快速老化小鼠—— 研究衰老及衰老相关疾病的动物模型
快速老化小鼠—— 研究衰老及衰老相关疾病的动物模型
聂伟 张永祥
摘 要 快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse, SAM)分为快速老化亚系(Senescence accelerated mouse/prone, SAMP)及抗快速老化亚系(Senescence accelerated mouse/resistance, SAMR)。由日本京都大学首次培育成功，目前共有12个亚系，不同亚系具有不同的病理表现型，其中许多具有与人类衰老相似的病理学特征。人类许多老年性疾病如肺泡扩张、骨质疏松、骨关节疾病、学习记忆功能障碍、情感紊乱(抑郁)、白内障、听觉障碍、脑萎缩、免疫缺陷等在SAMP不同亚系上均有不同程度的体现，而SAMR亚系的各项生理指标及生存期限与正常动物相似。因此，SAM(SAMP、SAMR)为探讨衰老及衰老相关疾病的发生机制，评价药效及其作用机制提供了良好的动物模型。
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关键词：快速老化小鼠 衰老 动物模型
1 概述
1968年，美国(Bar Harber ME)Jackson实验室赠送给日本京都(Kyoto)大学几对AKR/J系小鼠。在繁殖饲养过程中，Takeda等人发现有几窝小鼠表现有程度不同的脱毛、皮肤粗糙、白内障、行为障碍及生存期缩短等现象，具有遗传倾向。1975年，他们精心挑选了5窝表现明显衰老的AKR/J小鼠作为P系祖先，表现有正常衰老过程的小鼠作为R系祖先。选择P系、R系的主要标准是以老化度评分(在8 mon龄时衰老程度)、生存期限及与衰老相关疾病的病理学改变为依据。根据生存曲线(Gompertzian function)及老化度评分标准得出P系小鼠的衰老特征为快速老化[1]。因此，P系称为快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse/prone, SAMP)，R系称为抗快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse/resistance, SAMR)。第1篇文章发表在1981年Mechanism of Aging and Development(Takeda T et al)。
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在繁殖过程中，每一亚系中的每只小鼠都进行了注册、编号。目前共有12个亚系，SAMP系包括P 1、2、3、6、7、8、9、10、11，SAMR包括R 1、4、5。现统称SAMP和SAMR系为快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse,SAM)。8 mon龄时SAMP的老化度评分为7.97，为SAMR的2倍(3.94)[2]。SAM属近交系小鼠，增龄过程中出现许多与衰老相关的功能紊乱，如免疫功能紊乱，肺泡扩张，听力损伤，退行性骨关节炎，骨质疏松，伴有或不伴有脑萎缩的学习记忆功能障碍等。近年研究发现，其许多病理学特征与人类衰老时的病理学特征非常相似(病理表现见表1)[2]。x
Tab 1 Pathobiological phenotypes in SAM mice
Strains
phenotypes
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SAMP
SAMP1
Senile amyloidosis,contracted kidney,impaired immuneresponse,hyperinflation of lungs,hearing impairment
SAMP2
Senile and seconday amyloidosis,contracted kidney,impaired immune response
SAMP3
Degenerative temporomandibular joint disease
SAMP6
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Senile osteoporosis,secondary amyloidosis
SAMP7
Thymic lymphoblastic lymphoma,secondary amyloidosis
SAMP8
Deficits in learning and memory,emotional disorder(reduced anxiety-like behavior),impaired immune response
SAMP9
Cataract,thymic lymphoblastic lymphoma,senile amyloidosis
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SAMP10
Brain atrophy, deficits in learning and memory,emotional disorder(depressive behavior),contracted kidney,senile amyloidosis
SAMP11
Contracted kidney,senile anyloidosis
SAMR
SAMR1
Nonthymic lymphoma,histiocytic sarcoma,ovarian cyst
SAMR4
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Nonthymic lymphoma,histiocytic sarcoma
SAMR5
Colitis
2 SAM的特征
2.1 SAMR SAMR作为抗快速老化亚系，其各项生理指标及平均生存期限均与正常动物相似，因此目前在大量研究中以SAMR 1作为SAMP系的正常对照。
2.2 SAMP
2.2.1 SAMP 1
2.2.1.1 免疫功能低下 免疫功能低下为SAMP 1的特征性病理改变，且常常发生在与衰老相关的各种病理改变之前。2 mon龄时SAMP 1对绵羊红细胞(SRBC)诱导的体内脾细胞抗体生成反应(PFC)能力与同月龄SAMR 1相比明显下降，欲使PFC生成能力达到对照组水平，所需抗原量为对照组的4～10倍[3]。如果将新生SAMP 1 胸腺T细胞注射给2 mon SAMP 1，可恢复其抗体生成反应。进一步研究发现，用SRBC致敏无T细胞的AKR小鼠，4 d后将其脾脏细胞与SRBC致敏AKR或SAMP 1脾脏T细胞(AKR与SAMP 1 T细胞数量相同)混合，共同孵育4 d，其结果显示，SAMP 1 组抗体生成反应能力显著低于AKR组。以上结果表明SAMP 1不仅CD4阳性细胞数目减少，而且功能降低。
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另有报道，2、8 mon龄 SAMP 1及 BALB/C小鼠脾细胞分别与细菌脂多糖(LPS)孵育。结果表明，2 mon龄 SAMP 1 B细胞增殖反应与同龄BALB/C相近，而8 mon龄 SAMP 1的B细胞增殖能力明显低于2 mon龄 SAMP 1，BALB/C小鼠2 mon龄与8 mon龄的B细胞增殖无差异。用ELISA检测LPS诱导的B细胞分泌Ig能力，得到与上述相似结果。
在免疫应答中，TH与抗原提呈细胞(APCS)相互作用是必不可少的，其中细胞表面MHC-Ⅱ类及细胞间粘附分子(ICAM-1)发挥了重要作用。8 mon龄 SAMP 1 B细胞及树突状细胞(DC)的MHC-Ⅱ和ICAM-1分子表达比2 mon龄 SAMP 1明显降低，而AKR小鼠在增龄过程中上述指标无明显变化[4]。
SAMP 1免疫功能低下与免疫应答过程中的多个环节有关，早期(2 mon龄)主要与CD4阳性细胞数目及功能降低有关，随着增龄继而出现B细胞、MHC-Ⅱ、ICAM-1等的功能改变。
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2.2.1.2 其他 SAMP 1、SAMR 1在增龄过程中均可表现有听力下降甚至丧失，SAMP 1听力丧失早于SAMR 1，且高频听力丧失早于低、中频。形态学研究发现，增龄过程中耳蜗内外层毛细胞、螺旋神经节丢失，条纹萎缩，此改变与人类衰老时耳蜗形态学改变相似[5]。
以上表明，SAMP 1在增龄过程中可出现多种与衰老相关的功能紊乱，其中免疫功能低下是其特征性病理改变。因此，SAMP 1不仅可作为研究与免疫功能低下相关疾病的动物模型，而且还可作为研究老年性耳聋的动物模型。
2.2.2 SAMP 2 SAMP 2以肺部发生病理学改变为特征。6 mon龄 SAMP 2与同月龄SAMR 1相比肺泡容积增大，压积曲线左移，且随增龄而加重。SAMP 2(3、6 mon龄)吸入烟雾5 wk，与同月龄SAMR 1相比还原性谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比例降低，肺泡炎性细胞聚集，肺泡壁弹性下降[6]。上述改变与人类衰老时肺的形态、功能变化相似，表明SAMP 2可作为研究衰老、烟雾对肺形态、功能影响的动物模型。
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2.2.3 SAMP 3 在增龄过程中SAM所有亚系小鼠均可出现颞下颌关节退行性疾病(DJD)，此疾病最先表现为关节软骨的改变，如踝表面变得粗糙，出现裂隙及受到侵蚀等。根据SAMP和SAMR系发病月龄可分为：早发型(SAMP 3)、中间型(SAMP 1、2、7、8)和晚发型(SAMR 1和SAMP 6)。SAMP系发病月龄明显早于SAMR系，其中SAMP 3发病月龄最早，且发病率最高，随增龄而加重(7～9 mon龄时发病率为50%，12 mon龄时为100%)[7]。因此，SAMP 3可作为研究与年龄相关性关节退行性疾病的动物模型。
2.2.4 SAMP 6 SAMP 6为已建立的早发性、进行性骨质稀少及骨质疏松动物模型，其主要表现为成骨细胞缺陷。1 mon龄时SAMP 6骨髓中成骨祖细胞含量及骨形成速率与同月龄SAMR 1无差别，3～4 mon龄时SAMP 6成骨细胞含量仅为1 mon龄的1/4，同时伴有骨形成速率及骨密度降低，脂肪细胞、髓样祖细胞及IL-6生成明显增多[8]。
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2.2.5 SAMP 8 SAMP 8主要以学习记忆功能呈增龄性加速衰退，中枢神经系统如皮层、海马等部位发生病理学改变为主。文献报道[9]，SAMP 8在2 mon龄就开始出现学习记忆功能衰退，并随增龄而加重，表现为被动回避(Step down,step though test)及主动回避反应(Shuttle box test)和空间学习记忆(Water-maze test)能力下降，而对照组SAMR 1无变化。此外，SAMP 8在增龄过程中还可出现昼夜节律紊乱、情感障碍等改变[10]。SAMP 8增龄过程中出现的学习记忆功能障碍和昼夜节律紊乱等可能与以下几个方面有关。
2.2.5.1 脑内β淀粉样蛋白(Aβ)沉积 SAMP 8在增龄过程中脑内有大量Aβ沉积。Northern杂交法检测表明，β淀粉样蛋白前体(APP)mRNA表达水平无明显变化，而ASPC末端产物明显增多。表明SAMP 8脑内Aβ沉积与APP分泌代谢机制发生改变有关。
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2.2.5.2 脑内相关神经递质及酶活性的改变 SAMP 8在增龄过程中出现的学习记忆功能障碍与脑内相应神经递质改变密切相关，如大脑皮层和海马部位乙酰胆碱(Ach)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)降低及阿片肽、γ-氨基丁酸(GABA)升高，5-羟色胺(5-HT)表现为先升高后降低等[11]。分别给予氢溴酸槟榔碱(M受体激动剂)、他克林(胆碱酯酶抑制剂)、盐酸米安色林(5-HT受体拮抗剂)、DA摄取抑制剂、盐酸纳洛酮(阿片受体拮抗剂)、盐酸印防己毒素(GABA拮抗剂)均可明显改善SAMP 8的学习记忆功能障碍，且随月龄增高所需剂量发生明显改变。他克林、氢溴酸槟榔碱、印防己毒素所需剂量逐渐加大，而盐酸米安色林剂量明显降低。兴奋性氨基酸具有神经毒作用，其在脑内局部聚集可引起神经元变性。SAMP 8大脑皮层和海马谷氨酸及谷氨酰胺代谢紊乱，多种因素(包括高钾50 mol.L-1 KCl)可促使胞浆内谷氨酸和谷氨酰胺从突触前释放增多，而天门冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)含量下降，这可能与转氨酶活性升高及谷氨酸脱氢酶活性降低，从而使α-酮戊二酸到谷氨酸的反应占优势有关[12]。患有桥脑、小脑萎缩的病人有谷氨酸脱氢酶缺乏，其胞浆中谷氨酸含量明显高于正常人。
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长时程增强效应(LTP)是衡量神经突触可塑性的重要指标，被认为是学习记忆的细胞学基础。一氧化氮(NO)、蛋白激酶C(PKC)与LTP密切相关。SAMP 8的LTP降低与大脑皮层和海马一氧化氮合成酶(NOS)及PKC活性下降有关。
神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、4、5(NF-3、4、5)，它们对神经元的生长、发育与维持起重要作用。AD病人海马BDNF、NGF、NF-3 mRNA表达明显下降。Kaisho等[13]采用Northern杂交法观察了SAMP 8(1、4、40 mon龄)脑内BDNF、NGF、NF-3 mRNA表达水平的变化。在大脑皮层NF-3 mRNA表达高于同龄SAMR 1，尤其以40 wk龄时最为显著，这可能是由于衰老时神经元退行性变增加了星形细胞的增生。而中脑、海马CA 1、CA 2的NF-3 mRNA表达水平明显低于同龄SAMR 1，BDNF mRNA表达水平与同龄SAMR 1无差别。
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当衰老、脑内局部缺血或神经元发生病理性改变时，组织蛋白酶E(CE)、D(CD)在脑内大量堆积。在增龄过程中SAMP 8脑内CE、CD含量明显升高。Amano等[14]报道1 wk龄时SAMP 8脑干内检测不到CE，2 mon龄时CE含量明显增多，而SAMR 1在6 mon龄时仍检测不到CE 。免疫组化结果表明，CE主要聚集在反应性小胶质细胞内，这些小胶质细胞主要存在于脑干的海绵状变性区域。反应性小胶质细胞的增生与聚集形式与SAMP 8脑内海绵状变性的发生发展相一致。CE在反应性小胶质细胞中的作用不仅与其吞噬功能有关，参与细胞内外蛋白质降解，而且还可促进反应性小胶质细胞表面MHC-Ⅱ分子的表达。CD几乎存在于SAMP 8脑内所有神经元内，2 mon龄时CD在脑内海绵状变性区域的反应性星形细胞及部分反应性小胶质细胞内显著增多。CD为溶酶体酶，具有降解微管相关蛋白及髓磷脂鞘蛋白的作用。表明脑内CD水平升高与SAMP 8海绵状变性区域的树突变性及轴突脱髓鞘有关。AD患者脑内老年斑中CD含量异常升高。以上表明，SAMP 8增龄过程中脑内CD、CE含量升高与脑内神经元变性、学习记忆功能障碍有关。
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下丘脑视交叉上核(SCN)为调节生理行为节律变化的24 h起搏器，光信息从视网膜通过下丘脑通路传递到SCN，其中许多与学习记忆密切相关的神经递质在光信息传递中起重要作用。Karasawa 等[15]报道,SAMP 8增龄过程中黑质DA能神经元及蓝斑核NE能神经元有退行性改变，海马内单胺氧化酶含量明显升高，常以团块形式聚集在一起。表明SAMP 8增龄过程中出现的24 h昼夜节律紊乱与单胺能神经递质缺陷有关。
2.2.5.3 脑内氧化应激 文献报道在SAMP 8脑内出现病理学改变之前，大脑皮层已发生氧化应激。1～2 mon龄时大脑皮层内脂质过氧化物(LPO)，过氧化氢(H2O2)，蛋白质羰基含量与同龄SAMR 1相比明显升高，过氧化氢酶活性下降75%，而超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶活性无变化。酰基辅酶A(acyl-CoA)氧化酶(一种能产生H2O2的微粒体过氧化物酶)活性在大脑皮层内升高1.6倍。氧化应激产生的自由基可引起线粒体内DNA、蛋白质和脂质的氧化损伤，线粒体呼吸速率下降，产生的ATP不足以维持细胞正常代谢，线粒体内钙的主动摄取亦明显下降[16]。以上提示与氧化应激相关的酶的活性及线粒体功能改变是SAMP 8脑内较早发生的异常改变，是其脑内发生病理学改变的原因之一，与SAMP 8学习记忆功能障碍具有密切关系。
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2.2.5.4 脑内葡萄糖代谢障碍 葡萄糖代谢产生ATP是中枢神经系统内唯一的供能物质。AD患者早期就有葡萄糖代谢下降，且与痴呆严重程度呈正相关。Ohta等[17]给SAMP 8(7、8 mon龄)尾静脉注射[14C]2-脱氧-D-葡萄糖以观察葡萄糖在脑内变化(脱氧葡萄糖通过葡萄糖载体从血中进入脑组织，经己糖激酶磷酸化生成2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸)。注射[14C]2-脱氧-D葡萄糖30 mon后，2-脱氧-D-葡萄糖-6磷酸含量在SAMP 8大脑皮层前区、后区、海马及纹状体内浓度明显低于同龄SAMR 1，而SAMP 8与同龄SAMR 1脑血流速度及葡萄糖载体数目无差别。表明SAMP 8脑内葡萄糖代谢障碍与己糖激酶活性下降有关。
2.2.5.5 免疫功能异常 SAMP 8在2 mon龄时就出现免疫功能异常，对绵羊红细胞(SRBC)诱导的脾细胞抗体生成反应、Con A诱导的淋巴细胞增殖反应及IL-2产生能力均明显下降。进一步研究发现，SAMP 8脾脏CD+4细胞数目及功能下降，NK细胞数量正常。用免疫增强剂后，NK细胞活性明显增强。表明NK细胞活性降低可能与IL-2水平下降有关[18]。
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Kitabayashi等[19]报道，SAMP 8脑干海绵状变性区域有大量激活的反应性小胶质细胞聚集，聚集程度与月龄呈正相关。此时反应性小胶质细胞分泌IL-1、IL-6的能力及细胞表面MHC-Ⅱ、β2-整合素(CD11b，为C3受体)的表达水平均明显增高。表明SAMP 8脑干发生海绵状变性以及学习记忆功能障碍与反应性小胶质细胞介导的自身免疫机能紊乱具有一定的关系。
SAMP 8在增龄过程中血脑屏障通透性增加，血中免疫细胞及大分子物质，如血清白蛋白、细胞因子等可透过血脑屏障。提示血脑屏障功能改变可能是血中免疫物质进入脑内的途径之一，介导了脑内免疫功能的紊乱。
2.2.5.6 下丘脑-垂体前叶-肾上腺轴及性腺轴(HPA轴及HPG轴)功能失衡 Landfield曾提出了糖皮质激素致脑老化学说。老年性痴呆患者表现有HPA轴功能亢进，血浆糖皮质激素水平升高，下丘脑在HPA轴中负反馈调节功能降低。周建政等[20]报道，SAMP 8在增龄过程中血浆及中枢海马、皮层内皮质酮水平明显高于同龄SAMR 1。血浆皮质酮水平升高可降低SAMP 8海马神经元细胞内ATP水平，并诱导兴奋性氨基酸(Glu)堆积。以上提示SAMP 8 HPA轴功能亢进与其海马损伤、学习记忆功能衰退有密切关系。Flood等[21]报道，SAMP 8在增龄过程中血浆睾酮水平明显降低，8 mon龄时血浆睾酮水平下降43%(与4 mon龄相比)，12 mon龄时下降71%。如果SAMP 8(12 mon龄)外源性给予生理剂量睾酮(2.5 mg皮下埋入21 d)可明显改善其被动回避反应(与同月龄SAMP 8相比)。该作者认为睾酮改善学习记忆可能与其在脑内经芳香化酶作用转变为雌激素，雌激素又促进了DA能神经元的功能有关。此外，本室近年来应用SAMP 8睾丸间质细胞原代培养检测培养上清液中的睾酮含量，发现11 mon龄SAMP 8睾酮的自发释放量较SAMR 1明显下降，提示其睾丸间质细胞功能低下。
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综上所述，SAMP 8不仅是研究衰老与学习记忆功能及学习记忆功能障碍发生机制和评价益智药物的良好动物模型，而且是研究神经内分泌免疫调节网络平衡的良好模型。
2.2.6 SAMP 9 脉管系统高发性、玻璃样变相关性白内障是SAMP 9特征性病理改变，发病周龄为10 wk龄，且严重程度与周龄呈正相关。其患白内障后，晶体内Ca2+浓度、转谷氨酰胺酶活性明显升高，β-晶状体蛋白为Ca2+依赖的转谷氨酰胺酶的作用底物，此酶活性升高可导致高相对分子量(43 000)β-晶状体蛋白生成增加，同时相对分子量为3.1×104 β-晶状体蛋白及2.1×104 γ-晶状体蛋白生成减少，即晶状体内水溶性蛋白含量下降，而不溶性蛋白含量明显升高，导致晶状体浑浊，白内障发生[22]。因此，SAMP 9是研究老年性白内障发病机制的良好动物模型。
2.2.7 SAMP 10 SAMP 10是惟一发生与衰老相关脑萎缩的啮齿类动物，可出现自发性且发展迅速的广泛性脑萎缩，具有可遗传性特征。SAMP 10从4 mon龄开始出现脑萎缩，最易受累部位是大脑新皮层前部、后部、梨状皮层、鼻内皮层、嗅核、杏仁体、豆状核尾部、中隔、小脑皮层等，海马、脑干、间脑不易发生。除海马部位外，SAMP 10易萎缩部位与AD患者相一致。SAMP 10表现有与年龄相关的神经元内脂褐质沉积，丘脑神经元胞浆内有嗜酸性包含物，桥脑、小脑白质内有空泡形成等。4 mon龄时SAMP 10被动及主动回避反应与同龄SAMR 1相比无差别，10～12 mon龄时，被动及主动回避反应明显下降，甚至低于23～26 mon龄的SAMR 1。Miyamoto等[23]报道，将8月龄SAMP 8、SAMP 10、SAMR 1尾部悬吊，每只小鼠悬吊10 min，通过计算机记录其活动次数及固定不动的持续时间。结果表明，SAMP 8、SAMR 1在悬吊早期反抗剧烈，活动次数明显增多，随时间延长活动次数逐渐减少。而SAMP 10从始至终行为处于抑郁状态，表现为固定不动时间明显长于SAMP 8及SAMR 1。在被迫游泳实验中，SAMP 10仍表现为行为抑郁。进一步研究发现，此改变与SAMP 10增龄过程中海马β-APP mRNA表达水平及谷氨酸、甘氨酸含量与同龄SAMR 1相比明显升高，基底前NGF水平明显降低，大脑皮层、海马、小脑、脑干、丘脑、中脑神经元胞浆及胞膜内神经鞘磷脂酶活性呈增龄性升高有关[24]。
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以上表明，SAMP 10不仅是研究与衰老相关神经元丢失及脑萎缩发生机制的有益动物模型，而且还是研究与衰老相关的抑郁症发生机制的良好动物模型。
2.2.8 SAMP 11 SAMP 11与其它SAMP亚系相比，老化过程更迅速，是所有SAMP亚系中生存期最短的(仅为7.4 mon龄)。其病理学改变主要以β淀粉样蛋白生成，肾萎缩为主。目前，有关SAMP 11的文献报道很少。Nakamoto等[25]报道，SAMP 11增龄过程中肝脏及脑内可溶性蛋白质羰基衍生物含量与同龄SAMR 1相比明显升高。蛋白质羰基含量升高，表明蛋白质发生氧化修饰，这可能与SAMP 11快速老化有密切关系。有关SAMP 11的脑内神经病理学改变有待进一步研究。
3 结语
目前在衰老与延缓衰老的研究中，多以正常老化动物为模型，其缺点不仅有饲养时间长、价格昂贵等不足，而且正常衰老的动物多不伴有典型的病理特征，因此作为研究衰老相关性疾病的模型具有一定局限性。自发表现有快速老化的哺乳纲动物模型虽已有报道，如遗传性快速老化比利时兔(Belgian hares)及B 10.F 系小鼠。前者主要表现为皮毛异常，视觉损伤，如结膜炎、肉芽肿角膜炎，B 10.F为增龄过程中体重进行性下降，对绵羊红细胞(SRBC)诱导的抗体生成反应能力明显下降，生存期缩短，但二者均不能提供更多信息以支持作为快速老化动物模型。SAM为日本京都大学首次培育成功的快速老化小鼠，分为快速老化(SAMP)及抗快速老化亚系(SAMR)。目前共有12个亚系，不同亚系小鼠具有不同的病理表现型，如在增龄过程中，SAMP 1主要特征为免疫功能低下、SAMP 2以肺部病理改变为主、SAMP 3为变性性骨关节疾病、SAMP 6为骨质疏松、SAMP 8为学习记忆功能障碍及昼夜节律紊乱、SAMP 9为白内障、SAMP 10为伴有脑萎缩的学习记忆及情感障碍。这些与衰老相关的病理改变与许多人类老年性疾病的病理改变相似。此外，小鼠遗传信息非常丰富，与人类遗传学特征具有相似性。因此，研究者可根据研究目的不同，选用相应的SAM品系作为研究对象，为研究者探讨衰老及衰老相关疾病的发生机制，进行药物筛选，评价药物疗效及作用机制提供了良好的动物模型。
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国家“九五”攀登计划预选项目及国家自然科学基金重点项目，No 39830450
作者简介：聂伟，女，28岁，博士生；
张永祥，男，40岁，研究员，博士生导师，军事医学科学院毒物药物研究所副所长
聂伟(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
张永祥(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
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聂伟 张永祥
摘 要 快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse, SAM)分为快速老化亚系(Senescence accelerated mouse/prone, SAMP)及抗快速老化亚系(Senescence accelerated mouse/resistance, SAMR)。由日本京都大学首次培育成功，目前共有12个亚系，不同亚系具有不同的病理表现型，其中许多具有与人类衰老相似的病理学特征。人类许多老年性疾病如肺泡扩张、骨质疏松、骨关节疾病、学习记忆功能障碍、情感紊乱(抑郁)、白内障、听觉障碍、脑萎缩、免疫缺陷等在SAMP不同亚系上均有不同程度的体现，而SAMR亚系的各项生理指标及生存期限与正常动物相似。因此，SAM(SAMP、SAMR)为探讨衰老及衰老相关疾病的发生机制，评价药效及其作用机制提供了良好的动物模型。
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关键词：快速老化小鼠 衰老 动物模型
1 概述
1968年，美国(Bar Harber ME)Jackson实验室赠送给日本京都(Kyoto)大学几对AKR/J系小鼠。在繁殖饲养过程中，Takeda等人发现有几窝小鼠表现有程度不同的脱毛、皮肤粗糙、白内障、行为障碍及生存期缩短等现象，具有遗传倾向。1975年，他们精心挑选了5窝表现明显衰老的AKR/J小鼠作为P系祖先，表现有正常衰老过程的小鼠作为R系祖先。选择P系、R系的主要标准是以老化度评分(在8 mon龄时衰老程度)、生存期限及与衰老相关疾病的病理学改变为依据。根据生存曲线(Gompertzian function)及老化度评分标准得出P系小鼠的衰老特征为快速老化[1]。因此，P系称为快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse/prone, SAMP)，R系称为抗快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse/resistance, SAMR)。第1篇文章发表在1981年Mechanism of Aging and Development(Takeda T et al)。
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在繁殖过程中，每一亚系中的每只小鼠都进行了注册、编号。目前共有12个亚系，SAMP系包括P 1、2、3、6、7、8、9、10、11，SAMR包括R 1、4、5。现统称SAMP和SAMR系为快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse,SAM)。8 mon龄时SAMP的老化度评分为7.97，为SAMR的2倍(3.94)[2]。SAM属近交系小鼠，增龄过程中出现许多与衰老相关的功能紊乱，如免疫功能紊乱，肺泡扩张，听力损伤，退行性骨关节炎，骨质疏松，伴有或不伴有脑萎缩的学习记忆功能障碍等。近年研究发现，其许多病理学特征与人类衰老时的病理学特征非常相似(病理表现见表1)[2]。x
Tab 1 Pathobiological phenotypes in SAM mice
Strains
phenotypes
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SAMP
SAMP1
Senile amyloidosis,contracted kidney,impaired immuneresponse,hyperinflation of lungs,hearing impairment
SAMP2
Senile and seconday amyloidosis,contracted kidney,impaired immune response
SAMP3
Degenerative temporomandibular joint disease
SAMP6
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Senile osteoporosis,secondary amyloidosis
SAMP7
Thymic lymphoblastic lymphoma,secondary amyloidosis
SAMP8
Deficits in learning and memory,emotional disorder(reduced anxiety-like behavior),impaired immune response
SAMP9
Cataract,thymic lymphoblastic lymphoma,senile amyloidosis
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SAMP10
Brain atrophy, deficits in learning and memory,emotional disorder(depressive behavior),contracted kidney,senile amyloidosis
SAMP11
Contracted kidney,senile anyloidosis
SAMR
SAMR1
Nonthymic lymphoma,histiocytic sarcoma,ovarian cyst
SAMR4
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Nonthymic lymphoma,histiocytic sarcoma
SAMR5
Colitis
2 SAM的特征
2.1 SAMR SAMR作为抗快速老化亚系，其各项生理指标及平均生存期限均与正常动物相似，因此目前在大量研究中以SAMR 1作为SAMP系的正常对照。
2.2 SAMP
2.2.1 SAMP 1
2.2.1.1 免疫功能低下 免疫功能低下为SAMP 1的特征性病理改变，且常常发生在与衰老相关的各种病理改变之前。2 mon龄时SAMP 1对绵羊红细胞(SRBC)诱导的体内脾细胞抗体生成反应(PFC)能力与同月龄SAMR 1相比明显下降，欲使PFC生成能力达到对照组水平，所需抗原量为对照组的4～10倍[3]。如果将新生SAMP 1 胸腺T细胞注射给2 mon SAMP 1，可恢复其抗体生成反应。进一步研究发现，用SRBC致敏无T细胞的AKR小鼠，4 d后将其脾脏细胞与SRBC致敏AKR或SAMP 1脾脏T细胞(AKR与SAMP 1 T细胞数量相同)混合，共同孵育4 d，其结果显示，SAMP 1 组抗体生成反应能力显著低于AKR组。以上结果表明SAMP 1不仅CD4阳性细胞数目减少，而且功能降低。
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另有报道，2、8 mon龄 SAMP 1及 BALB/C小鼠脾细胞分别与细菌脂多糖(LPS)孵育。结果表明，2 mon龄 SAMP 1 B细胞增殖反应与同龄BALB/C相近，而8 mon龄 SAMP 1的B细胞增殖能力明显低于2 mon龄 SAMP 1，BALB/C小鼠2 mon龄与8 mon龄的B细胞增殖无差异。用ELISA检测LPS诱导的B细胞分泌Ig能力，得到与上述相似结果。
在免疫应答中，TH与抗原提呈细胞(APCS)相互作用是必不可少的，其中细胞表面MHC-Ⅱ类及细胞间粘附分子(ICAM-1)发挥了重要作用。8 mon龄 SAMP 1 B细胞及树突状细胞(DC)的MHC-Ⅱ和ICAM-1分子表达比2 mon龄 SAMP 1明显降低，而AKR小鼠在增龄过程中上述指标无明显变化[4]。
SAMP 1免疫功能低下与免疫应答过程中的多个环节有关，早期(2 mon龄)主要与CD4阳性细胞数目及功能降低有关，随着增龄继而出现B细胞、MHC-Ⅱ、ICAM-1等的功能改变。
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2.2.1.2 其他 SAMP 1、SAMR 1在增龄过程中均可表现有听力下降甚至丧失，SAMP 1听力丧失早于SAMR 1，且高频听力丧失早于低、中频。形态学研究发现，增龄过程中耳蜗内外层毛细胞、螺旋神经节丢失，条纹萎缩，此改变与人类衰老时耳蜗形态学改变相似[5]。
以上表明，SAMP 1在增龄过程中可出现多种与衰老相关的功能紊乱，其中免疫功能低下是其特征性病理改变。因此，SAMP 1不仅可作为研究与免疫功能低下相关疾病的动物模型，而且还可作为研究老年性耳聋的动物模型。
2.2.2 SAMP 2 SAMP 2以肺部发生病理学改变为特征。6 mon龄 SAMP 2与同月龄SAMR 1相比肺泡容积增大，压积曲线左移，且随增龄而加重。SAMP 2(3、6 mon龄)吸入烟雾5 wk，与同月龄SAMR 1相比还原性谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比例降低，肺泡炎性细胞聚集，肺泡壁弹性下降[6]。上述改变与人类衰老时肺的形态、功能变化相似，表明SAMP 2可作为研究衰老、烟雾对肺形态、功能影响的动物模型。
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2.2.3 SAMP 3 在增龄过程中SAM所有亚系小鼠均可出现颞下颌关节退行性疾病(DJD)，此疾病最先表现为关节软骨的改变，如踝表面变得粗糙，出现裂隙及受到侵蚀等。根据SAMP和SAMR系发病月龄可分为：早发型(SAMP 3)、中间型(SAMP 1、2、7、8)和晚发型(SAMR 1和SAMP 6)。SAMP系发病月龄明显早于SAMR系，其中SAMP 3发病月龄最早，且发病率最高，随增龄而加重(7～9 mon龄时发病率为50%，12 mon龄时为100%)[7]。因此，SAMP 3可作为研究与年龄相关性关节退行性疾病的动物模型。
2.2.4 SAMP 6 SAMP 6为已建立的早发性、进行性骨质稀少及骨质疏松动物模型，其主要表现为成骨细胞缺陷。1 mon龄时SAMP 6骨髓中成骨祖细胞含量及骨形成速率与同月龄SAMR 1无差别，3～4 mon龄时SAMP 6成骨细胞含量仅为1 mon龄的1/4，同时伴有骨形成速率及骨密度降低，脂肪细胞、髓样祖细胞及IL-6生成明显增多[8]。
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2.2.5 SAMP 8 SAMP 8主要以学习记忆功能呈增龄性加速衰退，中枢神经系统如皮层、海马等部位发生病理学改变为主。文献报道[9]，SAMP 8在2 mon龄就开始出现学习记忆功能衰退，并随增龄而加重，表现为被动回避(Step down,step though test)及主动回避反应(Shuttle box test)和空间学习记忆(Water-maze test)能力下降，而对照组SAMR 1无变化。此外，SAMP 8在增龄过程中还可出现昼夜节律紊乱、情感障碍等改变[10]。SAMP 8增龄过程中出现的学习记忆功能障碍和昼夜节律紊乱等可能与以下几个方面有关。
2.2.5.1 脑内β淀粉样蛋白(Aβ)沉积 SAMP 8在增龄过程中脑内有大量Aβ沉积。Northern杂交法检测表明，β淀粉样蛋白前体(APP)mRNA表达水平无明显变化，而ASPC末端产物明显增多。表明SAMP 8脑内Aβ沉积与APP分泌代谢机制发生改变有关。
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2.2.5.2 脑内相关神经递质及酶活性的改变 SAMP 8在增龄过程中出现的学习记忆功能障碍与脑内相应神经递质改变密切相关，如大脑皮层和海马部位乙酰胆碱(Ach)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)降低及阿片肽、γ-氨基丁酸(GABA)升高，5-羟色胺(5-HT)表现为先升高后降低等[11]。分别给予氢溴酸槟榔碱(M受体激动剂)、他克林(胆碱酯酶抑制剂)、盐酸米安色林(5-HT受体拮抗剂)、DA摄取抑制剂、盐酸纳洛酮(阿片受体拮抗剂)、盐酸印防己毒素(GABA拮抗剂)均可明显改善SAMP 8的学习记忆功能障碍，且随月龄增高所需剂量发生明显改变。他克林、氢溴酸槟榔碱、印防己毒素所需剂量逐渐加大，而盐酸米安色林剂量明显降低。兴奋性氨基酸具有神经毒作用，其在脑内局部聚集可引起神经元变性。SAMP 8大脑皮层和海马谷氨酸及谷氨酰胺代谢紊乱，多种因素(包括高钾50 mol.L-1 KCl)可促使胞浆内谷氨酸和谷氨酰胺从突触前释放增多，而天门冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)含量下降，这可能与转氨酶活性升高及谷氨酸脱氢酶活性降低，从而使α-酮戊二酸到谷氨酸的反应占优势有关[12]。患有桥脑、小脑萎缩的病人有谷氨酸脱氢酶缺乏，其胞浆中谷氨酸含量明显高于正常人。
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长时程增强效应(LTP)是衡量神经突触可塑性的重要指标，被认为是学习记忆的细胞学基础。一氧化氮(NO)、蛋白激酶C(PKC)与LTP密切相关。SAMP 8的LTP降低与大脑皮层和海马一氧化氮合成酶(NOS)及PKC活性下降有关。
神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、4、5(NF-3、4、5)，它们对神经元的生长、发育与维持起重要作用。AD病人海马BDNF、NGF、NF-3 mRNA表达明显下降。Kaisho等[13]采用Northern杂交法观察了SAMP 8(1、4、40 mon龄)脑内BDNF、NGF、NF-3 mRNA表达水平的变化。在大脑皮层NF-3 mRNA表达高于同龄SAMR 1，尤其以40 wk龄时最为显著，这可能是由于衰老时神经元退行性变增加了星形细胞的增生。而中脑、海马CA 1、CA 2的NF-3 mRNA表达水平明显低于同龄SAMR 1，BDNF mRNA表达水平与同龄SAMR 1无差别。
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当衰老、脑内局部缺血或神经元发生病理性改变时，组织蛋白酶E(CE)、D(CD)在脑内大量堆积。在增龄过程中SAMP 8脑内CE、CD含量明显升高。Amano等[14]报道1 wk龄时SAMP 8脑干内检测不到CE，2 mon龄时CE含量明显增多，而SAMR 1在6 mon龄时仍检测不到CE 。免疫组化结果表明，CE主要聚集在反应性小胶质细胞内，这些小胶质细胞主要存在于脑干的海绵状变性区域。反应性小胶质细胞的增生与聚集形式与SAMP 8脑内海绵状变性的发生发展相一致。CE在反应性小胶质细胞中的作用不仅与其吞噬功能有关，参与细胞内外蛋白质降解，而且还可促进反应性小胶质细胞表面MHC-Ⅱ分子的表达。CD几乎存在于SAMP 8脑内所有神经元内，2 mon龄时CD在脑内海绵状变性区域的反应性星形细胞及部分反应性小胶质细胞内显著增多。CD为溶酶体酶，具有降解微管相关蛋白及髓磷脂鞘蛋白的作用。表明脑内CD水平升高与SAMP 8海绵状变性区域的树突变性及轴突脱髓鞘有关。AD患者脑内老年斑中CD含量异常升高。以上表明，SAMP 8增龄过程中脑内CD、CE含量升高与脑内神经元变性、学习记忆功能障碍有关。
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下丘脑视交叉上核(SCN)为调节生理行为节律变化的24 h起搏器，光信息从视网膜通过下丘脑通路传递到SCN，其中许多与学习记忆密切相关的神经递质在光信息传递中起重要作用。Karasawa 等[15]报道,SAMP 8增龄过程中黑质DA能神经元及蓝斑核NE能神经元有退行性改变，海马内单胺氧化酶含量明显升高，常以团块形式聚集在一起。表明SAMP 8增龄过程中出现的24 h昼夜节律紊乱与单胺能神经递质缺陷有关。
2.2.5.3 脑内氧化应激 文献报道在SAMP 8脑内出现病理学改变之前，大脑皮层已发生氧化应激。1～2 mon龄时大脑皮层内脂质过氧化物(LPO)，过氧化氢(H2O2)，蛋白质羰基含量与同龄SAMR 1相比明显升高，过氧化氢酶活性下降75%，而超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶活性无变化。酰基辅酶A(acyl-CoA)氧化酶(一种能产生H2O2的微粒体过氧化物酶)活性在大脑皮层内升高1.6倍。氧化应激产生的自由基可引起线粒体内DNA、蛋白质和脂质的氧化损伤，线粒体呼吸速率下降，产生的ATP不足以维持细胞正常代谢，线粒体内钙的主动摄取亦明显下降[16]。以上提示与氧化应激相关的酶的活性及线粒体功能改变是SAMP 8脑内较早发生的异常改变，是其脑内发生病理学改变的原因之一，与SAMP 8学习记忆功能障碍具有密切关系。
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2.2.5.4 脑内葡萄糖代谢障碍 葡萄糖代谢产生ATP是中枢神经系统内唯一的供能物质。AD患者早期就有葡萄糖代谢下降，且与痴呆严重程度呈正相关。Ohta等[17]给SAMP 8(7、8 mon龄)尾静脉注射[14C]2-脱氧-D-葡萄糖以观察葡萄糖在脑内变化(脱氧葡萄糖通过葡萄糖载体从血中进入脑组织，经己糖激酶磷酸化生成2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸)。注射[14C]2-脱氧-D葡萄糖30 mon后，2-脱氧-D-葡萄糖-6磷酸含量在SAMP 8大脑皮层前区、后区、海马及纹状体内浓度明显低于同龄SAMR 1，而SAMP 8与同龄SAMR 1脑血流速度及葡萄糖载体数目无差别。表明SAMP 8脑内葡萄糖代谢障碍与己糖激酶活性下降有关。
2.2.5.5 免疫功能异常 SAMP 8在2 mon龄时就出现免疫功能异常，对绵羊红细胞(SRBC)诱导的脾细胞抗体生成反应、Con A诱导的淋巴细胞增殖反应及IL-2产生能力均明显下降。进一步研究发现，SAMP 8脾脏CD+4细胞数目及功能下降，NK细胞数量正常。用免疫增强剂后，NK细胞活性明显增强。表明NK细胞活性降低可能与IL-2水平下降有关[18]。
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Kitabayashi等[19]报道，SAMP 8脑干海绵状变性区域有大量激活的反应性小胶质细胞聚集，聚集程度与月龄呈正相关。此时反应性小胶质细胞分泌IL-1、IL-6的能力及细胞表面MHC-Ⅱ、β2-整合素(CD11b，为C3受体)的表达水平均明显增高。表明SAMP 8脑干发生海绵状变性以及学习记忆功能障碍与反应性小胶质细胞介导的自身免疫机能紊乱具有一定的关系。
SAMP 8在增龄过程中血脑屏障通透性增加，血中免疫细胞及大分子物质，如血清白蛋白、细胞因子等可透过血脑屏障。提示血脑屏障功能改变可能是血中免疫物质进入脑内的途径之一，介导了脑内免疫功能的紊乱。
2.2.5.6 下丘脑-垂体前叶-肾上腺轴及性腺轴(HPA轴及HPG轴)功能失衡 Landfield曾提出了糖皮质激素致脑老化学说。老年性痴呆患者表现有HPA轴功能亢进，血浆糖皮质激素水平升高，下丘脑在HPA轴中负反馈调节功能降低。周建政等[20]报道，SAMP 8在增龄过程中血浆及中枢海马、皮层内皮质酮水平明显高于同龄SAMR 1。血浆皮质酮水平升高可降低SAMP 8海马神经元细胞内ATP水平，并诱导兴奋性氨基酸(Glu)堆积。以上提示SAMP 8 HPA轴功能亢进与其海马损伤、学习记忆功能衰退有密切关系。Flood等[21]报道，SAMP 8在增龄过程中血浆睾酮水平明显降低，8 mon龄时血浆睾酮水平下降43%(与4 mon龄相比)，12 mon龄时下降71%。如果SAMP 8(12 mon龄)外源性给予生理剂量睾酮(2.5 mg皮下埋入21 d)可明显改善其被动回避反应(与同月龄SAMP 8相比)。该作者认为睾酮改善学习记忆可能与其在脑内经芳香化酶作用转变为雌激素，雌激素又促进了DA能神经元的功能有关。此外，本室近年来应用SAMP 8睾丸间质细胞原代培养检测培养上清液中的睾酮含量，发现11 mon龄SAMP 8睾酮的自发释放量较SAMR 1明显下降，提示其睾丸间质细胞功能低下。
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综上所述，SAMP 8不仅是研究衰老与学习记忆功能及学习记忆功能障碍发生机制和评价益智药物的良好动物模型，而且是研究神经内分泌免疫调节网络平衡的良好模型。
2.2.6 SAMP 9 脉管系统高发性、玻璃样变相关性白内障是SAMP 9特征性病理改变，发病周龄为10 wk龄，且严重程度与周龄呈正相关。其患白内障后，晶体内Ca2+浓度、转谷氨酰胺酶活性明显升高，β-晶状体蛋白为Ca2+依赖的转谷氨酰胺酶的作用底物，此酶活性升高可导致高相对分子量(43 000)β-晶状体蛋白生成增加，同时相对分子量为3.1×104 β-晶状体蛋白及2.1×104 γ-晶状体蛋白生成减少，即晶状体内水溶性蛋白含量下降，而不溶性蛋白含量明显升高，导致晶状体浑浊，白内障发生[22]。因此，SAMP 9是研究老年性白内障发病机制的良好动物模型。
2.2.7 SAMP 10 SAMP 10是惟一发生与衰老相关脑萎缩的啮齿类动物，可出现自发性且发展迅速的广泛性脑萎缩，具有可遗传性特征。SAMP 10从4 mon龄开始出现脑萎缩，最易受累部位是大脑新皮层前部、后部、梨状皮层、鼻内皮层、嗅核、杏仁体、豆状核尾部、中隔、小脑皮层等，海马、脑干、间脑不易发生。除海马部位外，SAMP 10易萎缩部位与AD患者相一致。SAMP 10表现有与年龄相关的神经元内脂褐质沉积，丘脑神经元胞浆内有嗜酸性包含物，桥脑、小脑白质内有空泡形成等。4 mon龄时SAMP 10被动及主动回避反应与同龄SAMR 1相比无差别，10～12 mon龄时，被动及主动回避反应明显下降，甚至低于23～26 mon龄的SAMR 1。Miyamoto等[23]报道，将8月龄SAMP 8、SAMP 10、SAMR 1尾部悬吊，每只小鼠悬吊10 min，通过计算机记录其活动次数及固定不动的持续时间。结果表明，SAMP 8、SAMR 1在悬吊早期反抗剧烈，活动次数明显增多，随时间延长活动次数逐渐减少。而SAMP 10从始至终行为处于抑郁状态，表现为固定不动时间明显长于SAMP 8及SAMR 1。在被迫游泳实验中，SAMP 10仍表现为行为抑郁。进一步研究发现，此改变与SAMP 10增龄过程中海马β-APP mRNA表达水平及谷氨酸、甘氨酸含量与同龄SAMR 1相比明显升高，基底前NGF水平明显降低，大脑皮层、海马、小脑、脑干、丘脑、中脑神经元胞浆及胞膜内神经鞘磷脂酶活性呈增龄性升高有关[24]。
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以上表明，SAMP 10不仅是研究与衰老相关神经元丢失及脑萎缩发生机制的有益动物模型，而且还是研究与衰老相关的抑郁症发生机制的良好动物模型。
2.2.8 SAMP 11 SAMP 11与其它SAMP亚系相比，老化过程更迅速，是所有SAMP亚系中生存期最短的(仅为7.4 mon龄)。其病理学改变主要以β淀粉样蛋白生成，肾萎缩为主。目前，有关SAMP 11的文献报道很少。Nakamoto等[25]报道，SAMP 11增龄过程中肝脏及脑内可溶性蛋白质羰基衍生物含量与同龄SAMR 1相比明显升高。蛋白质羰基含量升高，表明蛋白质发生氧化修饰，这可能与SAMP 11快速老化有密切关系。有关SAMP 11的脑内神经病理学改变有待进一步研究。
3 结语
目前在衰老与延缓衰老的研究中，多以正常老化动物为模型，其缺点不仅有饲养时间长、价格昂贵等不足，而且正常衰老的动物多不伴有典型的病理特征，因此作为研究衰老相关性疾病的模型具有一定局限性。自发表现有快速老化的哺乳纲动物模型虽已有报道，如遗传性快速老化比利时兔(Belgian hares)及B 10.F 系小鼠。前者主要表现为皮毛异常，视觉损伤，如结膜炎、肉芽肿角膜炎，B 10.F为增龄过程中体重进行性下降，对绵羊红细胞(SRBC)诱导的抗体生成反应能力明显下降，生存期缩短，但二者均不能提供更多信息以支持作为快速老化动物模型。SAM为日本京都大学首次培育成功的快速老化小鼠，分为快速老化(SAMP)及抗快速老化亚系(SAMR)。目前共有12个亚系，不同亚系小鼠具有不同的病理表现型，如在增龄过程中，SAMP 1主要特征为免疫功能低下、SAMP 2以肺部病理改变为主、SAMP 3为变性性骨关节疾病、SAMP 6为骨质疏松、SAMP 8为学习记忆功能障碍及昼夜节律紊乱、SAMP 9为白内障、SAMP 10为伴有脑萎缩的学习记忆及情感障碍。这些与衰老相关的病理改变与许多人类老年性疾病的病理改变相似。此外，小鼠遗传信息非常丰富，与人类遗传学特征具有相似性。因此，研究者可根据研究目的不同，选用相应的SAM品系作为研究对象，为研究者探讨衰老及衰老相关疾病的发生机制，进行药物筛选，评价药物疗效及作用机制提供了良好的动物模型。
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国家“九五”攀登计划预选项目及国家自然科学基金重点项目，No 39830450
作者简介：聂伟，女，28岁，博士生；
张永祥，男，40岁，研究员，博士生导师，军事医学科学院毒物药物研究所副所长
聂伟(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
张永祥(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
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