周围神经组织工程材料的预构
王光林 杨志明 解慧琪 王翠莹 李胜富
摘 要：目的 研究具有雪旺细胞(SC)活性的组织工程周围神经修复材料的构建方法。方法 ①采用干/湿相转化纺丝法，将分子量为730 kD的聚乳酸(PLA)制成外径为2.3 mm、内径为1.9 mm、壁厚0.4 mm、长4 cm、孔隙率为70%、孔径为20～40 μm的中空纤维管和孔径为100～200 μm、孔隙率为85%的PLA无纺纤维布。②将SC置入细胞外基质(ECM)凝胶中，观察SC在ECM凝胶中的生长。③SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布中，观察SC在PLA支架材料中的生长。④将SC、SC/ECM和SC/ECM/PLA置入PLA中空纤维管中，桥接大鼠坐骨神经长10 mm缺损，观察SC移植后存活情况。结果 ①SC在ECM凝胶中，细胞生长良好，1天后开始有细胞伸出两极，形态开始展开，3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞，并开始分裂、增殖，直到14天后随着凝胶的溃解，SC开始死亡，降解成碎片；当ECM凝胶溃解后，加入DMEM培养基，SC游出，贴壁生长。②SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布后，大部分细胞随ECM凝胶状态的形成，滞留于PLA纤维网孔中，1天后开始伸出两极，3天后可见网孔中大量双极梭形细胞，部分细胞沿着纤维生长，仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长。③SC移植术后21天，BrdU免疫组织化学染色发现大量SC细胞存活，SC/ECM组和SC/ECM/PLA组存活细胞数量明显多于单纯SC悬液组。结论 ECM凝胶能维持SC存活。PLA无纺纤维布与ECM凝胶复合是良好的携带SC的多孔生物降解材料。
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关键词：雪旺细胞 细胞外基质 中空纤维管 组织工程
近年来，随着组织工程学的兴起，提倡利用生物学和工程学原理开发能够修复、维持和改善组织功能的生物代用品，将有可能对周围神经缺损的修复探索出一条解决问题的捷径。雪旺细胞(Schwann cell,SC)是周围神经的主要结构和功能细胞，其分离、培养、分裂、增殖、标准化和保存方法目前已取得很大进展，由于其在神经再生过程中为再生轴突提供Bungner带，分泌多种神经营养物质、相关细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和神经细胞粘附分子等，在神经再生和功能恢复方面起着重要作用。因此，将SC和相应的ECM结合，与具有良好生物相容性和可渗透性、能保证SC存活、分裂、增殖和发挥其促神经再生作用的生物可降解材料复合，制成具有SC活性的组织工程周围神经修复材料，将可能对神经缺损的修复效果和功能恢复起着重要促进作用[1～4]。
1 材料与方法
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1.1 聚乳酸中空纤维管的制作
采用干/湿相转化纺丝法，将分子量为730 kD(1D=0.992u)的消旋聚乳酸(polylactic acid,PLA，由中国科学院成都分院化学所提供)、溶剂、添加剂置入挤出器中溶解，除泡后用纺丝器制成外径为2.3 mm、内径为1.9 mm、壁厚0.4 mm、长4 cm的管后，充分洗涤，去除添加剂后，制成孔隙率为70%、孔径为20～40 μm的中空纤维管(图1)，环氧乙烷消毒备用。
1.2 聚乳酸无纺纤维布的制作
将PLA溶解、旋转抽丝后采用无纺法制成PLA单层纤维布，叠加4～6层制成孔径为100～200 μm、孔隙率为85%的PLA无纺纤维布后环氧乙烷消毒备用(PLA中空纤维管和无纺纤维布均由四川大学纺织学院完成)。
1.3 雪旺细胞培养及标记
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1.3.1 雪旺细胞培养 按Brockes的方法：无菌取流产胎龄14～20周的人胎儿双侧坐骨神经置入Hank's液中，解剖显微镜下剔除外膜、剪碎后用0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶混合液消化，40～50分钟后取细胞悬液接种于预涂有多聚赖氨酸的培养瓶中37℃，5%CO2孵箱中培养30分钟后收集未贴壁细胞重新接种于塑料培养瓶中，培养24小时后更换为含有阿糖胞苷(1×10-5mol/L)的DMEM培养基，48小时后更换为常规DMEM培养基，培养24小时后再换为含有阿糖胞苷的培养基，培养24小时后再换为常规培养基，以去除成纤维细胞。8～10天细胞长满后SP法做S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定，SC纯度超过95%。
1.3.2 雪旺细胞标记 SC培养6～8天后，向培养液中加入BrdU,终末浓度为10 μmol/L，37℃，5%CO2培养箱中孵育1～2天，DMEM液清洗三次，免疫组织化学染色细胞核呈蓝色。
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1.4 雪旺细胞在细胞外基质凝胶中的生长
ECM(Sigma)和DMEM(2×)在20℃下充分混合，SC以1×105 ml加入ECM/DMEM中置入一次性塑料培养皿中，37℃，5%CO2孵箱中培养；另一组在形成凝胶6小时后加入DMEM培养基，观察SC在ECM凝胶及模拟体内血清环境中的生长情况。
1.5 雪旺细胞在聚乳酸支架材料中的生长
将PLA无纺纤维布在多聚赖氨酸溶液(10 μg/ml)中浸泡24小时，取出冻干，一组SC以1×107/ml缓慢浸入PLA纤维布，静置6小时后，加入少量DMEM培养；另一组SC以1×107/ml混入ECM/DMEM中，在20℃缓慢浸入PLA纤维布中，37℃孵育12小时后再加入DMEM，37℃，5%CO2孵箱中孵育。
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1.6 周围神经材料的预构
BrdU标记的SC制成1×108/ml ECM/DMEM悬液，一组缓慢浸入PLA纤维布中，37℃，5%CO2孵箱中孵育12小时，充分整合后置入PLA中空纤维管中；另一组直接注入PLA中空纤维管中，用8%琼脂糖封口，置入DMEM培养瓶中，37℃，5%CO2孵箱中孵育24小时，使其充分整合。
1.7 周围神经材料的体内植入
取Wistar大白鼠15只，体重(250±20) g，3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后显露一侧坐骨神经，造成长10 mm缺损，10只分别用上述两种材料桥接，另外5只用中空纤维管桥接后注入1×108/ml SC细胞悬液作为对照组。3周后取材，10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、BrdU免疫组织化学染色，观察细胞存活情况。
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1.8 统计学方法
所有数据均采用SPSS/PC进行统计分析。
2 结果
2.1 雪旺细胞在细胞外基质凝胶中的生长
SC在ECM中形成凝胶后，1小时后呈圆形，周围一圈透亮带，1天后开始有细胞伸出两极，形态开始展开，3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞，并开始分裂、增殖，直到14天细胞生长良好，14天后随着凝胶的溃解，SC开始死亡、降解成碎片(图2)。在加入DMEM组中，SC在14天前同EMC凝胶中生长规律大致相同，只是当ECM凝胶溃解后SC游出，贴壁生长。
2.2 雪旺细胞在聚乳酸纤维布上的生长
SC悬液直接浸入PLA无纺纤维布中后，大部分细胞渗漏到培养瓶中，在瓶底贴壁生长，仅少数细胞能贴附在PLA纤维上，伸展形成双极状。
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SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布后，大部分细胞随ECM凝胶状态的形成，滞留于PLA纤维网孔中，1天后开始伸出两极，3天后可见网孔中大量双极梭形细胞，同普通培养瓶中SC形态完全一致，部分细胞沿着纤维生长，仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长(图3)。
2.3 雪旺细胞移植后存活情况
SC移植术后21天，BrdU免疫组织化学染色发现三个组均有大量细胞存活，细胞分布不均匀，部分区域聚集成团，部分区域较稀疏(图4)，SC/ECM组和SC/ECM/PLA组细胞存活数量无明显区别，而单纯SC悬液组存活细胞数量明显少于SC/ECM和SC/ECM/PLA组，SC悬液组平均每高倍视野SC数量为(180±150)个，SC/ECM组为(480±260)个，SC/ECM/PLA组为(440±230)个，经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。
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图1 PLA中空纤维神经再生引导管 图2 雪旺细胞在ECM凝胶中的三维生长( ×100) 图3 雪旺细胞在PLA纤维布上的生长，部分细胞贴附在纤维上( ×100) 图4 雪旺细胞移植后3周，大量细胞存活(免疫组织化学染色 ×100)
Fig. 1 PLA hollow fiber conduit for guiding peripheral nerve regeneration Fig. 2 SC were grown in three dimensional ECM gels( × 100) Fig. 3 SC were grown in PLA fiber net, part of cells were adhered on fibers( × 100) Fig. 4 Many SC cells were survived at 3 weeks after transplantation(Immunohistochemical stain ×100)
, http://www.100md.com 3 讨论
SC是周围神经组织工程的核心，SC的分离、培养、纯化、传代及永生化均已取得可喜成就，但神经组织工程材料需要的细胞的数量非常巨大，SC移植要产生效果，细胞浓度量需在1×108/ml以上[5]。SC传代以后形态和功能逐渐改变，不再适合组织工程的要求，解决问题的方法是培养永生化SC系，使其分裂、增殖获得大量的细胞，Gansmmller的研究已取得初步成果，培养出 MSC 80永生化SC系。正常SC移植后产生的神经营养物质非常有限，神经组织工程应该利用基因工程技术，将神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等神经营养物质的基因 转染入永生化的SC，对其基因进行修饰，纯化后培养能分泌上述神经营养因子的细胞，将对神经组织工程的发展起推动作用。采用有效的方法对培养出的SC进行保存，并能进一步减轻其抗原性也是目前急需解决的问题。此外，如能应用分子生物学技术增加端粒酶活性，延长SC DNA端粒，增加SC存活时间对神经组织工程也同样意义重大。
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3.1 生物材料雪旺细胞对神经再生起促进作用
随着材料科学的发展，多种具有良好生物相容性的材料相继出现，高分子材料既具有良好的生物相容性又可降解吸收，并且有些材料对神经再生有促进作用，因此，应用生物材料复合SC移植对神经再生可能具有显著的促进作用[6、7]。Malinon应用可吸收的聚羟基乙酸修复15例患者指神经0.5～3.0 cm的缺损，术后平均随访22.4个月，发现感觉功能恢复良好，33%的患者动态两点辨别觉恢复到3～7 mm，53%的患者恢复到7～15 mm，只有27%的患者恢复较差，与经典的自体神经移植疗效相当，但却避免了自体神经移植供区感觉缺损。Kiyotani等[8]应用干湿相旋转仿丝法将聚羟聚乙酸制成中空纤维管将胶原高温交链于其表面制成可浸透的中空纤维管，修复猫长25 mm的神经缺损，术后5个月组织学和神经元生理检测均表明聚羟基乙酸/胶原管是周围神经良好的修复材料。
Abiseber应用聚丙烯/聚丙烯氰共聚物采用干湿相旋转纺丝法制成可渗透性中空纤维管后，修复周围神经缺损，发现该神经修复材料有良好的促神经再生作用。Levi等[9]发现聚丙烯/聚丙烯氰中空纤维管复合体外培养的SC(120×108/ml)修复猴肌皮神经长15 mm缺损，3个月后组织学检测发现SC移植组较自体神经移植组稍差，但明显优于血管组， 肱桡肌的动作电位检测SC移植组和自体神经移植组相当，中空管组未检测到动作电位，表明SC移植对神经再生确实具有促进作用。Kim等[10]发现，将体外培养的鼠坐骨神经SC混入Ⅰ型胶原制成SC-胶原凝胶后置入胶原管中修复坐骨神经长10 mm的缺损，术后3个月神经动作电位和神经传导速度检测，发现SC移植优于自体神经移植组，并且髓鞘厚度两者相当。
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3.2 多孔生物材料复合雪旺细胞在神经再生中的作用
Plarts等[11]应用聚甲基丙烯酸羟乙酯制成孔隙率为75%，孔径约为10 μm以上的多孔材料后，将SC种植于该材料中，修复鼠视神经缺损，术后3个月发现有大量再生轴突长入SC移植体，顺行示踪法发现再生轴突可生长到700～900 μm长，而没有SC的聚甲基丙烯酸羟乙酯多孔材料中再生轴突较少，有少量少突胶质细胞移行于移植体中，表明用多孔材料携带SC对神经再生有促进作用。将SC移植到多孔材料中，复合入可渗透性中空纤维管中，避免瘢痕长入，修复周围神经缺损，将更有利于神经再生和有髓神经纤维形成以及功能恢复。我们的研究将SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布后 ，大部分细胞在ECM凝胶状态的形成，滞留于PLA纤维网孔中，部分细胞贴附在PLA纤维丝上，并沿着纤维生长，仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长。SC制成1×108/ml ECM/DMEM悬液，缓慢浸入PLA纤维布中，孵箱中孵育12小时，充分整合后置入PLA中空纤维管中，桥接大鼠坐骨神经长10 mm缺损，SC移植术后21天，BrdU免疫组织化学染色发现大量SC细胞存活，SC/ECM/PLA组存活细胞数量明显多于单纯SC悬液组，表明PLA无纺纤维布与ECM凝胶复合是良好的携带SC的多孔生物降解材料。
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3.3 生物基质在神经组织工程中的作用
SC与生物材料整合需要良好的ECM[12]。胶原由于具备在低温状态为液态而在37℃时形成凝胶状态的特点，其本身也是ECM成份，被应用来作携带SC的ECM，取得了一定的成果，但胶原仅是ECM的一种成份，难以满足组织工程的需要，纤维连接蛋白、层粘连蛋白等先后被应用作SC基质也不令人满意[13]。生物基质(Engelbrath Holm Swarm瘤细胞株分泌的细胞外基质成份)含有纤维连接蛋白、层粘连蛋白等多种ECM成份，且其在低温下为液态，容易将SC植入其中，加温到37℃后，自然形成凝胶，既在利于移动又不致使其向外流动，将可能是最适合周围神经组织工程的细胞生物基质材料之一[14]。我们观察到SC在ECM凝胶中，细胞生长良好，1天后开始有细胞伸出两极，形态开始展开，3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞，并开始分裂、增殖，直到14天；14天后随着凝胶的溃解，SC开始死亡、降解成碎片，当ECM凝胶溃解后，加入DMEM培养基，SC游出，贴壁生长，表明ECM凝胶能维持SC存活至少14天，当DMEM培养基存在时，SC能获得后继充足养分而生长，对体内植入后，早期的营养供给和晚期血清成分的渗透维持移植SC细胞的存活有着重要意义。
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周围神经组织工程将是以SC为核心，良好的能促进周围神经再生的生物可降解材料为支架，能维持SC存活和神经再生微环境的细胞外生物基质为复合剂，SC、生物材料和生物基质的有机整合，是周围神经组织工程的基础，只有三方面都取得重大进展，周围神经组织工程材料才能最终应用于临床，修复神经缺损，促进神经再生和功能修复。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39830100)
作者单位：王光林(华西医科大学附属第一医院骨科，成都，610041)
杨志明(华西医科大学附属第一医院骨科，成都，610041)
解慧琪(华西医科大学附属第一医院骨科，成都，610041)
王翠莹(华西医科大学校医院)
, 百拇医药 李胜富(华西医科大学附属第一医院移植免疫室)
参考文献：
[1]王光林，裴福兴，杨志明.周围神经损伤HLA-DR抗原的表达.中华手外科杂志，1996；12(9)：170
[2]王光林，裴福兴.周围神经损伤后MHC Ⅱ类抗原表达的研究进展.中国修复重建外科杂志，1996；10(1)：50
[3] 裴福兴，杨志明，黄富国.周围神经损伤后的免疫反应与神经再生.中华显微外科杂志，1995；18(2)：146
[4]Walikonis A.The development of bioartificial nerve grafts for peripheral nerve regeneration.Trends Biotechol,1998;16(4):163
, http://www.100md.com
[5]Levi AD,Burge RP.Studies of myelin formation after transplantation of human Schwann cells into the severe combined immunodeficient mouse.Exp Neurol,1994;130:41
[6]Ceballos D,Navarro X,Duney N,et al.Magnetically aligned collagen gel filling a collagen nerve guide improves peripheral nerve regeneration.Exp Neuro,1999;158:290
[7]Evans GRD,Brandt K,Widmer MS,et al.In vivo evaluation of poly(L-lactic acid)porous conduits for peripheral nerve regeneration.Biomaterials,1999;20:1 109
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[8]Kiyotani T,Teramachi M,Takimoto Y,et al.Nerve regeneration across a 25 mm gap bridged by a polyglycolic acid collagen tube,a histological and electrophysiological evaluation of regenerated nerves.Brain Res,1996;140:66
[9]Levi AD,Sonntag VKH,Dickman C,et al.The role of cultured Schwann cell grafts in the repair of gaps within the peripheral nervous system of primates.Exp Neurol,1997;143:25
[10]Kim DH,Connolly SE,Kline DG,et al.Labelled Schwann cell transplants versus sural nerve grafts in nerve repair.J Neurosurg,1994;80:254
, 百拇医药
[11]Plarts GW,Harvey AR,Chirila TV.Axonal growth within poly(2-hydroxyethyl methacrylate)sponges infiltrated with Schwann cells and implanted into the lesioned rat optic tract.Brain Res,1995;671:119
[12]Guest JD,Rao A,Olson L,et al.The ability of human Schwann cell grafts to promote regeneration in the transected nude spinal cord.Exp Neurol,1997;148:502
[13]Labrador RO,Buti M,Navarro X.Influence of collagen and laminin gels concentration on nerve regeneration after resection and tube repair.Exp Neuro,1998;149:243
[14]Tonge DA,Golding JP,Edbladh M,et al.Effects of extracellular matrix components on axonal outgrowth from peripheral nerves of adult animals in vitro.Exp Neurol,1997;146:81, 百拇医药
摘 要：目的 研究具有雪旺细胞(SC)活性的组织工程周围神经修复材料的构建方法。方法 ①采用干/湿相转化纺丝法，将分子量为730 kD的聚乳酸(PLA)制成外径为2.3 mm、内径为1.9 mm、壁厚0.4 mm、长4 cm、孔隙率为70%、孔径为20～40 μm的中空纤维管和孔径为100～200 μm、孔隙率为85%的PLA无纺纤维布。②将SC置入细胞外基质(ECM)凝胶中，观察SC在ECM凝胶中的生长。③SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布中，观察SC在PLA支架材料中的生长。④将SC、SC/ECM和SC/ECM/PLA置入PLA中空纤维管中，桥接大鼠坐骨神经长10 mm缺损，观察SC移植后存活情况。结果 ①SC在ECM凝胶中，细胞生长良好，1天后开始有细胞伸出两极，形态开始展开，3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞，并开始分裂、增殖，直到14天后随着凝胶的溃解，SC开始死亡，降解成碎片；当ECM凝胶溃解后，加入DMEM培养基，SC游出，贴壁生长。②SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布后，大部分细胞随ECM凝胶状态的形成，滞留于PLA纤维网孔中，1天后开始伸出两极，3天后可见网孔中大量双极梭形细胞，部分细胞沿着纤维生长，仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长。③SC移植术后21天，BrdU免疫组织化学染色发现大量SC细胞存活，SC/ECM组和SC/ECM/PLA组存活细胞数量明显多于单纯SC悬液组。结论 ECM凝胶能维持SC存活。PLA无纺纤维布与ECM凝胶复合是良好的携带SC的多孔生物降解材料。
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关键词：雪旺细胞 细胞外基质 中空纤维管 组织工程
近年来，随着组织工程学的兴起，提倡利用生物学和工程学原理开发能够修复、维持和改善组织功能的生物代用品，将有可能对周围神经缺损的修复探索出一条解决问题的捷径。雪旺细胞(Schwann cell,SC)是周围神经的主要结构和功能细胞，其分离、培养、分裂、增殖、标准化和保存方法目前已取得很大进展，由于其在神经再生过程中为再生轴突提供Bungner带，分泌多种神经营养物质、相关细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和神经细胞粘附分子等，在神经再生和功能恢复方面起着重要作用。因此，将SC和相应的ECM结合，与具有良好生物相容性和可渗透性、能保证SC存活、分裂、增殖和发挥其促神经再生作用的生物可降解材料复合，制成具有SC活性的组织工程周围神经修复材料，将可能对神经缺损的修复效果和功能恢复起着重要促进作用[1～4]。
1 材料与方法
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1.1 聚乳酸中空纤维管的制作
采用干/湿相转化纺丝法，将分子量为730 kD(1D=0.992u)的消旋聚乳酸(polylactic acid,PLA，由中国科学院成都分院化学所提供)、溶剂、添加剂置入挤出器中溶解，除泡后用纺丝器制成外径为2.3 mm、内径为1.9 mm、壁厚0.4 mm、长4 cm的管后，充分洗涤，去除添加剂后，制成孔隙率为70%、孔径为20～40 μm的中空纤维管(图1)，环氧乙烷消毒备用。
1.2 聚乳酸无纺纤维布的制作
将PLA溶解、旋转抽丝后采用无纺法制成PLA单层纤维布，叠加4～6层制成孔径为100～200 μm、孔隙率为85%的PLA无纺纤维布后环氧乙烷消毒备用(PLA中空纤维管和无纺纤维布均由四川大学纺织学院完成)。
1.3 雪旺细胞培养及标记
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1.3.1 雪旺细胞培养 按Brockes的方法：无菌取流产胎龄14～20周的人胎儿双侧坐骨神经置入Hank's液中，解剖显微镜下剔除外膜、剪碎后用0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶混合液消化，40～50分钟后取细胞悬液接种于预涂有多聚赖氨酸的培养瓶中37℃，5%CO2孵箱中培养30分钟后收集未贴壁细胞重新接种于塑料培养瓶中，培养24小时后更换为含有阿糖胞苷(1×10-5mol/L)的DMEM培养基，48小时后更换为常规DMEM培养基，培养24小时后再换为含有阿糖胞苷的培养基，培养24小时后再换为常规培养基，以去除成纤维细胞。8～10天细胞长满后SP法做S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定，SC纯度超过95%。
1.3.2 雪旺细胞标记 SC培养6～8天后，向培养液中加入BrdU,终末浓度为10 μmol/L，37℃，5%CO2培养箱中孵育1～2天，DMEM液清洗三次，免疫组织化学染色细胞核呈蓝色。
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1.4 雪旺细胞在细胞外基质凝胶中的生长
ECM(Sigma)和DMEM(2×)在20℃下充分混合，SC以1×105 ml加入ECM/DMEM中置入一次性塑料培养皿中，37℃，5%CO2孵箱中培养；另一组在形成凝胶6小时后加入DMEM培养基，观察SC在ECM凝胶及模拟体内血清环境中的生长情况。
1.5 雪旺细胞在聚乳酸支架材料中的生长
将PLA无纺纤维布在多聚赖氨酸溶液(10 μg/ml)中浸泡24小时，取出冻干，一组SC以1×107/ml缓慢浸入PLA纤维布，静置6小时后，加入少量DMEM培养；另一组SC以1×107/ml混入ECM/DMEM中，在20℃缓慢浸入PLA纤维布中，37℃孵育12小时后再加入DMEM，37℃，5%CO2孵箱中孵育。
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1.6 周围神经材料的预构
BrdU标记的SC制成1×108/ml ECM/DMEM悬液，一组缓慢浸入PLA纤维布中，37℃，5%CO2孵箱中孵育12小时，充分整合后置入PLA中空纤维管中；另一组直接注入PLA中空纤维管中，用8%琼脂糖封口，置入DMEM培养瓶中，37℃，5%CO2孵箱中孵育24小时，使其充分整合。
1.7 周围神经材料的体内植入
取Wistar大白鼠15只，体重(250±20) g，3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后显露一侧坐骨神经，造成长10 mm缺损，10只分别用上述两种材料桥接，另外5只用中空纤维管桥接后注入1×108/ml SC细胞悬液作为对照组。3周后取材，10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、BrdU免疫组织化学染色，观察细胞存活情况。
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1.8 统计学方法
所有数据均采用SPSS/PC进行统计分析。
2 结果
2.1 雪旺细胞在细胞外基质凝胶中的生长
SC在ECM中形成凝胶后，1小时后呈圆形，周围一圈透亮带，1天后开始有细胞伸出两极，形态开始展开，3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞，并开始分裂、增殖，直到14天细胞生长良好，14天后随着凝胶的溃解，SC开始死亡、降解成碎片(图2)。在加入DMEM组中，SC在14天前同EMC凝胶中生长规律大致相同，只是当ECM凝胶溃解后SC游出，贴壁生长。
2.2 雪旺细胞在聚乳酸纤维布上的生长
SC悬液直接浸入PLA无纺纤维布中后，大部分细胞渗漏到培养瓶中，在瓶底贴壁生长，仅少数细胞能贴附在PLA纤维上，伸展形成双极状。
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SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布后，大部分细胞随ECM凝胶状态的形成，滞留于PLA纤维网孔中，1天后开始伸出两极，3天后可见网孔中大量双极梭形细胞，同普通培养瓶中SC形态完全一致，部分细胞沿着纤维生长，仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长(图3)。
2.3 雪旺细胞移植后存活情况
SC移植术后21天，BrdU免疫组织化学染色发现三个组均有大量细胞存活，细胞分布不均匀，部分区域聚集成团，部分区域较稀疏(图4)，SC/ECM组和SC/ECM/PLA组细胞存活数量无明显区别，而单纯SC悬液组存活细胞数量明显少于SC/ECM和SC/ECM/PLA组，SC悬液组平均每高倍视野SC数量为(180±150)个，SC/ECM组为(480±260)个，SC/ECM/PLA组为(440±230)个，经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。
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图1 PLA中空纤维神经再生引导管 图2 雪旺细胞在ECM凝胶中的三维生长( ×100) 图3 雪旺细胞在PLA纤维布上的生长，部分细胞贴附在纤维上( ×100) 图4 雪旺细胞移植后3周，大量细胞存活(免疫组织化学染色 ×100)
Fig. 1 PLA hollow fiber conduit for guiding peripheral nerve regeneration Fig. 2 SC were grown in three dimensional ECM gels( × 100) Fig. 3 SC were grown in PLA fiber net, part of cells were adhered on fibers( × 100) Fig. 4 Many SC cells were survived at 3 weeks after transplantation(Immunohistochemical stain ×100)
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SC是周围神经组织工程的核心，SC的分离、培养、纯化、传代及永生化均已取得可喜成就，但神经组织工程材料需要的细胞的数量非常巨大，SC移植要产生效果，细胞浓度量需在1×108/ml以上[5]。SC传代以后形态和功能逐渐改变，不再适合组织工程的要求，解决问题的方法是培养永生化SC系，使其分裂、增殖获得大量的细胞，Gansmmller的研究已取得初步成果，培养出 MSC 80永生化SC系。正常SC移植后产生的神经营养物质非常有限，神经组织工程应该利用基因工程技术，将神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等神经营养物质的基因 转染入永生化的SC，对其基因进行修饰，纯化后培养能分泌上述神经营养因子的细胞，将对神经组织工程的发展起推动作用。采用有效的方法对培养出的SC进行保存，并能进一步减轻其抗原性也是目前急需解决的问题。此外，如能应用分子生物学技术增加端粒酶活性，延长SC DNA端粒，增加SC存活时间对神经组织工程也同样意义重大。
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3.1 生物材料雪旺细胞对神经再生起促进作用
随着材料科学的发展，多种具有良好生物相容性的材料相继出现，高分子材料既具有良好的生物相容性又可降解吸收，并且有些材料对神经再生有促进作用，因此，应用生物材料复合SC移植对神经再生可能具有显著的促进作用[6、7]。Malinon应用可吸收的聚羟基乙酸修复15例患者指神经0.5～3.0 cm的缺损，术后平均随访22.4个月，发现感觉功能恢复良好，33%的患者动态两点辨别觉恢复到3～7 mm，53%的患者恢复到7～15 mm，只有27%的患者恢复较差，与经典的自体神经移植疗效相当，但却避免了自体神经移植供区感觉缺损。Kiyotani等[8]应用干湿相旋转仿丝法将聚羟聚乙酸制成中空纤维管将胶原高温交链于其表面制成可浸透的中空纤维管，修复猫长25 mm的神经缺损，术后5个月组织学和神经元生理检测均表明聚羟基乙酸/胶原管是周围神经良好的修复材料。
Abiseber应用聚丙烯/聚丙烯氰共聚物采用干湿相旋转纺丝法制成可渗透性中空纤维管后，修复周围神经缺损，发现该神经修复材料有良好的促神经再生作用。Levi等[9]发现聚丙烯/聚丙烯氰中空纤维管复合体外培养的SC(120×108/ml)修复猴肌皮神经长15 mm缺损，3个月后组织学检测发现SC移植组较自体神经移植组稍差，但明显优于血管组， 肱桡肌的动作电位检测SC移植组和自体神经移植组相当，中空管组未检测到动作电位，表明SC移植对神经再生确实具有促进作用。Kim等[10]发现，将体外培养的鼠坐骨神经SC混入Ⅰ型胶原制成SC-胶原凝胶后置入胶原管中修复坐骨神经长10 mm的缺损，术后3个月神经动作电位和神经传导速度检测，发现SC移植优于自体神经移植组，并且髓鞘厚度两者相当。
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3.2 多孔生物材料复合雪旺细胞在神经再生中的作用
Plarts等[11]应用聚甲基丙烯酸羟乙酯制成孔隙率为75%，孔径约为10 μm以上的多孔材料后，将SC种植于该材料中，修复鼠视神经缺损，术后3个月发现有大量再生轴突长入SC移植体，顺行示踪法发现再生轴突可生长到700～900 μm长，而没有SC的聚甲基丙烯酸羟乙酯多孔材料中再生轴突较少，有少量少突胶质细胞移行于移植体中，表明用多孔材料携带SC对神经再生有促进作用。将SC移植到多孔材料中，复合入可渗透性中空纤维管中，避免瘢痕长入，修复周围神经缺损，将更有利于神经再生和有髓神经纤维形成以及功能恢复。我们的研究将SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布后 ，大部分细胞在ECM凝胶状态的形成，滞留于PLA纤维网孔中，部分细胞贴附在PLA纤维丝上，并沿着纤维生长，仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长。SC制成1×108/ml ECM/DMEM悬液，缓慢浸入PLA纤维布中，孵箱中孵育12小时，充分整合后置入PLA中空纤维管中，桥接大鼠坐骨神经长10 mm缺损，SC移植术后21天，BrdU免疫组织化学染色发现大量SC细胞存活，SC/ECM/PLA组存活细胞数量明显多于单纯SC悬液组，表明PLA无纺纤维布与ECM凝胶复合是良好的携带SC的多孔生物降解材料。
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3.3 生物基质在神经组织工程中的作用
SC与生物材料整合需要良好的ECM[12]。胶原由于具备在低温状态为液态而在37℃时形成凝胶状态的特点，其本身也是ECM成份，被应用来作携带SC的ECM，取得了一定的成果，但胶原仅是ECM的一种成份，难以满足组织工程的需要，纤维连接蛋白、层粘连蛋白等先后被应用作SC基质也不令人满意[13]。生物基质(Engelbrath Holm Swarm瘤细胞株分泌的细胞外基质成份)含有纤维连接蛋白、层粘连蛋白等多种ECM成份，且其在低温下为液态，容易将SC植入其中，加温到37℃后，自然形成凝胶，既在利于移动又不致使其向外流动，将可能是最适合周围神经组织工程的细胞生物基质材料之一[14]。我们观察到SC在ECM凝胶中，细胞生长良好，1天后开始有细胞伸出两极，形态开始展开，3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞，并开始分裂、增殖，直到14天；14天后随着凝胶的溃解，SC开始死亡、降解成碎片，当ECM凝胶溃解后，加入DMEM培养基，SC游出，贴壁生长，表明ECM凝胶能维持SC存活至少14天，当DMEM培养基存在时，SC能获得后继充足养分而生长，对体内植入后，早期的营养供给和晚期血清成分的渗透维持移植SC细胞的存活有着重要意义。
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周围神经组织工程将是以SC为核心，良好的能促进周围神经再生的生物可降解材料为支架，能维持SC存活和神经再生微环境的细胞外生物基质为复合剂，SC、生物材料和生物基质的有机整合，是周围神经组织工程的基础，只有三方面都取得重大进展，周围神经组织工程材料才能最终应用于临床，修复神经缺损，促进神经再生和功能修复。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39830100)
作者单位：王光林(华西医科大学附属第一医院骨科，成都，610041)
杨志明(华西医科大学附属第一医院骨科，成都，610041)
解慧琪(华西医科大学附属第一医院骨科，成都，610041)
王翠莹(华西医科大学校医院)
, 百拇医药 李胜富(华西医科大学附属第一医院移植免疫室)
参考文献：
[1]王光林，裴福兴，杨志明.周围神经损伤HLA-DR抗原的表达.中华手外科杂志，1996；12(9)：170
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[3] 裴福兴，杨志明，黄富国.周围神经损伤后的免疫反应与神经再生.中华显微外科杂志，1995；18(2)：146
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[5]Levi AD,Burge RP.Studies of myelin formation after transplantation of human Schwann cells into the severe combined immunodeficient mouse.Exp Neurol,1994;130:41
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[10]Kim DH,Connolly SE,Kline DG,et al.Labelled Schwann cell transplants versus sural nerve grafts in nerve repair.J Neurosurg,1994;80:254
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