能在Mφ内生长的一小部分细菌的适应性。
细菌在Mφ内的命运取决于Mφ杀菌活性的诱导和毒力基因的表达两种作用抗争的结果。已证实，在其它沙门菌的毒力质粒上有一系列与细菌侵入宿主网状内皮系统有关的基因[9]。我们的实验结果表明，在不同时间段分离的pRST98宿主菌的活菌数均明显高于不含此质粒的菌株，证实pRST98能提高伤寒杆菌在巨噬细胞内的生存能力。沙门菌毒力基因表达的变化对细菌在Mφ内的存活和(或)增殖是非常重要的，这些基因部分定位于大质粒。有报道[10]认为，细菌处于碳水化合物饥饿或生长处于静止期时，毒力质粒基因被活化。毒力质粒还能引起Mφ功能障碍，影响Mφ的聚集和活化，干扰宿主的免疫调节，并能直接影响Mφ的存活，引起Mφ溶解，且该作用发生于免疫应答的早期。推测这是Mφ吞噬后60min内所回收的pRST98宿主菌的活菌数偏低的另一个理由，因为Mφ溶解后，待检菌将直接暴露于阿米卡星而被杀死。但pRST98究竟是介导其宿主菌抵抗吞噬细胞的吞噬和(或)杀伤，还是与细菌在Mφ内的增殖有关，或是介导某种免疫抑制，需进一步研究证实。
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苏州医学院99青年基金资助课题
吴淑燕，硕士研究生；黄瑞、林发榕，导师
参考文献
1，黄 瑞，穆荣普.伤寒沙门氏菌耐药性及其耐药质粒的监测.中华传染病杂志，1994，12(4)∶204
2，顾国浩，穆荣普.伤寒杆菌R质粒不相容性分群.中华微生物学和免疫学杂志，1992，12(6)∶357
3，黄 瑞，吴淑燕，闻玉梅.细菌接合性耐药质粒与毒力关系的研究.苏州医学院学报，2000，20(1)∶13
4，Raybourne RB,Bunning VK.Bacterium-host cell interactions at the cellular level:fluorescent labeling of bacteria and analysis of short-term bacterium-phagocyte interaction by flow cytometry.Infection and Immunity,1994,62(2)∶665
, http://www.100md.com
5，余传霖，叶天星，陆德源，等.现代医学免疫学.上海∶上海医科大学出版社，1998∶450
6，徐建国，余秀军译.医用细菌遗传学实验指南.北京∶科学出版社，1998∶14
7，林剑国，综述.石淑仙，审校.伤寒发病机理的新认识.国外医学∶流行病学传染病学分册，1995，22(4)∶167
8，Abshire KZ,Neidhardt FC.Growth rate paradox of Salmonella typhimuriam within host macrophages.J Bacteriol,1993,175(12)∶3744
9，Gulig PA,Danbara H,Guiney DG,et al.Molecular analysis of SPV virulence genes of the Salmonella virulence plasmid.Mol.Microliol,1993,7∶825
10，Guilloteau LA,Wallis TS,Gautier AV,et al.The salmonella virulence plasmid enhances salmonella-induced lysis of macrophages and influences inflammatory responses.Infect.Immun,1996,64(8)∶3385
2000年7月7日收稿, http://www.100md.com