当前位置: 首页 > 期刊 > 《苏州大学学报(医学版)》 > 2000年第9期
编号:10500297
β射线放射损伤后胶原代谢的变化

     作者:周迎会 徐岚 吴士良 张学光 陈列松

    单位:周迎会 徐岚 吴士良 张学光(苏州大学基础医学部,苏州,215007);陈列松(苏州大学附属第二医院)

    关键词:β射线;放射损伤;胶原代谢

    苏州医学院学报000903 摘要 目的 探讨β射线放射损伤后胶原代谢的改变情况。方法 采用直线加速器照射制作动物的β射线损伤模型,同时对NIH 3T3细胞进行β射线外照射,观察胶原总量及Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的改变;观察胶原降解酶MMPs-1活性变化;同时测定损伤后细胞因子TGF-β1、IL-6的变化情况。结果 β射线损伤后胶原总量变化不大,而Ⅰ型胶原含量下降,Ⅲ型胶原含量上升;MMPs-1活性上升;TGF-β1、IL-6表达量增加。结论 胶原代谢的变化在放射性皮肤损伤中起关键作用,TGF-β1、IL-6在损伤后胶原代谢的调控机制中起重要作用。

    中图法分类号 R977.9332

    Study of Collagen Metabolism after β Radiation Injury

    Zhou Yinghui, XuLan, Wu Shiliang, et al

    (Department of Basic Medicine,Suzhou University,Suzhou,215007)

    Abstract Objective To investigate the change of collagen metabolism and it's regulation after β radiation.Method The animal model of β radiation injury was established by the β radiation produced by the linear accelerator;and irradiated NIH 3T3 cells were studied.In the experiment the contents of total collagen,collagen type I and type Ⅲ were measured.The activity of MMPs-1 was tested.The contents of TGF-β1,IL-6 were also detected.Results After exposure to β radiation,little change was found in the content of total collagen,but the content of collagen I decreased and the content of collagen Ⅲ,MMPs-1 activity increased;the espression of TGF-β1,IL-6 increased.Conclusion The changes in the metabolism of collagen play an important role in the irradiated injury of the skin;TGF-β1 and IL-6 may be essential in the regulation of the collagen metabolism.

    Key words β-ray;radiation injury;collagen metabolism

    目前,国内外对β射线皮肤烧伤的研究发现,β射线对皮肤烧伤具有三大临床特点:一为反复发作的坏死性溃疡,由此导致植皮失败,是临床上棘手的问题;二为重度烧伤晚期恶性病变,极易引发皮肤癌的问题;三为放射性烧伤会造成剧烈疼痛的问题[1]。关于创面反复溃疡难以愈合的机制,有人[2]认为可能系局部血管损伤导致微循环障碍所致;亦有人[3,4]认为,创面组织胶原纤维受损,影响了胶原代谢,阻碍了组织修复。但胶原代谢受诸多因素调控,其具体的机理仍不明了。

    我们曾经进行γ射线皮肤烧伤的研究[5],发现放射性皮肤烧伤与胶原代谢变化有关。本研究采用直线加速器照射制作动物模型,同时照射NIH 3T3成纤维细胞,从胶原代谢的改变及调控因子情况的研究着手,探讨β射线放射损伤的机制,进一步为临床β放射性烧伤的救治提供理论依据。

    1 材料和方法

    1.1 主要试剂 羟脯氨酸测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;TGF-β1测定试剂盒为深圳晶美生物工程有限公司产品;IL-6测定试剂盒为法国Immunotech公司产品;3H-I型胶原蛋白委托嘉定核原子研究院合成;胶原底物由苏州大学基础医学部生化教研室纯化鉴定。

    1.2 实验动物及细胞 SD近交系大鼠由苏州大学基础医学部实验动物中心提供;NIH 3T3成纤维细胞由苏州大学基础医学部细胞免疫中心提供。

    1.3 方法

    1.3.1 实验动物分组与β射线放射损伤模型的建立 对照组(control):正常3月龄SD近交系大鼠,体重150±15g,10只;β损伤模型组(model):正常3月龄SD近交系大鼠,体重150±15g,40只,分4组,每组10只。用直线加速器进行β射线照射,剂量分别为5Gy、15Gy、30Gy、45Gy,照射后各饲养2.5个月,股动脉放血处死,分别取血、肝脏、心脏及照射处局部皮肤。

    1.3.2 血清及组织匀浆的制备 取出的血液置4℃,1h后以3000r/min冷冻离心5min,分离血清,置-20℃,进行各项指标测定。

    剪下的皮肤去毛,去脂肪,用冰冻生理盐水略洗,滤纸吸干,剪一半称重,剪碎,加入1ml预冷的磷酸盐缓冲液(pH7.2),4℃过夜,次日再加1ml冷PBS,用高速分散器制成匀浆。

    心脏、肝脏用冰冻生理盐水洗净血液,滤纸吸干,称重,剪碎,加入1ml预冷的PBS(pH7.2),静置30min,再加1ml冷PBS,用高速分散器制成匀浆。

    各组织匀浆分别用冷冻离心机3500r/min离心10min,上清液贮于-20℃,进行各项指标测定。

    1.3.3 实验细胞的处理 本校细胞免疫中心提供的NIH 3T3细胞,至对数生长期,β射线照射,分对照组(0Gy)、5Gy组、10Gy组及15Gy组。照射后继续培养,次日胰酶消化处理,收取细胞及其上清液,置-20℃。进行各项指标测定前,将细胞用含Triton X-100的细胞裂解液处理,再进行测定。共作8批。

    1.3.4 测定方法

    1.3.4.1 Ⅰ、Ⅲ型胶原的测定 取辐射部位皮肤,以Nagai[6]方法,用0.15mol/L pH3.5的柠檬酸盐缓冲液抽提酸溶性胶原,其中主要含有I型和Ⅲ型胶原,然后用溶于0.01mol/L乙酸的胃蛋白酶(4500U/mg)处理24h,去除非胶原蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[7]

    样品溶解液含50%甘油配制的0.05%溴酚蓝1滴、4mol/L尿素、1%SDS缓冲液,100℃处理样品3min。点样量30~100μl,蛋白含量每孔约10~30μg。电泳缓冲液为pH8.8、0.05mol/L Tris-Gly,染色,脱色后以岛津CS-930双波长扫描仪扫描并记录曲线,计算迁移率并计算、比较含量及比例。

    1.3.4.2 皮肤胶原总量的测定 按测定试剂盒说明书测定皮肤中羟脯氨酸的含量。根据羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色的原理,根据其呈色的深浅推算羟脯氨酸的含量,按公式求出被测样品的羟脯氨酸的含量,单位为羟脯氨酸μg/mg。计算公式如下。

    再由羟脯氨酸含量折算出皮肤中总胶原含量,公式为:

    1.3.4.3 受照组织及细胞基质金属蛋白酶-1活性的测定 取细胞、皮肤作为测试样本,加入3H-I型胶原蛋白共同温浴后,以3H-I型胶原蛋白降解的量(以液闪仪计数cpm值代表)表示酶活性。1h降解1μg3H-I型胶原蛋白为1个酶活性单位。

    计算公式为:

    1.3.4.4 TGF-β1含量测定[8] 采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒说明书测定样本中TGF-β1含量。操作步骤如下:(1)制作标准曲线的标准品浓度依此为0、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000pg/ml。(2)每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,作标准曲线。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

    1.3.4.5 IL-6的测定[8] 采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒说明书测定血清、皮肤及细胞上清中IL-6含量。制作标准曲线的标准品浓度依次为0、3.9、15.6、62.5、250、1000pg/ml。

    1.3.4.6 统计学处理 各数据均以±s表示,Excel进行ANOVA检验。

    2 结果

    2.1 β射线损伤模型的建立 采用电子直线加速器成功地建立了SD近交系大鼠的β损伤模型,其中45Gy产生Ⅱ°以上溃疡创面,为进一步利用此动物模型打下了基础。

    2.2 β射线损伤对Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及胶原总量的影响 从表1、图la、图lb可见,β损伤引起了Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量的显著变化,而胶原总量的变化则不大。图2显示Ⅰ型胶原的含量随辐射剂量的增加呈下降的趋势,而Ⅲ型胶原则呈上升的趋势。

    2.3 β射线损伤对基质金属蛋白酶-1活性的影响 在低剂量范围内(0~30Gy),MMPs-1的活性随照射剂量而上升,而高于一定剂量时,45Gy组显示MMPs-1活性反而下降,但仍高于正常组。β射线损伤对细胞的影响为:基本呈上升的趋势,但5Gy和10Gy组差别不大(表2,图3)。表1 不同剂量β辐射对胶原含量的影响(μg/mg,±s)

    0Gy

    5Gy

    10Gy

    15Gy

    30Gy

    45Gy

    P值

    Ⅰ型胶原

    1.43±0.10

    1.01±0.08

    -

    0.86±0.07

    0.67±0.07

    0.43±0.04

    <0.01

    Ⅲ型胶原

    0.17±0.01

    0.31±0.08

    -

    0.38±0.02

    0.32±0.01

    0.44±0.00

    <0.01

    胶原总量

    4.93±1.31

    4.79±0.74

    -

    4.26±0.79

    4.89±0.42

    4.10±0.20

    >0.05

    表2 不同剂量β辐射对MMPs-1活性的影响(±s)

    0Gy

    5Gy

    10Gy

    15Gy

    30Gy

    45Gy

    P值

    细胞(U/ml)

    11.34±1.54

    15.43±1.67

    14.92±2.07

    22.44±3.23

    -

    -

    <0.01

    皮肤(U/mg)

    16.03±2.06

    22.46±2.54

    -

    25.37±1.94

    31.54±4.61

    26.21±2.33

    <0.01

    2.4 β射线损伤对TGF-β1含量的影响 β射线损伤对受照动物的皮肤、血清及受照细胞上清液中TGF-β1含量的影响显著,心脏、肝脏中TGF-β1含量的变化不显著,细胞中TGF-β1的表达低于检测水平(表3)。皮肤中TGF-β1在0~30Gy时,基本呈上升趋势,30Gy和45Gy间基本持平(图4a),血清中TGF-β1的变化情况与皮肤基本相似,但45Gy时下降;受照细胞上清液中TGF-β1的变化情况为:0~10Gy时上升,10Gy、15Gy间上升趋势减弱(图4b)。

    2.5 β射线损伤对IL-6含量的影响 受照细胞的IL-6含量低于检测水平,β射线损伤对细胞上清液及受照动物皮肤、血清的IL-6均有显著影响(表4)。0~30Gy时,皮肤和血清的IL-6基本呈上升趋势,30~45Gy时基本持平。细胞上清液中IL-6亦呈上升趋势,只是在30~45Gy时上升趋势有所减弱(图5)。表3 不同剂量β辐射对TGF-β1含量的影响(±s)

    0Gy

    5Gy

    10Gy

    15Gy

    30Gy

    45Gy

    P值

    细胞上清(pg/ml)

    668.97±6.94

    689.51±32.38

    853.19±35.76

    885.26±40.53

    -

    -

    <0.01

    血清(pg/ml)

    2029.44±310.91

    2161.33±294.39

    -

    2475.00±411.30

    2775.00±287.23

    2425.00±275.38

    <0.01

    皮肤(pg/mg)

    28.27±2.40

    35.70±4.77

    -

    52.31±3.12

    59.39±2.17

    60.09±2.37

    <0.01

    肝脏(pg/mg)

    0.50±0.08

    1.27±0.62

    -

    1.01±0.32

    0.83±0.57

    1.20±0.40

    >0.05

    心脏(pg/mg)

    2.02±0.23

    1.80±0.01

    -

    1.96±0.07

    1.47±0.47

    1.95±0.93

    >0.05

    表4 不同剂量β辐射对IL-6含量的影响(±s)

    0Gy

    5Gy

    10Gy

    15Gy

    30Gy

    45Gy

    P值

    细胞上清(pg/ml)

    77.03±5.28

    98.53±6.87

    112.42±4.97

    117.92±3.94

    -

    -

    <0.01

    皮肤(pg/mg)

    23.75±2.21

    34.67±1.87

    -

    43.76±3.64

    53.48±3.14

    51.79±5.28

    <0.01

    血清(pg/ml)

    204.40±6.08

    210.66±11.57

    -

    227.64±8.45

    238.24±6.67

    234.85±6.06

    <0.01

    图1a 皮肤胶原变化的SDS-PAGE分析

    图1b 皮肤胶原含量变化的扫描分析

    图2 β辐射对胶原含量的影响

    图3 β辐射对MMPs-1活性的影响

    图4a β辐射对皮肤,心脏,肝脏TGF-β1含量的影响

    图4b β辐射对血清,细胞上清TGF-β1含量的影响

    图5 β辐射对IL-6含量的影响

    3 讨论

    本研究进一步证实,放射性皮肤损伤引起胶原含量的变化,且与受照剂量相关。在人体内胶原具有不同类型,皮肤含有Ⅰ、Ⅲ型和少见的Ⅴ型等几种型别,在成年动物或人类皮肤中,占70%左右的为Ⅰ型胶原,仅在胎儿期及创面受损或愈合时才会有较多的Ⅲ型胶原的合成[9]。放射性皮肤损伤对胶原总量的影响不大,主要影响了Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量,其基本趋势为:Ⅰ型含量下降,而Ⅲ型含量上升。同时,基质金属蛋白酶-1活性有所变化,提示两者之间有相关性。MMPs-1是胶原降解的主要酶,由成纤维细胞及血管内皮细胞分泌,其最适底物是Ⅰ型胶原,对Ⅲ型胶原也有作用。β射线损伤后,Ⅰ型胶原被降解,Ⅲ型胶原也有所降解,但一方面MMPs降解Ⅰ型胶原的速率大于Ⅲ型;另一方面,已有人证实创伤修复过程中,Ⅲ型胶原即胎儿型胶原会大量合成[10]。本实验提示,Ⅲ型胶原在创面修复期的合成超过了MMPs-1对其的降解。受照动物心脏、肝脏的TGF-β1含量的变化不显著,而皮肤、血清中的TGF-β1含量则有显著变化,这一结果提示,直线加速器造成的β射线损伤主要效应只是在受照的局部组织及全身血液。从皮肤的TGF-β1含量变化可见,5Gy、15Gy、30Gy剂量组之间基本呈上升的趋势,而30Gy、45Gy的剂量组之间变化不大,可能在低剂量组时,TGF-β1的表达是与剂量率呈正相关的,剂量率高于一定水平时,TGF-β1的表达则稳定在某一水平。再从辐射对NIH 3T3细胞的影响看,细胞中TGF-β1的表达量低于检测水平,细胞上清液的TGF-β1的表达量很多,验证了TGF-β1为一膜外分泌型蛋白。细胞上清的TGF-β1的变化与受照动物的情况相符,低剂量(0~10Gy)时,TGF-β1表达呈上升趋势,而高于一定水平时(10~15Gy),基本持平。IL-6水平的变化不如TGF-β1的改变显著,但其趋势基本一致。损伤引起较多的Ⅲ型胶原蛋白的合成,即主要影响了可溶性胶原特别是Ⅲ型胶原的含量,而对已成熟并老化交联的不溶性胶原影响不大。由此表明,胶原代谢的变化在放射性皮肤损伤中起到了关键作用。那么这种改变的机制如何?值得进一步探讨。有报道[11~16]认为,与TGF-β、IL-6等细胞因子有关。亦有人[17,18]认为与TGF-β的类型转换有关。还有人[19]认为与TGF的关系不大。我们的实验结果表明,TGF-β、IL-6等细胞因子与胶原代谢的调控有一定关系,但其调控在辐射后的应激反应、炎症反应及后期的慢性纤维化过程中到底有何作用,将是我们今后研究的一个方向。

    国防科工委国防预研基金课题(编号Y6920026-04)

    参考文献

    1,翁志根.皮肤放射损伤研究的现状和展望.中华放射与防护杂志,1996,16(4)∶218

    2,刘雁玲.β射线所致皮肤损伤的远期效应及疗效观察.中华放射与防护杂志,1996,16(2)∶126

    3,Millar WT.Repair kinetics in pig epidermis:an analysis based on two separate rates of repair.Int J Radiat Biol,1996,69(1)∶123

    4,Ruifork AC,Mason KA.Changes in the radiation sensitivity of mouse skin during fractionated and prolonged treatments.Radiat Res,1994,139∶334

    5,吴士良,王尉平,徐 岚,等.60Coγ射线局部外照射对组织胶原代谢的影响.中国核科技报告.北京∶原子能出版社,1998

    6,永井裕,藤本大本郎.コテグン实验法.东京∶东京讲谈社,1985∶31~40

    7,Ivan ME,Ruthard JA.Characterisation of left ventricular collagen in the rat.Cardiovascular Research,1983,17∶15

    8,巴德年.当代免疫学技术与应用.北京∶北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,1998∶439~469

    9,Bjorn RO,Marcel EN.Collagen IV∶molecular biology.USA∶CRC press,inc.1992∶3~15

    10,Andrew H,Kang MD.Collagen volume V pathobiochemistry.USA∶CRC press,inc.1992∶125

    11,Randall K,Coggle JE.Expression of transformin growth fator-beta 1 in mouse skin during the acute phase of radiation damage.Int J Radiat Biol,1995,68(3)∶301

    12,Kruse JJ,Bart CI,Visser A,et al.Changes in transforming growth factor-beta (TGF-beta 1),procollagen types I and Ⅱ mRNA in the rat hear after irradiation.Int J Radiat Biol,1999,75(11)∶1429~36

    13,Hauer-Jense M,Richter KK,Wang J,et al.Changes in transforming growth factor beta 1 gene expression and immunoreactivity levels during development of chronic radiation coteropathy.Radiat Res,1998,150(6)∶637

    14,Herskind C,Bamberg M,Rodemann HP.The role of cytokines in the development of normal-tissure reactions after radiotherapy.Strahlenther Onkol,1998,174∶12

    15,Uria JA,Jimenez MG,Balbin M,et al.Differential effects of transforming growth factor-beta on the expression of collagenase-1 and collagenase-3 in human fibroblasts.J Biol Chem,1998,273(16)∶9769

    16,Nakagawa S,Koomen CW,BOS JD,et al.Differential modulation of human epidermal langerhans cell maturation by ultraviolet B raidiation.J Immunol,1999,163(10)∶5192

    17,Zhao W,O'Malley Y,Wei S,et al.Irradiation of rat tubule epithelial cells alters the expression of gene products associated with the synthesis and degradation of extracellular matrix.Int J Radiat Biol,2000,76(3)∶391

    18,Wang J,Zheng H,Sung CC,et al.Cellular sources of transforming growth factor-beta isoforms in early and chronic radiation enteropathy.Am J Pathol,1998,153(5)∶1531

    19,Nyberg F,Fransson J,Stephansson E.Proliferation and effects of UVA irradiation in cultrued fibroblasts from lession in cutaneous lupus erpthematosus.Exp Dermatol,2000,9

    2000年7月14日收稿
    婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧潡鏌熺€电ǹ孝缂佽翰鍊濋弻锕€螣娓氼垱锛嗗┑鐐叉▕娴滄繈宕戦幇鐗堝仯闁搞儺浜滈惃鐑樸亜閿旇骞栭柍瑙勫灴閹晝绱掑Ο濠氭暘婵犵數鍋涢惇浼村磹濠靛鈧礁顫濋懜鐢靛姸閻庡箍鍎卞Λ娑㈠储閸楃偐鏀介柣鎰綑閻忋儳鈧娲﹂崜鐔奉嚕閹间礁围闁糕剝鍔掔花濠氭⒑閸愬弶鎯堥柛鐕佸亰瀹曘垽骞橀鐣屽幐闁诲繒鍋涙晶浠嬪煡婢舵劖鐓冮柦妯侯樈濡偓閻庤娲╃换婵嬪箖濞嗗浚鍟呮い鏂剧矙閻涘酣姊婚崒娆戭槮闁圭⒈鍋婅棟妞ゆ劧绠戦悿鐐節婵犲倸鎮╂繛鎴欏灩缁€鍐┿亜閺冨洤顥嶉柟鑺ユ礀閳规垿鎮欓弶鎴犱桓闁艰¥鍊濋弻锛勨偓锝庝邯閸欏嫰鏌i幙鍐ㄤ喊鐎规洖鐖兼俊鎼佹晝閳ь剟鎯冮幋锔解拺缂佸顑欓崕鎰版煙濮濆苯鍚圭紒顔碱儔楠炴帡寮崫鍕闂佹寧绻傜花鑲╄姳娴犲鐓曢柡鍐╂尵閻h鲸銇勯鍕殻濠碘€崇埣瀹曞崬螖閳ь剙岣块幋锔解拺缂佸顑欓崕鎰版煙閻熺増鍠樼€殿喛顕ч埥澶愬閳ュ厖姹楅柣搴ゎ潐濞叉牕煤閵忋倕鐒垫い鎺嶇缁楁艾菐閸パ嶈含鐎规洩绲惧鍕節閸屻倖缍嬮梻鍌欑閻ゅ洭锝炴径鎰瀭闁割煈鍠氶弳锕傛煕椤愶絾绀€闁绘挻锕㈤弻锝夊箛闂堟稑顫繛瀛樼矋閻熲晛顫忛搹瑙勫珰闁哄被鍎洪埀顒侇殘缁辨帡鎮╅懠顑呪偓瑙勬礃濞茬喎鐣烽敓鐘冲€风€广儱妫涢埥澶愭煃閽樺妯€濠殿喒鍋撻梺缁橈耿濞佳勬叏閿旀垝绻嗛柣鎰典簻閳ь剚鐗滈弫顕€骞掑婵嗘喘椤㈡盯鎮欓弶鎴斿亾閸洘鐓ラ柡鍐ㄥ€婚幗鍌涚箾閸粎鐭欓柡宀嬬秮楠炲洭顢楁担鍙夌亞闂備胶枪鐎涒晛顫忚ぐ鎺嬧偓鍐Ψ閳哄倸鈧兘鏌涘▎蹇fЦ闁哄濮撮—鍐Χ閸愩劎浠惧┑鈽嗗亜閸燁偊鎮鹃悜钘壩╅柍鍝勶攻閺咃綁姊虹紒妯哄婵炰匠鍥х缂佸绨遍弨浠嬫煟濡櫣浠涢柡鍡忔櫊閺屾稓鈧綆鍓欓埢鍫燁殽閻愬瓨宕屾い銏℃瀹曞崬螖閸愵亞鎽岄梻鍌欐祰椤曟牠宕规總鍛婂€堕柟閭﹀劒濞差亶鏁傞柛鏇ㄥ弾閸氬懘姊绘担铏瑰笡闁挎岸鏌涘锝呬壕缂傚倷鐒﹂〃鍛此囬棃娑辨綎婵炲樊浜滅粻浼村箹鏉堝墽鎮奸柣锝囨暬濮婃椽鎮烽弶鎸幮╁銈嗗灥椤︻垶鎮鹃悜鑺ュ仺缂佸娼¢崬璺衡攽閻橆喖鐒哄ù婊勭箓铻為柛鎰靛枛閺嬩線鏌涚仦鍓х煂濡炶濞婇幃妤呮晲鎼存繄鐩庢繝纰樷偓鐐藉仮婵﹦绮幏鍛村川婵犲啫鏋戦梻浣呵归鍥磻閵堝宓侀柟鐗堟緲缁狀噣鏌﹀Ο渚Ъ闁硅姤娲熷娲传閸曨剙鍋嶉梺鎼炲妼缂嶅﹪鎮伴鈧慨鈧柕鍫濇閸樻悂姊洪幖鐐插姉闁哄懏绋戦悺顓炩攽閻樻鏆柍褜鍓濈亸娆撴儗濞嗘挻鐓涚€光偓鐎n剛袦婵犳鍠掗崑鎾绘⒑鐎圭姵銆冮柤瀹犲煐缁傛帡鍩¢崘顏嗭紳闂佺ǹ鏈銊ョ摥闂備焦瀵уú锔界椤忓牊鍋樻い鏃傛櫕缁♀偓闂佹悶鍎崝宥呪枍閵忋倖鈷戠紓浣广€掗崷顓濈剨婵炲棙鎸婚崑顏堟煃瑜滈崜姘┍婵犲洦鍊锋い蹇撳閸嬫捇寮介鐐殿唶婵°倧绲介崯顐ゅ婵犳碍鐓熼柡鍌涘閹插憡銇勯埡鍐ㄥ幋闁哄瞼鍠栭獮宥夘敊绾拌鲸姣夐梻浣瑰▕閺€閬嶅垂閸ф钃熸繛鎴欏灪閺呮粓鎮归崶銊ョ祷缂佹鐭傚娲嚒閵堝懏鐎鹃梺闈╃稻濞兼瑧鍙呭銈呯箰鐎氣偓鐟滄棃寮诲☉銏犖ㄦい鏃€鍎崇敮銉モ攽閻愯泛浜归柛鐘崇墪椤繐煤椤忓嫮顦ㄩ梺鍛婄懃椤︿即宕曢幘缁樷拺闁荤喐婢橀弳杈ㄦ叏濮楀牆顩柟骞垮灩椤繈鎳滅喊妯诲濠电偠鎻徊浠嬪箠濞嗘帇浜归柟鐑樺灥閻濇ê顪冮妶鍡楃瑨闁稿﹤顭烽幆灞解枎閹惧鍘甸梺缁樺灦閿曗晛鈻撻弴銏$厱濠电姴鍊绘禒娑㈡煏閸パ冾伃鐎殿噮鍓熷畷褰掝敊鐟欏嫬鐦辩紓鍌欒兌閸嬫捇宕曢幎钘壩ч柟闂寸閽冪喖鏌ㄩ悢鍝勑㈢紒鈧崘顔界厪濠电偛鐏濋崝妤呮煕鐎n偅灏电紒顔界懇楠炴劖鎯旈姀銏☆潠濠电姷鏁告慨鐑藉极閸涘﹥鍙忔い鎾卞灩缁狀垶鏌涢幇闈涙灈缂佲偓鐎n喗鐓曟い顓熷灥娴滅偤鏌℃径濠勭Ш闁哄矉绲鹃幆鏃堝閳轰焦娅涢梻浣告憸婵敻鎮ч悩璇茬畺闁靛鏅滈崑鍌炲箹鏉堝墽绋绘繛鍫熷劤閳规垿顢欐慨鎰捕闂佺ǹ顑嗛幐鎼佸煘閹达箑鐒洪柛鎰典簼閹叉瑥顪冮妶蹇涙濠电偛锕璇测槈閵忕姷顔掗梺鍝勵槹閸ㄨ绂掗崫銉х=濞达綀娅g敮娑氱磼鐎n偅宕岄柛鈹惧亾濡炪倖甯婇懗鍫曞煀閺囩偟鏆嗛柨婵嗘噺閸嬨儵鏌熼姘拱缂佺粯绻堝畷鎴︽嚍閵夛富妫冮梺璇″枓閺呯姴鐣烽敐鍡楃窞閻庯綆浜濋悗楣冩⒒閸屾瑦绁版俊妞煎妿濞嗐垽鏁撻悩鏌ユ7闂佹寧绻傞ˇ顓㈠焵椤戣法绐旂€殿喗鎸虫慨鈧柍鈺佸暞閻濇洟姊绘担钘壭撻柨姘亜閿旇法鐭欓柛鈹惧亾濡炪倖甯婇懗鍫曞煡婢舵劖鐓冮悷娆忓閻忔挳鏌℃担鍝バх€规洜鍠栭、鏇㈡晬閸曨剙绀嬪┑鐘垫暩婵參骞忛崘顔煎窛妞ゆ梻鏅ぐ褏绱撻崒娆戣窗闁哥姵顨婇幃鐑芥晜閻愵剙搴婂┑鐘绘涧椤戝懘鎮欐繝鍥ㄧ厪濠电倯鍐ㄦ殭缂佺姷澧楃换婵嬫偨闂堟刀鐐烘煕閵娧冨付闁崇粯鏌ㄩ埥澶愬閳╁啯鐝栭梻渚€娼ч悧鍡浰囬姣垦囧蓟閵夛妇鍘搁梺鎼炲劗閺呮盯寮搁幋锔界厱婵炲棗绻掔粻濠氭煛瀹€瀣М闁诡喓鍨介幃鈩冩償濠靛棙鐎冲┑鐘殿暯濡插懘宕归鍫濈;闁瑰墽绮埛鎺懨归敐鍫澬撻柕鍡楀暟缁辨帡鍩€椤掍焦濯撮柧蹇撴贡閻撳姊洪崷顓℃闁哥姵顨婂畷鎴﹀煛閸屾粎鐦堥梻鍌氱墛娓氭宕曡箛鏇犵<闁逞屽墴瀹曟﹢鍩炴径鍝ョ泿婵$偑鍊栭幐楣冨窗鎼淬劍鍊堕柨婵嗩槹閻撴瑩鎮楅悽鐧诲綊宕㈢€涙ɑ鍙忓┑鐘插鐢盯鏌熷畡鐗堝櫧缂侇喚鏁搁埀顒婄秵娴滄繈鎮炬导瀛樷拻濞达絽鎲¢幉绋库攽椤旂偓鏆鐐村灴瀹曟儼顦撮柡鍡檮缁绘繈妫冨☉鍐插闂佹眹鍊愰崑鎾寸節閻㈤潧浠﹂柛銊ュ悑閵囨棃骞栨担鍝ユ煣闂佹寧绻傚ú銊у娴犲鐓曢悘鐐插⒔閹冲懘鏌涢弬璺ㄐ㈤柣锝嗙箞閺佹劙宕ㄩ闂存樊闂備胶纭堕弬鍌炲垂閽樺鍤曟い鏇楀亾鐎规洖銈搁幃銏ゅ传閸曨偆顔戦梻鍌氬€烽懗鍫曞箠閹炬椿鏁嬫い鎾卞灩绾惧潡鏌熺€电ǹ浠ч柣鐔活潐缁绘盯骞嬪▎蹇曚痪闂佺粯鎸诲ú鐔煎蓟閿熺姴纾兼慨妯哄綁閾忓酣姊洪崫鍕紨缂傚秳绶氬濠氬灳瀹曞洦娈曢柣搴秵閸撴盯鎯侀崼銉﹀€甸悷娆忓缁€鍐偨椤栨稑娴柨婵堝仜閳规垹鈧絽鐏氶弲锝夋⒑缂佹﹫鑰挎繛浣冲洨宓侀柍褜鍓涚槐鎾诲磼濮橆兘鍋撻幖浣哥9闁绘垼濮ら崐鍧楁煥閺囩偛鈧爼鍩€椤掆偓閸熸潙鐣烽妸銉桨闁靛牆鎳忛崰姗€鏌$仦鑺ヮ棞妞ゆ挸銈稿畷銊╊敍濮橆儷鏇炩攽閿涘嫬浜奸柛濠冪墱閺侇噣骞掑Δ鈧粣妤佹叏濮楀棗鍘崇紓鍌涘哺閺岀喖鏌囬敃鈧弸銈囩棯閹冩倯闁靛洤瀚板顕€宕惰濮规绱撴担鍝勑㈡い顓犲厴瀵濡搁妷銏℃杸闂佸壊鍋呯换鈧俊鍙夊姍濮婄儤娼幍顕呮М闂佸摜鍠愬ḿ娆撴偩閻戣棄绠抽柟鎼幗閸嶇敻姊洪崨濠庢畼闁稿鍋ら獮澶愬閵堝棌鎷绘繛杈剧秬濡嫰宕ラ悷鎵虫斀闁绘劏鏅涙禍鍓х磽閸屾艾鈧悂宕愯ぐ鎺撳殞濡わ絽鍟悡婵堚偓骞垮劚椤︿即寮查弻銉︾厱闁靛鍨哄▍鍥煟閹炬剚鍎旀慨濠冩そ瀹曟粓鎳犻鈧敮銉╂⒑閸濄儱校闁圭懓娲畷娲焵椤掍降浜滈柟鍝勭Ф椤︼妇绱掑Δ浣哥瑲闁靛洤瀚伴、鏇㈡晲閸モ晝鏉芥俊鐐€戦崹娲晝閵忋倕绠栭柍鍝勬媼閺佸啴鏌ㄥ┑鍡楊劉缂傚秴鐭傚濠氬磼濮橆兘鍋撴搴㈩偨婵﹩鍏楃紓姘辨喐瀹ュ洤寮查梻渚€娼ч悧鍡涘箖閸啔娲敂閸曞簶鏅犻弻宥嗘姜閹峰苯鍘¢梺鍛婃缁犳垿鈥旈崘顔嘉ч柛鈩冾殘閻熴劑姊虹粙娆惧剰婵☆偅绻傞锝夊Ω閳哄倸浜遍梺鍓插亖閸ㄥ顢欓弴鐔虹瘈闁靛骏绲剧涵鐐亜閹存繃鎼愰悡銈夋倵閻㈢數銆婇柛瀣尵閹叉挳宕熼鍌︾喘闂備焦鎮堕崝蹇旀叏閵堝棛鈹嶅┑鐘叉搐闁卞洭鏌¢崶鈺佷户闁稿﹦鍋ゅ娲濞淬劌缍婂畷鏇㈡倻濡警鍤ら梺鍝勬储閸ㄦ椽鎮¢悢鍏肩厽闁哄倹瀵ч幉鎼佹煟椤撶偠瀚版い顓″劵椤﹁櫕銇勯妸銉уⅵ鐎殿噮鍋婇、娆撳床婢跺顥堢€规洦浜畷姗€顢旈崱蹇旓紙濠电姷鏁告慨浼村垂婵傜ǹ鏄ラ柡宥庡幖缁€澶愭煛瀹ュ骸骞栫痪鎯ь煼閺屻劌鈹戦崱鈺傂ч梺缁樻尰濞茬喖寮婚弴鐔风窞婵☆垵娅f禒鈺侇渻閵堝倹娅撻柛鎾寸懇閸┿儲寰勯幇顒傤啋闂佽崵鍠愭竟鍡椥掗姀銏㈢=濞达絼绮欓崫娲偨椤栨侗娈斿畝锝堝劵缁犳稑鈽夊Ο婧炬櫇閹叉瓕绠涘☉娆忎患婵犻潧鍊搁幉锟犲煕閹寸姵鍠愰柣妤€鐗嗘穱顖涗繆椤愶絽鐏ラ柍瑙勫灴閹瑩鍩℃担宄邦棜闂傚倸鍊峰ù鍥敋閺嶎厼绐楁俊銈呭暙閸ㄦ繈鏌熼幑鎰靛殭缂佺姵婢橀埞鎴︽偐閹绘帗娈紓浣稿閸嬫盯鈥︾捄銊﹀磯闁惧繐婀辨导鍥р攽椤旂》鍔熼柛瀣尵閹广垹鈹戠€n偄浠洪梻鍌氱墛缁嬫劗鍒掔捄渚富闁靛牆妫欐径鍕煕濡湱鐭欐鐐茬墦婵℃悂鏁傞崫鍕凹闂備礁鎲¢崝鎴﹀礉瀹ュ憘锝夘敆閸曨兘鎷洪梺鍛婄箓鐎氼噣鍩㈡径鎰厱婵☆垱浜介崑銏⑩偓瑙勬礀缂嶅﹤鐣烽幒妤佸€烽悗鐢登圭敮鎯р攽閻樺灚鏆╅柛瀣枛瀹曟垿骞橀弬銉︾€洪梺绯曞墲缁嬫帡鎮¢弴銏″€甸柨婵嗗暙婵$厧鈹戦垾鐐藉仮婵☆偂鐒﹀鍕箛椤撶姴寮虫繝鐢靛█濞佳兾涘▎鎾抽棷鐟滅増甯楅悡娑㈡煕閳╁啰鎳冮柡瀣灥鑿愰柛銉戝秷鍚銈冨灪缁嬫垿锝炲┑瀣闁绘劏鏅涘宥呪攽閻樻剚鍟忛柛鐘崇墵閺佸啴濡烽妷顔藉瘜婵炲濮撮鍐焵椤戣法绐旂€殿喗鎸虫慨鈧柍鈺佸暞閻濇娊姊绘担铏广€婇柛鎾寸箞閹兘鏁冮崒銈嗘櫍婵犵數濮电喊宥夊煕閹烘嚚褰掓晲閸噥浠╅柣銏╁灡閻╊垶寮婚悢鍝勬瀳闁告鍋樼花浠嬫⒑閻熸壆鐣柛銊ョ秺閸╃偤骞嬮悩顐壕闁挎繂楠告晶顔剧磼娓氬﹦鐣甸柡宀嬬稻閹棃顢涘⿰鍛咃綁姊洪崫銉バi柣妤佺矌閸掓帗绻濆顓熸珳闂佺硶鍓濋悷褔鎯侀崼鐔虹瘈闁汇垽娼у瓭闂佺ǹ锕ラ幃鍌炪€侀弮鍫晝闁挎梻鏅崢鐢告⒑閸濆嫷鍎涢柛瀣閹便劑宕掑☉娆忓伎婵犵數濮撮崯顖炲Φ濠靛浂娈介柣鎰綑婵牓鏌熼娑欘棃闁轰焦鍔欏畷鎺戔槈鏉堛劎绉鹃梻鍌氬€搁崐椋庣矆娓氣偓楠炴牠顢曢敂钘変罕濠电姴锕ら悧鍡欑矆閸儲鐓熼柡鍐ㄧ墱濡垿鏌¢崱顓犵暤闁哄矉缍侀幃銏㈢矙濞嗙偓顥撻梻浣稿閸嬫帗绂嶉鍫濊摕婵炴垯鍨归崡鎶芥煏婵炲灝鍔氶悗娑崇到閳规垿鎮欑€涙ḿ绋囬柣搴㈠嚬閸撶喖鍨鹃弮鍫濈妞ゆ柨妲堣閺屾盯鍩勯崘鐐暭闂佽崵鍠愰崝娆忣潖閾忓湱纾兼俊顖涙そ閸ゅ绱撴担鍝勑i柟鍛婃倐椤㈡岸鏁愭径濠勵唴缂備焦绋戦鍡涘疾濠婂牊鈷戦柛鎾村絻娴滅偤鏌涢悩铏磳鐎规洏鍨介弻鍡楊吋閸″繑瀚奸梻浣藉吹閸犳挻鏅跺Δ鍛畾闁割偁鍨荤壕鐓庮熆鐠轰警鍎愮紓宥嗗灴閺岋綁鏁愰崶銊︽瘓閻庤娲栧畷顒勫煡婢跺ň鏋庨柟瀛樼箓缁楁岸姊洪懡銈呮瀾缂侇喖绉堕崚鎺楀箻瀹曞洦娈惧┑鐘诧工閸犳艾岣块埡鍌樹簻闁圭儤鍩堝Σ褰掓煕瀹ュ洦鏆慨濠冩そ濡啫霉閵夈儳澧︾€殿喗褰冮オ浼村醇濠靛牞绱遍梻浣呵归惉濂稿磻閻愮儤鍋傞柕澶嗘櫆閻撶喖鏌¢崒娑橆嚋闁诡垰鐗忛埀顒佺⊕缁诲牓寮婚敐澶嬪亜闁告縿鍎查崵鍌滅磽娴e搫校闁圭懓娲幃浼搭敋閳ь剙顕f禒瀣垫晣闁绘劖顔栭崯鍥ㄤ繆閻愵亜鈧牠骞愭ィ鍐ㄧ;闁绘柨鎽滈々閿嬨亜閺嶃劎鐭岀痪鎹愭闇夐柨婵嗘缁茶霉濠婂懎浜剧紒缁樼箞婵偓闁挎繂妫涢妴鎰版⒑閹颁礁鐏℃繛鍙夌箞婵$敻骞囬弶璺唺闂佺懓顕刊顓炍i鐐粹拻濞达絽鎳欓崷顓熷床婵°倕鎳庣壕濠氭煙闁箑鍘撮柡瀣閺屾洟宕煎┑鎰ч梺鎶芥敱閸ㄥ湱妲愰幘瀛樺閻犳劦鍨崇槐鎵磽娴e搫校闁绘濞€瀵鏁愭径濠勫幐婵犵數濮撮崐缁樼閳哄懏鈷戝ù鍏肩懅閹ジ鏌涜箛鏃撹€跨€殿噮鍋婇獮妯肩磼濡桨姹楅梻浣藉亹閳峰牓宕滈敃鈧嵄濞寸厧鐡ㄩ埛鎺懨归敐鍫燁棄濞存粌缍婇弻宥呯暋閹殿喖鈪甸悗瑙勬礃缁矂锝炲┑鍥风矗婵犻潧娲﹀▍鎾绘⒒娴d警鏀伴柟娲讳邯濮婁粙宕熼姘卞幈闂佺鎻梽鍕磻閿濆鐓曢柕澶樺灣瀹€娑㈡煕鐎n偅宕岄柟鐓庣秺椤㈡洟濡堕崟顓熷瘻闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炲鏁撻悩鑼舵憰闂侀潧饪电€靛苯鈻撴禒瀣厵闂傚倸顕ˇ锕傛煟閹惧绠為柡宀€鍠栭獮鎴﹀箛闂堟稒顔勭紓鍌欒兌婵绱炴笟鈧濠氭晲婢跺﹦鐤€濡炪倖鎸鹃崰鎾剁矙閸パ屾富闁靛牆鎳庨銏ゆ煙閸涘﹥鍊愰柛鈺冨仱楠炲鏁傞挊澶夋睏闂佽崵濮村▔褔宕樿閻姊婚崒娆戭槮闁硅姤绮撳畷鎶藉Ψ閳轰礁鐎梺鍓插亝濞叉粌鐣垫笟鈧弻娑㈠焺閸愵亖妲堢紒鐐劤閸氬骞堥妸鈺傛櫜閹肩补鈧磭顔愮紓鍌氬€哥粔鎾晝椤忓牏宓侀柛鎰靛枛閻撴盯鏌涘☉鍗炲箻妞ゆ柨鐭傚娲捶椤撶偛濡虹紓浣筋嚙閸婅绌辨繝鍥ㄧ叆閻庯綆鍓涢惁鍫ユ⒑濮瑰洤鐏叉繛浣冲棌鍙撮梻鍌欒兌鏋い鎴濇楠炴垿宕堕鈧拑鐔兼煟閺傝法娈遍柡瀣閺屾盯鈥﹂幋婵囩亶闂佽绻戦幐鍓ф閹烘挶鍋呴柛鎰典簽閺嗩偆绱撴担鍝勑i柣妤冨Т椤曪絾绻濆顓炰簻闁荤偞绋堥埀顒€鍘栨竟鏇㈡⒑濮瑰洤鐏繛鍛劦閹兘鎮ч崼鐔烘闂傚倷娴囧畷鐢稿窗閹邦喖鍨濋幖娣灪濞呯姵淇婇妶鍛櫤闁稿鍊块弻銊╂偄閸濆嫅銏ゆ煢閸愵亜鏋戠紒缁樼洴楠炲鈻庤箛鏇氭偅缂傚倷鑳舵慨鍨箾婵犲洤钃熼柨鐔哄Т绾惧吋鎱ㄥΟ鍧楀摵闁汇劍鍨垮娲传閸曢潧鍓伴梺鐟板暱闁帮綁宕洪悙鍝勭闁挎棁妫勯埀顒傚厴閺屾稑鈻庤箛锝喰﹀┑鐐叉嫅缂嶄礁顫忕紒妯诲缂佸娉曢惄搴g磽娴h棄鐨洪柛瀣尵缁碍娼忛妸褏鐦堥梺鎼炲劀閸滀礁鏅┑锛勫亼閸婃牕螞娴h鍙忛柕鍫濇噳閺嬪秹鏌曡箛瀣偓鏍煕閹达附鍋i柟顓熷笒婵″吋绻涢崨顔煎闁哄瞼鍠栧畷娆撳Χ閸℃浼�

   闂傚倸鍊搁崐宄懊归崶顒夋晪鐟滃秹婀侀梺缁樺灱濡嫰寮告担绯曟斀闁绘ê鐤囨竟妯肩棯閹规劦鍤欓柍瑙勫灴閹晠宕f径瀣€风紓鍌欑劍閸旀牠銆冩繝鍥ц摕闁跨喓濮撮悙濠囨煃鏉炴壆鍔嶉柣蹇庣窔濮婂搫鐣烽崶銊ユ畬缂備礁顦伴幐鎶藉春閻愬搫绠i柨鏃囨娴滃綊姊洪崨濠勬噧妞わ缚鍗抽獮鍐ㄢ枎韫囧﹥鏂€闂佸疇妫勫Λ妤佺濠靛鐓ラ柡鍥悘鑼偓娈垮枦椤曆囧煡婢舵劕顫呴柣妯荤墦閸旀垿寮婚弴锛勭杸濠电姴鍊搁埛澶愭⒑缂佹ḿ绠栭柣妤冨█楠炲啫鐣¢幍鍐茬墯闂佸憡鍔戦崝搴ㄦ儎鎼淬劍鈷戦柣鐔告緲濞堚晠鏌熼崙銈嗗  闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌ら崫銉︽毄濞寸姵姘ㄧ槐鎾诲磼濞嗘帒鍘$紓渚囧櫘閸ㄥ爼濡撮崘顔煎窛闁哄鍨归崢娲倵楠炲灝鍔氭い锔诲灦瀹曪繝骞庨懞銉у帾闂婎偄娲﹀ú鏍ㄧ墡闂備浇顕х€垫帡宕滈悢濂夋綎闁惧繐婀辩壕鍏间繆椤栨碍鎯堟い顐㈤叄濮婅櫣绮欑捄銊︽闂佺ǹ锕ョ换鍌炴偩閻戣棄鍗抽柣鎰仛濞堟洟姊洪崨濠冨闁告挻鐩畷銏$鐎n偀鎷洪梻渚囧亝缁嬫垵鐣甸崱妯肩濞达絽鍟跨€氼厼鈻嶉悩鐐戒簻闁哄倹顑欏ḿ鐔访瑰⿰鍕煉妤犵偞鐗犻獮鏍敇閻愬吀鐢婚梺璇插閻旑剟骞忛敓锟�  闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹瀹勬噴褰掑炊瑜忛弳锕傛煕椤垵浜濋柛娆忕箻閺屸剝寰勭€n亝顔呭┑鐐叉▕娴滄粌娲块梻浣规偠閸庤崵寰婇懞銉ь洸闁绘劦鍓氶崣蹇斾繆椤栨粌甯堕悽顖氱埣閺岋綀绠涢妷鈺傤€嶉梺闈涙搐鐎氱増鎱ㄩ埀顒勬煥濞戞ê顏柛锝嗘緲铻栭柣姗€娼ф禒婊勩亜閹存繍妯€鐎殿噮鍋婂畷姗€顢欓懖鈺佸Е婵$偑鍊栫敮鎺楀磹婵犳碍鍎楅柛鈩冪⊕閻撴洟鏌¢崶銉ュ闁诲骏绻濋弻锝夊箻鐠虹儤鐎炬繛锝呮搐閿曨亪銆佸☉妯锋斀闁归偊鍓氶鍕磽閸屾瑦绁伴悘蹇d簻閻g兘鎮介崹顐綗闂佸湱鍋撻崜姘跺触鐎n喚鍙撻柛銉e妽閻撱儲銇勮箛銉﹀  闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌涢锝嗙缂佺姷濞€閺岀喖骞戦幇闈涙闁荤喐鐟辩粻鎾诲箖濡ゅ懏鏅查幖绮光偓鎰佹交闂備焦鎮堕崝宥囨崲閸儳宓侀柡宥庣仈鎼搭煈鏁嗛柍褜鍓氭穱濠囨嚃閳哄啯锛忛梺璇″瀻娴i晲鍒掗梻浣告惈閺堫剙煤濡吋宕叉繛鎴欏灪閸婇攱銇勯幒宥堝厡鐟滄澘鎳樺缁樻媴閸涘﹤鏆堝銈冨妼濡瑧鎹㈠☉娆戠瘈闁搞儜鍡樻啺闂備焦鏋奸弲娑㈠疮椤愩倖顐介柣鎰劋閸婄敻鏌ㄥ┑鍡欏嚬缂併劋绮欓弻娑㈠籍閸嬪啿缍婇崺鐐哄箣閿曗偓閻擄繝鏌涢埄鍐炬畼濞寸厧鐗撳娲偡閺夋寧顔€闂佺懓鍤栭幏锟�