Sandwich ELISA法测定NF-κB
郭甫坤 李亦蕾 吴曙光
摘 要 目的 建立一种操作简便、安全的核因子-κB(NF-κB)活性检测方法。 方法 采用夹心酶联免疫吸附测试法(Sandwich ELISA)，酶标仪，验证NF-κB活化的抑制剂反义白介素-1受体相关激酶-2 (IRAK-2)寡核苷酸和N-α-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone(TLCK)对NF-κB活性的抑制作用。结果 Sandwich ELISA测定结果表明，与对照组相比，用不同浓度反义IRAK-2寡核苷酸(1， 2， 3， 4 μg )或TLCK (1，10，100 μmol.L-1 )处理细胞后， NF-κB活化受到不同程度的抑制， 表现为吸光度值下降的幅度不同。 结论 Sandwich ELISA法可用于NF-κB活性检测。
, 百拇医药
关键词：核因子-κB 酶联免疫吸附测定
转录因子核因子-κB(NF-κB ) 通过调控相关基因表达影响疾病的发生、发展。一个典型的例子就是NF-κB调控炎症细胞因子白介素-1(IL-1 )刺激炎症介质细胞间粘附分子、单核细胞趋化蛋白以及环氧合酶-2(COX-2 )表达[1～3]。因此, 测定NF-κB活化情况对探讨疾病的发生机制和疾病的防治具有重要意义。NF-κB的传统测定方法凝胶迁移率电动分析 (EMSA) 以同位素标记的NF-κB特异性寡核苷酸为探针, 检测NF-κB的DNA结合活性〔3〕。该法虽灵敏度高但要采用对人体有较大危害性的同位素标记且操作繁琐, 所以我们建立了夹心酶联免疫吸附测试法(Sandwich ELISA) 测定反义白介素-1受体相关激酶-2 (IRAK-2)寡核苷酸和N-α-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK)对NF-κB活化的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料 DMEM和lipofectin从Gibco BRL公司购买。IL-1 β由北京邦定生物医学公司提供。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体(抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基羧基末端) 和兔NF-κB p65 亚基特异性抗体(抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基氨基末端) 由美国Santa CruZ 生物技术公司生产。绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG购自河南华美生物工程公司。TLCK为Boehringer Mannheim公司产品。450型ELISA酶标仪由Biorad公司制造。
1.2 人脐静脉内皮细胞的分离与培养[4] 脐静脉用PBS冲洗数次(尽可能洗去红细胞), 灌入体积分数为0.0025胰酶消化10 min, 细胞经离心后用含体积分数为20%的胎牛血清的DMEM重悬, 调整细胞浓度至5×108*L-1, 按每孔200 μl接种于96孔细胞培养板, 37℃, 0.05 CO2条件下培养1 d后更换培养基, 以后每2 d换1次液, 至细胞长满皿底。
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1.3 反义IRAK-2寡核苷酸转染培养的人脐静脉内皮细胞
1.3.1 反义IRAK-2寡核苷酸的合成及序列 反义IRAK-2寡核苷酸由上海Sangon Ltd合成。寡核苷酸的5端和3端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。序列如下: 5-GTAGATGTAGCAGGCCAT-3。
1.3.2 Lipofectin 包裹寡核苷酸的制备 参照lipofectin说明书操作。
1.3.3 寡核苷酸转染人脐静脉内皮细胞 汇合成片的细胞用IL-1β 1×105 U*L-1刺激30 min, 洗去IL-1β后加入lipofectin包裹的反义IRAK-2寡核苷酸孵育8 h, 洗去反义寡核苷酸, IL-1β刺激1 h。
1.4 TLCK处理细胞 在培养基中同时加入IL-1β 1×105 U*L-1和实验浓度的TLCK培养1 h。
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1.5 提取核蛋白 按Rovin等[2]的方法进行提取。
1.6 Sandwich ELISA法测定 山羊NF-κB p65亚基特异性抗体3 mg*L-1包被酶联板, 每孔100 μl, 4 ℃过夜。PBS洗5次后加0.01 BSA (每孔100 μl ), 4 ℃ 封闭过夜。洗去未结合的BSA, 加入经1∶500稀释的待测样品(每孔100 μl), 37℃保温2 h。 洗去未结合的样品, 每孔加100 μl 经1∶500稀释的兔NF-κB p65亚基特异性抗体, 37℃保温2 h。洗去未结合的抗体, 每孔加100 μl 经1∶1 000稀释的HRP标记抗体, 37℃保温2 h。洗去未结合的酶标抗体, 加OPD 2 mmol*L-1 (含H2O2，占总体积的0.006%，每孔100 μl), 37℃保温1 h。反应用柠檬酸2 mol*L-1(每孔50 μl ) 终止。测量450 nm处的吸光度值。实验设立山羊NF-κB p65亚基特异性抗体和兔NF-κB p65亚基特异性抗体 对照组以及BSA无关对照组。每份样品做3个复孔。
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1.7 数据分析 实验数据以X±s表示, 采用t检验进行统计学分析。
2 结果
没有经反义IRAK-2寡核苷酸或TLCK处理的细胞， Sandwich ELISA测定的NF-κB吸光度值分别为1.295±0.031和2.025±0.000。用不同浓度反义IRAK-2寡核苷酸(1， 2， 3， 4 μg )或TLCK(1，10，100 μmol*L-1)处理细胞后， NF-κB活化受到不同程度的抑制，表现为吸光度值下降的幅度不同(见表1)。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体和兔NF-κB p65亚基特异性抗体对照组的吸光度值为0.001 ±0.001, 说明两抗体之间无交叉反应。另外，BSA无关对照的吸光度值为0.002±0.001。上述结果表明， Sandwich ELISA是一种可靠的NF-κB活性测定方法。
Tab 1 The effects of antisense IRAK-2 oligonucleotide and TLCK on
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NF-κB activation detected by Sandwich ELISA(X±s，n=3)
Inhibitors
NF-κB /A450 nm
Antisense IRAK-2 oligonucleotide/μg
0
1.295±0.031
1
0.800±0.008**
2
0.597±0.005**
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3
0.464±0.002**
4
0.516±0.001**
TLCK /μmol*L-1
0
2.025±0.000
1
1.827±0.079#
10
1.528±0.010##
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100
0.734±0.006##
**P<0.01 vs no antisense IRAK-2 oligonucleotide; #P<0.05, ##P<0.01 vs no TLCK 3 讨论
该文首次建立了NF-κB的Sandwich ELISA测试法。相对凝胶迁移率电动分析而言, Sandwich ELISA测量法具有操作简便、直接半定量、安全等优点。 运用此方法, 作者成功地验证了反义IRAK-2寡核苷酸和TLCK对IL-1刺激的NF-κB活化的抑制作用。
IRAK-2是IL-1信号通路中一个重要的早期调节因子,为IL-1激活NF-κB所必需[5]。因此, 用反义IRAK-2寡核苷酸抑制IRAK-2表达势必引起NF-κB活化的抑制。此推断为本研究结果所证实。
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细胞处于静息状态时, NF-κB在细胞浆中与其抑制蛋白IκB结合在一起。当受到外界信号刺激后, IκB 发生磷酸化并随之降解, NF-κB因而被释放进入细胞核, 调控基因转录。TLCK是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂, 以往研究认为, 它能抑制IκB降解从而抑制NF-κB活化[3]。Sandwich ELISA测定结果显示, TLCK呈浓度依赖地抑制NF-κB活化, 与有关报道一致。
总之, 我们建立的用于测定NF-κB 的Sandwich ELISA法被证明行之有效, 是一种值得推广的方法。
作者简介：郭甫坤，男，27岁，博士研究生；
吴曙光，男，46岁，教授，博士生导师，主要从事免疫药理学研究
郭甫坤(第一军医大学药物研究所，广州 510515)
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李亦蕾(第一军医大学药物研究所，广州 510515)
吴曙光(第一军医大学药物研究所，广州 510515)
参考文献
1.郭广杰,王海燕. 核因子-κB调控白细胞介素1β刺激人肾小球系膜细胞表达细胞间粘附分子. 中华医学杂志,1998;78(4):290～2
2.Rovin BH, Deckerson JA, Tan LC et al. Activation of nuclear factor-κB correlates with MCP expression by human mesangial cells. Kidney Int, 1995; 48:1263～71
3.DAcquisto F, Iuvone T, Rombola L et al. Involvement of NF-κB in the regulation of cyclooxygenase-2 protein expression in LPS-stimulated J774 macrophages. FEBS Lett, 1997; 418:175～8
4.Minter AJ, Keoshkerian E, Chesterman C et al. Fibroblast growth factor and heparin protect enothelial cells from the effects of interleukin 1. J Cell Physiol, 1996; 167: 229～37
5.Muzio M, Ni J, Feng P et al. IRAK (Pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling. Science, 1997; 278:1612～5, http://www.100md.com
摘 要 目的 建立一种操作简便、安全的核因子-κB(NF-κB)活性检测方法。 方法 采用夹心酶联免疫吸附测试法(Sandwich ELISA)，酶标仪，验证NF-κB活化的抑制剂反义白介素-1受体相关激酶-2 (IRAK-2)寡核苷酸和N-α-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone(TLCK)对NF-κB活性的抑制作用。结果 Sandwich ELISA测定结果表明，与对照组相比，用不同浓度反义IRAK-2寡核苷酸(1， 2， 3， 4 μg )或TLCK (1，10，100 μmol.L-1 )处理细胞后， NF-κB活化受到不同程度的抑制， 表现为吸光度值下降的幅度不同。 结论 Sandwich ELISA法可用于NF-κB活性检测。
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关键词：核因子-κB 酶联免疫吸附测定
转录因子核因子-κB(NF-κB ) 通过调控相关基因表达影响疾病的发生、发展。一个典型的例子就是NF-κB调控炎症细胞因子白介素-1(IL-1 )刺激炎症介质细胞间粘附分子、单核细胞趋化蛋白以及环氧合酶-2(COX-2 )表达[1～3]。因此, 测定NF-κB活化情况对探讨疾病的发生机制和疾病的防治具有重要意义。NF-κB的传统测定方法凝胶迁移率电动分析 (EMSA) 以同位素标记的NF-κB特异性寡核苷酸为探针, 检测NF-κB的DNA结合活性〔3〕。该法虽灵敏度高但要采用对人体有较大危害性的同位素标记且操作繁琐, 所以我们建立了夹心酶联免疫吸附测试法(Sandwich ELISA) 测定反义白介素-1受体相关激酶-2 (IRAK-2)寡核苷酸和N-α-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK)对NF-κB活化的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料 DMEM和lipofectin从Gibco BRL公司购买。IL-1 β由北京邦定生物医学公司提供。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体(抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基羧基末端) 和兔NF-κB p65 亚基特异性抗体(抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基氨基末端) 由美国Santa CruZ 生物技术公司生产。绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG购自河南华美生物工程公司。TLCK为Boehringer Mannheim公司产品。450型ELISA酶标仪由Biorad公司制造。
1.2 人脐静脉内皮细胞的分离与培养[4] 脐静脉用PBS冲洗数次(尽可能洗去红细胞), 灌入体积分数为0.0025胰酶消化10 min, 细胞经离心后用含体积分数为20%的胎牛血清的DMEM重悬, 调整细胞浓度至5×108*L-1, 按每孔200 μl接种于96孔细胞培养板, 37℃, 0.05 CO2条件下培养1 d后更换培养基, 以后每2 d换1次液, 至细胞长满皿底。
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1.3 反义IRAK-2寡核苷酸转染培养的人脐静脉内皮细胞
1.3.1 反义IRAK-2寡核苷酸的合成及序列 反义IRAK-2寡核苷酸由上海Sangon Ltd合成。寡核苷酸的5端和3端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。序列如下: 5-GTAGATGTAGCAGGCCAT-3。
1.3.2 Lipofectin 包裹寡核苷酸的制备 参照lipofectin说明书操作。
1.3.3 寡核苷酸转染人脐静脉内皮细胞 汇合成片的细胞用IL-1β 1×105 U*L-1刺激30 min, 洗去IL-1β后加入lipofectin包裹的反义IRAK-2寡核苷酸孵育8 h, 洗去反义寡核苷酸, IL-1β刺激1 h。
1.4 TLCK处理细胞 在培养基中同时加入IL-1β 1×105 U*L-1和实验浓度的TLCK培养1 h。
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1.5 提取核蛋白 按Rovin等[2]的方法进行提取。
1.6 Sandwich ELISA法测定 山羊NF-κB p65亚基特异性抗体3 mg*L-1包被酶联板, 每孔100 μl, 4 ℃过夜。PBS洗5次后加0.01 BSA (每孔100 μl ), 4 ℃ 封闭过夜。洗去未结合的BSA, 加入经1∶500稀释的待测样品(每孔100 μl), 37℃保温2 h。 洗去未结合的样品, 每孔加100 μl 经1∶500稀释的兔NF-κB p65亚基特异性抗体, 37℃保温2 h。洗去未结合的抗体, 每孔加100 μl 经1∶1 000稀释的HRP标记抗体, 37℃保温2 h。洗去未结合的酶标抗体, 加OPD 2 mmol*L-1 (含H2O2，占总体积的0.006%，每孔100 μl), 37℃保温1 h。反应用柠檬酸2 mol*L-1(每孔50 μl ) 终止。测量450 nm处的吸光度值。实验设立山羊NF-κB p65亚基特异性抗体和兔NF-κB p65亚基特异性抗体 对照组以及BSA无关对照组。每份样品做3个复孔。
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1.7 数据分析 实验数据以X±s表示, 采用t检验进行统计学分析。
2 结果
没有经反义IRAK-2寡核苷酸或TLCK处理的细胞， Sandwich ELISA测定的NF-κB吸光度值分别为1.295±0.031和2.025±0.000。用不同浓度反义IRAK-2寡核苷酸(1， 2， 3， 4 μg )或TLCK(1，10，100 μmol*L-1)处理细胞后， NF-κB活化受到不同程度的抑制，表现为吸光度值下降的幅度不同(见表1)。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体和兔NF-κB p65亚基特异性抗体对照组的吸光度值为0.001 ±0.001, 说明两抗体之间无交叉反应。另外，BSA无关对照的吸光度值为0.002±0.001。上述结果表明， Sandwich ELISA是一种可靠的NF-κB活性测定方法。
Tab 1 The effects of antisense IRAK-2 oligonucleotide and TLCK on
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NF-κB activation detected by Sandwich ELISA(X±s，n=3)
Inhibitors
NF-κB /A450 nm
Antisense IRAK-2 oligonucleotide/μg
0
1.295±0.031
1
0.800±0.008**
2
0.597±0.005**
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3
0.464±0.002**
4
0.516±0.001**
TLCK /μmol*L-1
0
2.025±0.000
1
1.827±0.079#
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1.528±0.010##
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0.734±0.006##
**P<0.01 vs no antisense IRAK-2 oligonucleotide; #P<0.05, ##P<0.01 vs no TLCK 3 讨论
该文首次建立了NF-κB的Sandwich ELISA测试法。相对凝胶迁移率电动分析而言, Sandwich ELISA测量法具有操作简便、直接半定量、安全等优点。 运用此方法, 作者成功地验证了反义IRAK-2寡核苷酸和TLCK对IL-1刺激的NF-κB活化的抑制作用。
IRAK-2是IL-1信号通路中一个重要的早期调节因子,为IL-1激活NF-κB所必需[5]。因此, 用反义IRAK-2寡核苷酸抑制IRAK-2表达势必引起NF-κB活化的抑制。此推断为本研究结果所证实。
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细胞处于静息状态时, NF-κB在细胞浆中与其抑制蛋白IκB结合在一起。当受到外界信号刺激后, IκB 发生磷酸化并随之降解, NF-κB因而被释放进入细胞核, 调控基因转录。TLCK是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂, 以往研究认为, 它能抑制IκB降解从而抑制NF-κB活化[3]。Sandwich ELISA测定结果显示, TLCK呈浓度依赖地抑制NF-κB活化, 与有关报道一致。
总之, 我们建立的用于测定NF-κB 的Sandwich ELISA法被证明行之有效, 是一种值得推广的方法。
作者简介：郭甫坤，男，27岁，博士研究生；
吴曙光，男，46岁，教授，博士生导师，主要从事免疫药理学研究
郭甫坤(第一军医大学药物研究所，广州 510515)
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李亦蕾(第一军医大学药物研究所，广州 510515)
吴曙光(第一军医大学药物研究所，广州 510515)
参考文献
1.郭广杰,王海燕. 核因子-κB调控白细胞介素1β刺激人肾小球系膜细胞表达细胞间粘附分子. 中华医学杂志,1998;78(4):290～2
2.Rovin BH, Deckerson JA, Tan LC et al. Activation of nuclear factor-κB correlates with MCP expression by human mesangial cells. Kidney Int, 1995; 48:1263～71
3.DAcquisto F, Iuvone T, Rombola L et al. Involvement of NF-κB in the regulation of cyclooxygenase-2 protein expression in LPS-stimulated J774 macrophages. FEBS Lett, 1997; 418:175～8
4.Minter AJ, Keoshkerian E, Chesterman C et al. Fibroblast growth factor and heparin protect enothelial cells from the effects of interleukin 1. J Cell Physiol, 1996; 167: 229～37
5.Muzio M, Ni J, Feng P et al. IRAK (Pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling. Science, 1997; 278:1612～5, http://www.100md.com