粉防己碱对大鼠肺动脉平滑肌细胞小电导钙激活钾通道的作用
王中峰 开丽 肖欣荣
摘 要 目的 研究粉防己碱(Tet)对大鼠肺动脉平滑肌细胞小电导钙激活钾通道(SKCa)的作用。方法 内面朝外膜片箝单通道记录法。结果 Tet 7.5 μmol.L-1对电导值为10 pS的SKCa无明显影响,15 μmol.L-1可增加SKCa开放的概率，改变通道的开放和关闭模式，30 μmol.L-1降低通道的开放概率，通道开放以短暂簇状为主。结论 Tet对肺动脉平滑肌SKCa的作用与Tet的浓度有关，合适浓度下可增加通道的开放，K+外流增多，与Tet降低肺动脉张力有关。
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关键词：粉防己碱 钾通道 钙 膜片箝技术 平滑肌 肺动脉 大鼠
粉防己碱(tetrandrine, Tet)已用于临床治疗心律失常和高血压。Tet有阻断Ca2+通道和神经末梢钙激活钾通道，以及舒张平滑肌的作用[1～4]。作者也发现Tet对肺动脉平滑肌大电导钙激活钾通道有双重作用[5]，由于钾通道的激活，特别是钙激活钾通道(calcium-activated potassium channels, KCa)和ATP-敏感钾通道,可降低由缺氧所致的肺动脉收缩,降低肺动脉张力[6～8],本文用膜片箝技术研究Tet对肺动脉平滑肌小电导钙激活钾通道(small-conductance calcium-activated potassium channel, SKCa)的作用,以进一步阐明Tet的血管舒张作用机制。
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1 材料与方法
1.1 药品和试剂 Tet(纯度>98%，浙江金华制药厂)，胶原酶(Ⅺ型，Sigma), 木瓜蛋白酶(Sigma), 牛血清白蛋白(Sigma), 四乙基胺(TEA, Sigma)；二硫苏糖醇(DTT, Sigma); 多聚赖氨酸(Sigma); HEPES (Sigma), N-trimethylsilydiethylamine(Sigma),其余均为国产分析纯。
1.2 肺动脉平滑肌细胞分离 按参考文献介绍的方法略加改进[6，7]。成年♂ Wistar大鼠，200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供, 10 g.L-1戊巴比妥钠33 mg.kg-1腹腔注射麻醉后, 开胸分离肺及心脏, 并迅速移至4℃的分离液中(mmol.L-1: NaCl 130, KCl 5, MgCl2 1.2, CaCl2 1.5, HEPES 10,葡萄糖10, pH 7.3),仔细分离肺动脉干及1～3级小动脉分支, 并去除内膜, 将动脉剪碎,37℃的低钙(20 μmol.L-1)分离液中孵育20 min后, 移入1 ml低钙液内, 加入胶原酶1 mg, 木瓜蛋白酶1 mg, DTT 1 mmol.L-1, 牛血清白蛋白2 mg, 37℃恒温消化40 min, 1 000×g离心5 min,沉淀用2 ml无钙分离液悬浮, 用尖端火抛光的Pasteur吸管缓慢吹打使组织分散,细胞悬液滴加于事先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上,4℃保存,8 h内备用。
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1.3 溶液 电极液(mmol.L-1): KCl 140, MgCl2 1, Na2ATP 0.5, EGTA 6, CaCl2 5.4, HEPES 10, KOH调pH至7.4。浴液成分同电极液。
1.4 电生理记录 玻璃微电极用微电极拉制器(PP-83, Narishige, Japan)两步拉制,尖端直径1～1.5 μm,涂布N-trimethylsilydiethylamine,并进行热抛光,充灌电极液后电极电阻4～6 MΩ。在室温下(23℃±2℃)用内面朝外(inside-out)膜片箝记录方式记录单通道电流, 电流经膜片箝放大器(CEZ-2200, Nihon Kohden, Japan)放大, 放大器低通滤波1 kHz,用pClamp软件(6.02版, Axon Instrument, USA)不间断录入微机, 采样频率10 kHz,3 kHz滤波。在形成内面朝外式结构后,记录通道电流,并确认通道性质, 以-200 mV箝制电位, 0.2 μmol.L-1游离Ca2+下的电流记录作为对照,然后加入Tet,其终浓度分别为7.5,15和30 μmol.L-1,再次记录同一膜片上的通道电流。
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1.5 结果分析和处理 通道电流用高斯分布拟合,开放和关闭时间用指数拟合,开放时间除以总采样时间求出开放概率.数据用X±s表示,单因素方差分析统计学处理。
2 结果
2.1 肺动脉平滑肌细胞SKCa的电导 形成内面朝外膜片箝记录结构后,胞内面朝向浴液, 其中游离Ca2+浓度为0.3 μmol.L-1,在-200 mV至+200 mV不同的箝制电位下, 记录通道的单通道电流, 绘制其电流-电压曲线(见图1), 计算出通道的电导为(10.6±0.4) pS。增加胞内钙浓度, 通道开放显著增加, 说明记录到的是SKCa(n=7)。
Fig 1 I-U relationship of small-conductance calcium-activated
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potassium channels of rat pulmonary artery smooth muscle cells
2.2 Tet对SKCa的作用 将细胞膜电位箝制在-200 mV,以内面朝外方式记录通道电流, 其开放时间符合单指数分布,时间常数τ为(5.84±1.56) ms, 关闭时间符合双指数分布, 时间常数τ1和τ2分别为(101.8±7.5) ms和(370.8±15.6) ms,通道开放的电流幅度(2.28±0.06) pA,开放概率0.012±0.004。
当浴液中加入Tet 7.5 μmol.L-1,通道电活动与加药前无明显变化,Tet浓度增加到15 μmol.L-1时,通道开放时间转变为双指数拟合,其时间常数τ1和τ2分别为(3.88±1.05) ms和(31.25±7.22) ms,开放概率显著增加到0.042±0.010 (P<0.01), 关闭时间变为单指数拟合,时间常数τ为(205.8±12.2) ms,当Tet浓度增大到30 μmol.L-1时，通道转变为短暂簇状(brief)开放, 开放时间常数τ1和τ2分别减小到(0.075±0.012) ms和(0.928±0.047) ms,关闭时间常数又转变为双指数拟合,时间常数τ1和τ2分别为(3.33±0.45) ms和(32.41±4.37) ms,开放概率降低到0.011±0.002.在此基础上将胞内钙浓度提高到1 μmol.L-1, 通道的开放概率又增加,但开放仍以短暂开放为主,开放的频率增加,再加入四乙基胺10 μmol.L-1,通道电活动无明显变化(见图2, n=7)。
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Fig 2 Effects of tetrandrine (Tet) on small-conductance calcium-activated potassium channels in isolated rat pulmonary artery smooth muscle cells at a membrane potential -200 mV from an inside-out membrane patch exposed to symmetrical KCl 140 mmol.L-1
A: Control; B: Tet 7.5 μmol.L-1;
C: Tet 15 μmol.L-1; D: Tet 30 μmol.L-1;
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E: Ca2+1 μmol.L-1; F: TEA 10 μmol.L-1
3 讨论
KCa广泛存在于哺乳动物的可兴奋细胞膜, 依据其电生理学性质及电导水平, 一般分为小电导(10～35) pS,中电导(40～100) pS和大电导(100～300) pS[9].本实验用内面朝外膜片箝记录技术, 在胞内外140 mmol.L-1对称KCl的状态下,成功地记录了大鼠肺动脉平滑肌膜SKCa,该通道对胞内Ca2+浓度变化十分敏感,电导值约10 pS,且对胞内施加钾通道阻断剂TEA不敏感,属于典型的SKCa〔9〕。较低浓度的Tet对SKCa无显著影响,但随着Tet浓度增加，通道的开放概率增加，说明Tet在合适的浓度下有SKCa激活作用，增加K+外流, 而且可以改变通道的开放和关闭模式, Tet对肺动脉平滑肌SKCa的作用是Tet降低肺动脉张力的原因之一。当Tet浓度过高时, 反而降低通道的开放概率, 使通道呈短暂开放状态, 此作用可能是Tet浓度过高的毒性作用, 与Tet对肺动脉平滑肌大电导KCa的作用相似〔5〕, Tet影响SKCa作用的机制还有待进一步研究。
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作者简介：王中峰, 男, 34岁, 医学博士, 现为中国科学院上海生理研究所博士后, 从事生物活性物质与离子通道研究
王中峰(第三军医大学生理学教研室,重庆 400038)
王中峰(现在中国科学院上海生理研究所,上海 200031)
开丽(第三军医大学大坪医院野战外科研究所,重庆 400042)
肖欣荣(华西医科大学附一院呼吸内科,成都 610041)
参考文献
1.Liu QY, Karpinski E, Rao MR, Pang PKT. Tetrandrine, a novel calcium channel antagonist inhibits types Ⅰ calcium channels in neuroblastoma cells. Neuropharmacology, 1991;30(12A):1325～31
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2.Wang G, Lemos JR. Tetrandrine blocks a slow, large-conductance, Ca2+-activated potassium channel besides inhibiting a non-inactivating Ca2+ current in isolated nerve terminals of the rat neurohypophysis. Pflugers Arch, 1992;421(6): 558～65
3.Wang G, Jiang MX, Coyne MD, Lemos JR. Comparison of effects of tetrandrine on ionic channels of isolated rat neurohypophysial terminals and Y1 mouse adrenocortical tumor cells. Acta Pharmacol Sin, 1993;14(2): 101～6
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4.Yang XH, Yao WX, Xia GJ et al. Effects of tetrandrine on canine various vascular smooth muscles. Chin J Pharmacol Toxicol, 1995;9(2):116～8
5.Wang ZF, Kai L, Xiao XR. Dual effects of tetrandrine on calcium-activated potassium channels in pulmonary smooth muscle cells. Acta Pharmacol Sin, 1999;20(3):253～6
6.Albarwani S, Robertson BE, Nye PCG, Kozlowski RZ. Biophysical properties of Ca2+ and Mg2+-ATP-activated K+ channels in pulmonary arterial smooth muscle cells isolated from the rat. Pflugers Arch, 1994;428(5～6):446～54
, 百拇医药
7.Smirnov SV, Robertson TP, Ward JPT, Aaronson PI. Chronic hypoxia is associated with reduced delayed rectifier K+ current in rat pulmonary artery muscle cells. Am J Physiol, 1994;266(1 pt 2): H 365～70
8.Post JM, Hume JR, Archer SL, Weir EK. Direct role for potassium channel inhibition in hypoxic pulmonary vasconstriction. Am J Physiol, 1992; 262(4 pt 1): C 882～90
9.McManus OB. Calcium-activated potassium channels: regulation by calcium. J Bioenerg Biomembr, 1991;23(4):537～60, 百拇医药
摘 要 目的 研究粉防己碱(Tet)对大鼠肺动脉平滑肌细胞小电导钙激活钾通道(SKCa)的作用。方法 内面朝外膜片箝单通道记录法。结果 Tet 7.5 μmol.L-1对电导值为10 pS的SKCa无明显影响,15 μmol.L-1可增加SKCa开放的概率，改变通道的开放和关闭模式，30 μmol.L-1降低通道的开放概率，通道开放以短暂簇状为主。结论 Tet对肺动脉平滑肌SKCa的作用与Tet的浓度有关，合适浓度下可增加通道的开放，K+外流增多，与Tet降低肺动脉张力有关。
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关键词：粉防己碱 钾通道 钙 膜片箝技术 平滑肌 肺动脉 大鼠
粉防己碱(tetrandrine, Tet)已用于临床治疗心律失常和高血压。Tet有阻断Ca2+通道和神经末梢钙激活钾通道，以及舒张平滑肌的作用[1～4]。作者也发现Tet对肺动脉平滑肌大电导钙激活钾通道有双重作用[5]，由于钾通道的激活，特别是钙激活钾通道(calcium-activated potassium channels, KCa)和ATP-敏感钾通道,可降低由缺氧所致的肺动脉收缩,降低肺动脉张力[6～8],本文用膜片箝技术研究Tet对肺动脉平滑肌小电导钙激活钾通道(small-conductance calcium-activated potassium channel, SKCa)的作用,以进一步阐明Tet的血管舒张作用机制。
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1 材料与方法
1.1 药品和试剂 Tet(纯度>98%，浙江金华制药厂)，胶原酶(Ⅺ型，Sigma), 木瓜蛋白酶(Sigma), 牛血清白蛋白(Sigma), 四乙基胺(TEA, Sigma)；二硫苏糖醇(DTT, Sigma); 多聚赖氨酸(Sigma); HEPES (Sigma), N-trimethylsilydiethylamine(Sigma),其余均为国产分析纯。
1.2 肺动脉平滑肌细胞分离 按参考文献介绍的方法略加改进[6，7]。成年♂ Wistar大鼠，200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供, 10 g.L-1戊巴比妥钠33 mg.kg-1腹腔注射麻醉后, 开胸分离肺及心脏, 并迅速移至4℃的分离液中(mmol.L-1: NaCl 130, KCl 5, MgCl2 1.2, CaCl2 1.5, HEPES 10,葡萄糖10, pH 7.3),仔细分离肺动脉干及1～3级小动脉分支, 并去除内膜, 将动脉剪碎,37℃的低钙(20 μmol.L-1)分离液中孵育20 min后, 移入1 ml低钙液内, 加入胶原酶1 mg, 木瓜蛋白酶1 mg, DTT 1 mmol.L-1, 牛血清白蛋白2 mg, 37℃恒温消化40 min, 1 000×g离心5 min,沉淀用2 ml无钙分离液悬浮, 用尖端火抛光的Pasteur吸管缓慢吹打使组织分散,细胞悬液滴加于事先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上,4℃保存,8 h内备用。
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1.3 溶液 电极液(mmol.L-1): KCl 140, MgCl2 1, Na2ATP 0.5, EGTA 6, CaCl2 5.4, HEPES 10, KOH调pH至7.4。浴液成分同电极液。
1.4 电生理记录 玻璃微电极用微电极拉制器(PP-83, Narishige, Japan)两步拉制,尖端直径1～1.5 μm,涂布N-trimethylsilydiethylamine,并进行热抛光,充灌电极液后电极电阻4～6 MΩ。在室温下(23℃±2℃)用内面朝外(inside-out)膜片箝记录方式记录单通道电流, 电流经膜片箝放大器(CEZ-2200, Nihon Kohden, Japan)放大, 放大器低通滤波1 kHz,用pClamp软件(6.02版, Axon Instrument, USA)不间断录入微机, 采样频率10 kHz,3 kHz滤波。在形成内面朝外式结构后,记录通道电流,并确认通道性质, 以-200 mV箝制电位, 0.2 μmol.L-1游离Ca2+下的电流记录作为对照,然后加入Tet,其终浓度分别为7.5,15和30 μmol.L-1,再次记录同一膜片上的通道电流。
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1.5 结果分析和处理 通道电流用高斯分布拟合,开放和关闭时间用指数拟合,开放时间除以总采样时间求出开放概率.数据用X±s表示,单因素方差分析统计学处理。
2 结果
2.1 肺动脉平滑肌细胞SKCa的电导 形成内面朝外膜片箝记录结构后,胞内面朝向浴液, 其中游离Ca2+浓度为0.3 μmol.L-1,在-200 mV至+200 mV不同的箝制电位下, 记录通道的单通道电流, 绘制其电流-电压曲线(见图1), 计算出通道的电导为(10.6±0.4) pS。增加胞内钙浓度, 通道开放显著增加, 说明记录到的是SKCa(n=7)。
Fig 1 I-U relationship of small-conductance calcium-activated
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potassium channels of rat pulmonary artery smooth muscle cells
2.2 Tet对SKCa的作用 将细胞膜电位箝制在-200 mV,以内面朝外方式记录通道电流, 其开放时间符合单指数分布,时间常数τ为(5.84±1.56) ms, 关闭时间符合双指数分布, 时间常数τ1和τ2分别为(101.8±7.5) ms和(370.8±15.6) ms,通道开放的电流幅度(2.28±0.06) pA,开放概率0.012±0.004。
当浴液中加入Tet 7.5 μmol.L-1,通道电活动与加药前无明显变化,Tet浓度增加到15 μmol.L-1时,通道开放时间转变为双指数拟合,其时间常数τ1和τ2分别为(3.88±1.05) ms和(31.25±7.22) ms,开放概率显著增加到0.042±0.010 (P<0.01), 关闭时间变为单指数拟合,时间常数τ为(205.8±12.2) ms,当Tet浓度增大到30 μmol.L-1时，通道转变为短暂簇状(brief)开放, 开放时间常数τ1和τ2分别减小到(0.075±0.012) ms和(0.928±0.047) ms,关闭时间常数又转变为双指数拟合,时间常数τ1和τ2分别为(3.33±0.45) ms和(32.41±4.37) ms,开放概率降低到0.011±0.002.在此基础上将胞内钙浓度提高到1 μmol.L-1, 通道的开放概率又增加,但开放仍以短暂开放为主,开放的频率增加,再加入四乙基胺10 μmol.L-1,通道电活动无明显变化(见图2, n=7)。
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Fig 2 Effects of tetrandrine (Tet) on small-conductance calcium-activated potassium channels in isolated rat pulmonary artery smooth muscle cells at a membrane potential -200 mV from an inside-out membrane patch exposed to symmetrical KCl 140 mmol.L-1
A: Control; B: Tet 7.5 μmol.L-1;
C: Tet 15 μmol.L-1; D: Tet 30 μmol.L-1;
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E: Ca2+1 μmol.L-1; F: TEA 10 μmol.L-1
3 讨论
KCa广泛存在于哺乳动物的可兴奋细胞膜, 依据其电生理学性质及电导水平, 一般分为小电导(10～35) pS,中电导(40～100) pS和大电导(100～300) pS[9].本实验用内面朝外膜片箝记录技术, 在胞内外140 mmol.L-1对称KCl的状态下,成功地记录了大鼠肺动脉平滑肌膜SKCa,该通道对胞内Ca2+浓度变化十分敏感,电导值约10 pS,且对胞内施加钾通道阻断剂TEA不敏感,属于典型的SKCa〔9〕。较低浓度的Tet对SKCa无显著影响,但随着Tet浓度增加，通道的开放概率增加，说明Tet在合适的浓度下有SKCa激活作用，增加K+外流, 而且可以改变通道的开放和关闭模式, Tet对肺动脉平滑肌SKCa的作用是Tet降低肺动脉张力的原因之一。当Tet浓度过高时, 反而降低通道的开放概率, 使通道呈短暂开放状态, 此作用可能是Tet浓度过高的毒性作用, 与Tet对肺动脉平滑肌大电导KCa的作用相似〔5〕, Tet影响SKCa作用的机制还有待进一步研究。
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作者简介：王中峰, 男, 34岁, 医学博士, 现为中国科学院上海生理研究所博士后, 从事生物活性物质与离子通道研究
王中峰(第三军医大学生理学教研室,重庆 400038)
王中峰(现在中国科学院上海生理研究所,上海 200031)
开丽(第三军医大学大坪医院野战外科研究所,重庆 400042)
肖欣荣(华西医科大学附一院呼吸内科,成都 610041)
参考文献
1.Liu QY, Karpinski E, Rao MR, Pang PKT. Tetrandrine, a novel calcium channel antagonist inhibits types Ⅰ calcium channels in neuroblastoma cells. Neuropharmacology, 1991;30(12A):1325～31
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2.Wang G, Lemos JR. Tetrandrine blocks a slow, large-conductance, Ca2+-activated potassium channel besides inhibiting a non-inactivating Ca2+ current in isolated nerve terminals of the rat neurohypophysis. Pflugers Arch, 1992;421(6): 558～65
3.Wang G, Jiang MX, Coyne MD, Lemos JR. Comparison of effects of tetrandrine on ionic channels of isolated rat neurohypophysial terminals and Y1 mouse adrenocortical tumor cells. Acta Pharmacol Sin, 1993;14(2): 101～6
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5.Wang ZF, Kai L, Xiao XR. Dual effects of tetrandrine on calcium-activated potassium channels in pulmonary smooth muscle cells. Acta Pharmacol Sin, 1999;20(3):253～6
6.Albarwani S, Robertson BE, Nye PCG, Kozlowski RZ. Biophysical properties of Ca2+ and Mg2+-ATP-activated K+ channels in pulmonary arterial smooth muscle cells isolated from the rat. Pflugers Arch, 1994;428(5～6):446～54
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7.Smirnov SV, Robertson TP, Ward JPT, Aaronson PI. Chronic hypoxia is associated with reduced delayed rectifier K+ current in rat pulmonary artery muscle cells. Am J Physiol, 1994;266(1 pt 2): H 365～70
8.Post JM, Hume JR, Archer SL, Weir EK. Direct role for potassium channel inhibition in hypoxic pulmonary vasconstriction. Am J Physiol, 1992; 262(4 pt 1): C 882～90
9.McManus OB. Calcium-activated potassium channels: regulation by calcium. J Bioenerg Biomembr, 1991;23(4):537～60, 百拇医药